Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Induktion der Hepatozytenablation im Zebrafisch zur Analyse der gallengesteuerten Leberregeneration. Dies wird erreicht, indem transgene Larven, die Nitroreduktase in ihren Hepatozyten exprimieren, zunächst Metrona oder MTZ ausgesetzt werden. Im zweiten Schritt wird das Ausmaß der Hepatozytenablation anhand der relativen Größe der Leber beurteilt.

Nach der MTZ-Behandlung werden im letzten Schritt Bully-ablierte Larven mit einer winzigen Leber gesammelt, schließlich werden die Größe der Leber und die Expression von Lebermarkern in der regenerierenden Leber mittels Epi-Fluoreszenz bzw. konfokaler Mikroskopie gemessen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Aktivierung ovaler Nagetierzellen besteht darin, dass bei dieser Technik die regenerativen Hepatozyten hauptsächlich aus Gallenepithelzellen gewonnen werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Leberregeneration zu beantworten, z. B. wie Gallen- oder Leberprogenatorzellen zur Leberregeneration beitragen Im Allgemeinen werden Einzelpersonen bis Neulinge mit dieser Methode Schwierigkeiten haben, da die Lebergröße im Blei- und degenerierenden Labor variabel ist.

Um zeitgesteuerte Paarungen durchzuführen, setzen Sie erwachsene männliche und weibliche halbzygote oder homozygote Fische über Nacht mit einer Trennwand zwischen ihnen auf. Entfernen Sie die Trennwand am nächsten Morgen, wenn eine Paarung gewünscht ist, verwenden Sie ein feines Plastiksieb, um die Embryonen zu entnehmen, drehen Sie das Sieb auf den Kopf und spülen Sie die Netzoberfläche mit einer Quetschflasche mit einem feinen Strahl Eiwasser ab. Übertragen Sie dann bis zu 100 Embryonen in eine 100-Millimeter-Petrischale, die 25 Milliliter Eiwasser enthält, und stellen Sie die Schale auf 28 Grad Celsius, um die Pigmentierung zu hemmen.

Fügen Sie der Kultur bis zu 10 Stunden PTU hinzu. Nach der Befruchtung nach 80 Stunden. Nach der Personalisierung werden die Larven mit Trica betäubt und mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop die CFP-positiven Larven gesammelt, wobei nur die Tiere mit ähnlich großen Lebern aufbewahrt werden.

Ersetzen Sie dann das Trica-Eiwasser durch frisches Eiwasser, das mit PTU ergänzt ist, und geben Sie die CFP-positiven Zebrafischlarven wieder in den 28 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Um die Zebrafischlarven zunächst mit MTZ zu behandeln, teilen Sie die entsprechende Anzahl an Larven auf zwei verschiedene Kulturgefäße auf. Halten Sie die Versuchslarvengruppe in einer Lösung aus frisch zubereiteter MTZ und die Kontrollgruppe in Eiwasser.

Ergänzt mit DMSO. Decken Sie die Versuchsgruppe mit Alufolie ab, um eine Photoinaktivierung der MTZ zu verhindern, und inkubieren Sie beide Gruppen von Zebrafischlarven am Ende der Ablationsperiode bei 28 Grad Celsius. Nehmen Sie die MTZ-Lösung von den Platten und waschen Sie die mit MTZ behandelten Larven zwei- bis dreimal mit 25 Millilitern Eiwasser und schwenken Sie das Eiwasser nach jedem Waschen weg.

Nach der letzten Wäsche immobilisieren Sie die Larven mit der Hälfte der zuvor verwendeten Trica-Konzentration, um Herzödeme und Tod bei den mit MTZ behandelten Larven zu vermeiden. Verwenden Sie dann den CFP-Filter an einem Epi-Fluoreszenzmikroskop, um die Hepatozytenablationswerte basierend auf der relativen Lebergröße der mit MTZ behandelten Larven zu beurteilen. Betrachten Sie den Zebrafisch mit großen Lebern, der null bis 5 % der Larven ausmacht, als nicht abliert.

