Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

Die Symptome der Parkinson-Krankheit, einschließlich motorischer und sprachlicher Dysfunktion, resultieren aus einer verminderten Aktivität von Dopamin-sezernierenden Zellen im Gehirn. Das enterische Nervensystem und der Riechkolben sind die am stärksten exponierten Nervenstrukturen und die ersten, die betroffen sind. Die Parkinson-Krankheit wurde mit der Exposition gegenüber Pestiziden in Verbindung gebracht.

Um die Auswirkungen von Pestiziden auf das enterische Nervensystem zu analysieren, wird das Pestizid Roone Mäusen durch eine orale Sonde verabreicht. Die Mäuse werden dann intrakardial mit 4%Paraform, Aldehyd-Gehirn und enterischem Nervensystem perfundiert. Gewebe wird extrahiert, vorbereitet und immungefärbt für die PD-assoziierten Proteine.

Beta-3-Tubulin- und Alpha-Synuclein-Bilder, die durch konfokale Mikroskopie aufgenommen wurden, zeigen die Akkumulation von Alpha-Synuclein in Neuronen des enterischen Nervensystems bei Tieren, die Pestiziden ausgesetzt waren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der systemischen Verabreichung von Rotenon besteht darin, dass mit dieser Technik sichergestellt wird, dass die Wirkung von Rotenon auf das enterische Nervensystem beschränkt ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bei der Parkinson-Krankheit zu beantworten, wie z. B. ihre Ätiologie und die Mechanismen, die ihrem Fortschreiten zugrunde liegen.

Die Implikationen dieser Technik erweitern die Turmtherapie und die Diagnose der Parkinson-Krankheit, da sie die Entwicklung neuer therapeutischer Ziele und diagnostischer Methoden ermöglichen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung der Wirkung anderer Umweltgifte auf das enterische, sympathische und parasympathische Nervensystem sowie die Darmwand. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesen Methoden noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es eine Weile dauert, bis sie die Sonde beherrschen.

Auf die Idee zu diesen Methoden kam mir, als ich von dem Zusammenhang zwischen Pestiziden und der Parkinson-Krankheit las. Es war auch hilfreich, die Konferenz mit hohen CORAs auf dem Welt-Parkinson-Kongress in Berlin im Jahr 2005 zu sehen. Die friedliche Demonstration dieser Methode ist notwendig.

Die Methode, OL mit der Sonde zu verabreichen, ist schwierig, da Mäuse eine andere Anatomie haben als Menschen. Auf der anderen Seite wurde die Bildanalyse mit angepassten Schritten für diese Bilder durchgeführt. Beginnen Sie das Protokoll mit dem Wiegen des Tieres. Berechnen Sie das entsprechende Volumen an Rotenon.

Pro Gramm des Tiergewichts werden 0,01 Milliliter benötigt, was einer Dosis von fünf Milligramm pro Kilogramm Roone entspricht. Füllen Sie eine Spritze von einem Milliliter mit der Roone-Lösung und dann eine zweite Spritze mit Vehikellösung. Heben Sie die Maus auf und halten Sie den Schwanz der Maus mit einer Hand fest.

Dehnen Sie die Haut des Halses, indem Sie mit den ersten beiden Fingern der anderen Hand daran ziehen. Sobald der Kopf zwischen den beiden Fingern fixiert ist, lehnen Sie ihn gegen die Handfläche und drehen Sie ihn auf den Kopf. Fixiere den Schwanz.

Mit dem vierten und fünften Finger, den Kopf nach hinten gerichtet, drücke den Gaumen, um den Mund der Maus zu öffnen. Führen Sie die Sonde vorsichtig in den Mund ein. Bewegen Sie die Sonde langsam in Richtung Magen, bis sie in voller Länge eingeführt ist.

Um zu vermeiden, dass Material in die Lunge gelangt, verabreichen Sie die Roone-Lösung oder das Vehikel, indem Sie leicht auf die Embolie drücken. Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie die Sonde langsam heraus und setzen Sie das Tier wieder in einen anderen Käfig, bis alle Tiere aus einem Käfig fertig sind. Nach der Behandlung werden die Mäuse intrakardial mit 4%Paraformaldehyd überschwemmt.

Bei PBS werden die Eingeweide dann durch Dissektion entnommen und über Nacht in 15%ige Saccharose gelegt. Am nächsten Tag wird das Gewebe auf 30%Saccharose umgefüllt und über Nacht bei vier Grad Celsius erneut inkubiert. Das Gewebe wird dann in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius gelegt und bis zur Verwendung mit einem Kryostaten 20 Mikron Darm gelagert.

