Dichtegradientenzentrifugation: Eine Methode zur Isolierung von CLL-Zellen aus peripherem Blut

- Bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) nehmen die B-Zell-Lymphozyten im Knochenmark und im Blut signifikant zu. Um diese CLL-Zellen aus einer Blutprobe zu isolieren, behandeln Sie die Probe zunächst mit einem humanen B-Zell-Anreicherungscocktail, der B-Zellen durch Negativselektion trennt. Die Antikörper im Cocktail erkennen und vernetzen spezifisch die Antigene, die von Nicht-B-Zellen und Erythrozyten exprimiert werden, und bilden dichte Komplexe.

Als nächstes schichten Sie die Probe über ein Dichtegradientenmedium mit einer für die Lymphozytenisolierung optimalen Dichte. Bei der anschließenden Zentrifugation trennen sich die verschiedenen Blutbestandteile aufgrund von Schwankungen in ihrer Dichte relativ zum Gradientenmedium. Die RBC-Nicht-B-Zell-Komplexe mit höherer Dichte setzen sich durch das Medium ab und bilden ein Pellet. Die am wenigsten dichte Plasmafraktion bildet die oberste Schicht. Die weniger dichten CLL-Zellen bilden eine weiße Schicht an der Grenzfläche zwischen Plasma-Dichte und Medium.

Übertragen Sie die weiße Schicht vorsichtig in eine frische Tube. Zentrifugieren Sie erneut, um ein Pellet mit gereinigten CLL-Zellen zu erhalten. Im folgenden Protokoll zeigen wir die Isolierung von chronischen lymphatischen Leukämiezellen aus Blutproben von Patienten.

- Entnahme von peripheren Blutproben von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie in EDTA-Blutentnahmeröhrchen, begleitet von der Anzahl der weißen Blutkörperchen.

- Menschliche Blutproben sollten als gefährlich angesehen werden, da sie möglicherweise durch Blut übertragbare Viren enthalten. Bitte stellen Sie sicher, dass diese Proben in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II gehandhabt werden und dass der Benutzer jederzeit einen Laborkittel und Handschuhe trägt. Entsorgen Sie blutkontaminierte Materialien und desinfizieren Sie diese.

- Wenn die Anzahl der weißen Blutkörperchen gleich oder größer als 40 Millionen Zellen pro Milliliter ist, verdünnen Sie die Probe im Verhältnis 1 zu 1 mit RT CLL-Waschpuffer. Aliquotieren Sie dann das RT-Dichtegradientenmedium in ein konisches Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe für die Probe. Die Probe wird vorsichtig auf das Medium aufgetragen und 30 Minuten lang bei RT bei 400-fachem G zentrifugiert.

Entnehmen Sie mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff vorsichtig die weiße Schicht der mononukleären Zellen, die sich an der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem CLL-Waschpuffer angesammelt haben. Übertragen Sie diese isolierte Monoschicht in ein frisches konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie dieser Monoschicht 40 Milliliter CLL-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-fachem G.

Entsorgen Sie den Überstand, schnippen Sie mit dem Boden des Rohrs, um das Pellet wieder aufzuhängen, und wiederholen Sie diese Wäsche. Entsorgen Sie den Überstand, schnippen Sie erneut mit dem Boden des Rohrs und suspendieren Sie das Zellpellet dann wieder in einem festgelegten Volumen CLL-Waschpuffer, abhängig von der Größe des Pellets. Nach dem Zählen der Zellen und der Durchflusszytometrie zur Überprüfung der Zellreinheit werden die Zellen in Gewebekulturplatten mit der erforderlichen Zelldichte gelegt, die für die Stimulation oder medikamentöse Behandlung bereit sind.