Diejenigen mit mittelgroßen Lebern, die 10 bis 20 % der Larven ausmachen, die teilweise abgetragen werden sollen, und solche mit sehr kleinen Lebern, die 80 bis 90 % der Larven ausmachen, die vollständig abgetragen werden sollen. Nachdem Sie alle Tiere klassifiziert haben, entdecken Sie die Larven mit nicht oder teilweise abgetragener Leber und behalten Sie nur die Zebrafische mit winzigen Lebern, was auf eine schwere Hepatozytenablation für die Leberanalyse hinweist. Zum Zeitpunkt der Regeneration null Stunde werden die Larven in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Unmittelbar nach dem Auswaschen der MTZ und der CFP-Beschaffung das Eiwasser durch 3%igen Formaldehyd-MPEM-Puffer ersetzen, um eine Fixierung über Nacht auf einem Rotor von vier Grad Celsius zu erreichen. Ersetzen Sie am nächsten Morgen die Fixierlösung durch einen Milliliter P-B-S-D-T und drehen Sie die Larven weitere fünf Minuten lang. Anschließend werden alle fixierten Larven unter einem Präpariermikroskop in eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem P-B-S-D-T gegeben und mit einer Pinzette das Eigelb und die Brustflossen manuell entfernt, wenn alle Larven abgeschnitten sind.

Bis zu 20 Tiere werden in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und das P-B-S-D-T durch einen Milliliter Blockierlösung ersetzt. Nach zwei Stunden auf dem Rotator bei Raumtemperatur wird die Blockierungslösung durch 100 Mikroliter des primären Antikörpercocktails ersetzt, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius durchzuführen. Entfernen Sie beim Schaukeln am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung und waschen Sie den Zebrafisch mit P-B-S-D-T für fünf 10-minütige Wäschen.

Nach der letzten Wäsche werden 100 Mikroliter des Sekundärantikörpers für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur unter Schaukeln hinzugefügt. Zum Schluss waschen Sie die Larven fünfmal in P-B-S-D-T, wie gerade gezeigt. Richten Sie die Larven seitlich auf einem Objektträger aus und fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium hinzu.

Decken Sie dann jeden Zebrafisch vorsichtig mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Die MTZ-Behandlung für 36 Stunden von 3,5 bis fünf Tagen nach der Befruchtung reduziert die Lebergröße drastisch. Nach dem MTZ-Washout tritt innerhalb von 30 Stunden wieder eine starke CFP- und Rotexpression auf, was durch die Expression von LCAM in der Membran der Gallenepithelzellen beurteilt wird.

Das intrahepatische Gallennetz kollabiert zunächst, wird dann aber 54 Stunden nach der Auswaschung wiederhergestellt, was auf eine schnelle Regeneration und Genesung der Leber hinweist. In diesen Bildern sind regenerierende Hepatozyten, transgen für ein nukleares, rot fluoreszierendes Protein, das ausschließlich in den Gallenepithelzellen der Leber exprimiert wird, dargestellt, die meisten dieser H-, zwei BM-Kirsch-positiven Zellen in der regenerierenden Leber exprimieren HNF vier alpha zur Regenerationsstunde null zur Regenerationsstunde vier C acht. Die mit MTZ behandelten CFP-positiven Hepatozyten behalten immer noch ihre H zwei BM-Kirschexpression, was auf die Umwandlung der Gallenepithelzellen in Hepatozyten bei starkem Hepatozytenverlust hinweist.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass nach der MTT-Behandlung für die anschließende Leberregeneration auf Lyse nach ihrer Entwicklung vollständig abgetragene ausgewählt wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Leberregeneration, um die Mechanismen zu erforschen, die den Lebervorläufern, der zellgesteuerten Leberregeneration, zugrunde liegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses geographische zytenspezifische Operationsmodell für biliogetriebene Leberdegenerationsstudien verwenden können.