Die Querschnitte werden auf Rost-Objektträger, Blockierungs- und Immunfärbeverfahren übertragen. Mit Anti-Beta werden dann drei Tubulin- und Antifa-Synuclein-Antikörper durchgeführt. Es wird empfohlen, dass eine externe Person eine Blindanalyse der Daten durchführt.

Um die Analyse zu starten, öffnen Sie die Fiji-Software. Öffnen Sie die konfokale Bilddatei. Teilen Sie dann die Kanäle so auf, dass jeder Kanal so gut wie möglich unabhängig voneinander bearbeitet werden kann.

Schließen Sie die Kanäle, die nicht verwendet werden, und wählen Sie die Pixelgröße aus, analysieren, einstellen, skalieren und stellen Sie sie auf eins ein. Stellen Sie die bekannte Entfernung auf 0,13 ein und klicken Sie auf global. Die Größe des Bildes wird nun in Mikrometern angezeigt.

Wählen Sie den Alpha-Synuclein-Kanal und wählen Sie das Ganglion. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl das Ganglion in allen Segmenten umschließt. Duplizieren Sie das Bild mit ausgewähltem Ganglion, nur ein Bild in der Größe des Ganglions wird dupliziert.

Drücken Sie auf "Bearbeiten", um außerhalb des ausgewählten Bereichs des Bildes schwarz zu werden. Duplizieren Sie das Bild erneut, um festzustellen, wie gut der Vorgang verlaufen ist. Bilder, die ein geringes Verhältnis von Signal zu Hintergrundrauschen aufweisen, sollten nicht für die Bildanalyse verwendet werden.

Wählen Sie den Schwellenwert für die Bildanpassung aus. Wählen Sie dann maximale Entropie. Bewegen Sie sich dann über die Segmente im zugeschnittenen Bild und das Original, um sicherzustellen, dass der Vorgang gut verlaufen ist.

Der tropische Schwellenwert wählt einen Intensitätssignalpegel basierend auf dem Bildhistogramm aus, und nur die Pixel mit Intensitäten, die über diesem Schwellenwert liegen, werden in einem Bildauswahlprozess von Weiß über Schwarz angezeigt. Klicken Sie dann auf Glätten. In diesem Schritt werden die pixeligen Kanten der Bilder in einen Auswahlprozess mit glatten Kanten umgewandelt.

Klicken Sie dann auf binär und wählen Sie Make binary. Das Bild wird als Schwarz-über-Weiß-Bild angezeigt, um den nächsten Schritt auf dem duplizierten Bild auszuführen, klicken Sie auf Analysieren, Partikel analysieren. Wählen Sie dann Gliederungen anzeigen und klicken Sie auf Zusammenfassen.

Der Rest der Einstellung sollte auf der Standardeinstellung belassen werden. Diese Funktion erkennt die Gesamtzahl der Pixel mit einem Signal und die Gesamtzahl der Pixel mit Signal, die zusammen gruppiert sind. Außerdem werden die Anzahl der Pixelgruppen und die mittlere Größe angegeben.

Vergleichen Sie und wählen Sie das Segment mit der größten Gesamtfläche aus, das sich gut anpassen lässt. Das Segment wird markiert. Kopieren Sie die Datentabelle mit der gesamten Alpha-Synuclein-Oberfläche, der Anzahl der Einschlüsse und der mittleren Partikelgröße.

Fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle ein oder schreiben Sie sie an einer anderen Stelle mit Anmerkungen. Rückkehr nach Fidschi. Suchen Sie die zuvor ausgewählte Scheibe im Beta-Tubulin-Kanal und wählen Sie sie aus.

Wählen Sie den Ganglienbereich aus und klicken Sie auf Analysieren. Wählen Sie dann Messen aus. Es erscheint eine weitere Tabelle, die die Gesamtoberfläche des Ganglions zeigt.

Extrahieren Sie die Daten aus der Tabelle in eine Excel-Tabelle in der Nähe der Alpha-Synuclein-Messung oder kopieren Sie sie mit Excel an eine andere Stelle. Dividieren Sie die verschiedenen Parameter, die bei der Alpha-Synuclein-Messung erhalten wurden, durch die Ganglienoberfläche, um die Gesamt-Alpha-Synuclein-Oberfläche und die Einschlusszahl zu erhalten, die durch die Gangliengröße normiert ist, um die Auswirkungen von Roone zu analysieren, das lokal auf das enterische Nervensystem wirkt, fünf Milligramm pro Kilogramm des bekannten Pestizids wurden durch orale Sonde an 1 Jahr alte C 57 schwarze sechs Mäuse verabreicht. Das hier gezeigte Chromatogramm zeigt das Vorhandensein eines bekannten Rotan-Peaks eine Stunde nach der Verabreichung bei Mäusen, die mit 20 Milligramm pro Kilogramm Rotenon, 10 und fünf Milligramm pro Kilogramm Rotenon behandelt wurden.

Rotenonspiegel wurden für Blut-, Hirn- und Hirnstammextraktionen mittels HPLC bestimmt, wie hier gezeigt. Die Verabreichung von fünf Milligramm pro Kilogramm verrotteter Gefäße durch orale Sonde führt nicht zu messbaren Werten im Blut ein, zwei oder drei Stunden nach der Behandlung, wie von H plc bestimmt. Diese Grafik zeigt den Fäulnisgrad im Gehirn und Hirnstamm der behandelten Mäuse.

Eine Stunde nach der Extraktion zeigt die Verabreichung von 10 Milligramm pro Kilogramm oder weniger Rotenon keine Roton-Spiegel in Gehirn- oder Hirnstammproben. Eine Stunde nach der Verabreichung des mitochondrialen Komplexes wurde eine Aktivität in Muskel- und Gehirnproben von 1,5 Monate behandelten Mäusen bewertet. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, die keine Hemmung des mitochondrialen Komplexes eins zeigten, was bestätigt, dass es in diesen Regionen kein rone gab.

Die Analyse der Parkinson-Krankheit, der Lewy-Körper-Komponente alpha-Synuclein nach Verabreichung von ron, ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Gesamtoberflächenmenge von alpha-Synuclein, des Vorhandenseins von alpha-Synuclein-Einschlüssen und des alpha-Synuclein-Musters in der Zelle. Diese Abbildung zeigt die Anti-Beta-Drei-Tubulin-, Alpha-Synuclein- und DAPI-Färbung in Duodenum- und Ileumschnitten, wie hier zu sehen ist. Die 1,5-monatige Behandlung mit bekannter Kakerlake induzierte ein erhöhtes Alpha-Synuclein-Punktmuster in den Ganglien des enterischen Nervensystems, sogar eine im Vergleich zu drei Monaten Kontrollen.

Dieses Muster ist sowohl im Ileum als auch im Duodenum zu sehen. Nach dreimonatiger Behandlung ist die Bildung größerer Alpha-Synuclein-Einschlüsse zu sehen. Die Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-Alpha-Synuclein, Theof, Flavin und DPI zeigt eine Aggregation größerer Alpha-Synuclein-Akkumulationen erst nach drei Monaten. Dieses Experiment wurde mit Hilfe von Methoden der automatischen Segmentierung und entropiebasierten Schwellenwerte analysiert.

In der Grafik auf der linken Seite stellt jede Spalte die gesamte Alpha-Synuclein-Oberfläche zur Ganglienoberfläche dar. In der Grafik auf der rechten Seite stellt jede Spalte die Gesamtzahl der Alpha-Synuclein-Einschlüsse pro entnommener Ganglienoberfläche dar. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die lokale Verabreichung von Rotenon die Phosphorylierung, Akkumulation und Aggregation von Alpha-Synuclein mit Gliose in den Ganglien des enterischen Nervensystems induziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei korrekter Durchführung in einer Minute pro Tier durchgeführt werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sonde vorsichtig einzuführen, und wenn Hindernisse gefunden werden, ist es besser, sie herauszunehmen und nach diesen Verfahren erneut einzuführen. Andere Methoden wie HPLC, Immunfärbung und Bildanalyse können durchgeführt werden. Dies wird es ermöglichen, andere Regionen, die Wirkungen der Substanz oder sogar das Vorhandensein der Substanz im Blut nach ihrer Entwicklung zu analysieren.

Diese Technik ebnete den Weg für Neurowissenschaftler, die Auswirkungen von Umweltneurotoxinen auf das enterische Nervensystem zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, das Messgerät richtig anzuwenden und die Bilder zu analysieren, die aus der Immunchemie stammen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit faulen Stoffen äußerst gefährlich sein kann.

Daher empfehlen wir die Verwendung von Handschuhen und Masken während der Durchführung dieses Verfahrens. Das.