Name: Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die stereotaktische Injektion eines rekombinanten AAV-Vektors zur Entwicklung eines Rattenmodells für die Parkinson-Krankheit. Diese Methode ermöglicht gezielte Genexpression in der Substantia nigra für präklinische Studien.

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Die Autoren danken Joris Van Asselberghs und Ann Van Santvoort für ihre hervorragende technische Hilfe. Forschung wurde von der IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), der FWO Vlaanderen (G.0768.10), von der EG-FP6 Programm &quot;DiMI &#39;(LSHB-CT-2005-512146), das RP7 FTE-Projekt MEFOPA (Health finanziert -2.009-241.791), das RP7-Programm &quot;inMind&quot; (HEALTH-F2-2011-278850), die KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), und die MJFox Foundation (Targetvalidierung 2010). A. Van der Perren und C. Casteels sind ein Postdoc-Stipendiaten des Flämischen Fonds für wissenschaftliche Forschung. K. Van Laere ist ein leitender klinischer Fellow des Flämischen Fonds für wissenschaftliche Forschung.

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) und genehmigt durch das Bioethical Komitee der Universität Leuven (Belgien) durchgeführt. 1. Rekombinante AAV Herstellung und Reinigung Hinweis: rAAV - Vektor Produktion und Reinigung wurde durchgeführt von der Leuven viraler Vektor Core (LVVC) , wie zuvor 17 beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, transfizieren subkonfluenten niedrig (&lt;50) Passage anhaftenden HEK 293T-Zellen ein 25 kD Lineares Polyethylenimin 150 nM NaCl Transfektionslösung und drei verschiedene Plasmide in einem Verhältnis von 1: 1: 1 in DMEM-Medium, 2% fötales Rinderserum. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO 2, ersetzen Sie das Medium durch frisches DMEM - Medium 2% fötales Rinderserum. Hinweis: Die Plasmide, die die Konstrukte für die AAV7 Serotyp enthalten, verbesserte das AAV-Transfer-Plasmid die menschliche A53T Mutante α-SYN unter der Kontrolle des CMVie kodieren synapsin1 - Promotor und der pAdvDeltaF6 adenoviralen Helferplasmid 17. </li><li> Ernten Sie das Medium 5 Tage nach der transienten Transfektion und konzentrieren sich mit Tangentialstromfiltration 17. </li><li> Reinige die rAAV - Vektorpartikel aus dem konzentrierten Medium eine Iodixanol Stufengradienten mit 17. </li><li> Verwenden von Standardtechniken der Echtzeit-PCR für die genomische Kopie (GC) Bestimmung. In diesem Protokoll wurde ein Vektor - Titer von 3,0 E11 GC / ml verwendet , um ein α-SYN basierend Rattenmodell für 17 PD zu entwickeln. </li></ol> 2. Stereotactic Injektion von rAAV α-SYN Vektor in der SN der Ratte (Figur 2) <ol><li> Haus acht Wochen alt weiblichen Wistar-Ratten, die etwa 200 bis 250 g unter einem normalen 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu pelle Nahrung und Leitungswasser mit einem Gewicht. </li><li> Werfen die Ratte intraperitoneal (ip) Narkose eine Mischung von Ketamin enthält (60 mg / kg) und Medetomidin (0,4 mg / kg). Sobald die Ratte betäubt und nicht reagiertwenn die verschiedenen Pfoten quetschen, zu verwalten für die weitere Anerkennung einen Mikrotransponder subkutan der Ratte auf der Rückseite einen Mikrotransponder implanter verwenden. Prüfen, ob der Mikrotransponder richtig positioniert ist und durch das Lesegerät ausgelesen werden. </li><li> Schneiden Sie die Haare auf der Oberseite der Kopfhaut. Tragen Sie eine lokale Betäubung sowohl auf der Kopfhaut und den Ohren. Führen Sie den Rest des chirurgischen Eingriffs unter einer laminaren Strömung unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Legen Sie die Ratten in einem stereotaktischen Kopfrahmen mit zwei Ohr Bars, einen Mund und eine Nase bar. Bedecken Sie den Körper der Ratte mit einem Papiertuch einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Anwenden eines okularen Gleitmittel, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit jodium 1% in Isopropanol 70% und machen einen kleinen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut. Kratzen Sie vorsichtig die Membranen auf dem Schädel entfernt und Spülen mit Kochsalzlösung. Lassen Sie den Schädel trocken für einige Minuten. Beachten Sie die Schädelnähte und die beiden Bezugspunkte: Bregma und Lambda. </li&gt; <li> Um den rAAV-Vektor in den SN injizieren, definieren die Koordinaten in Richtung Bregma (von vorne nach hinten: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm und dorsoventrale: 7,2 mm von der Dura berechnet). Hinweis: Die dreidimensionalen Koordinaten für jede Region von Interesse berechnet werden kann, eine stereotaktischen Atlas des Rattengehirns mit, Bregma als anatomischen Bezugspunkt der Anwendung. </li><li> Füllen Sie eine 10 &amp; mgr; l Mikroinjektionsspritze (30 Gauge 20 mm) mit rAAV-Vektor und legen Sie sie in der stereotaktischen Instrument mit einem motorisierten Mikroinjektionspumpe angeschlossen. Kontrollieren Sie die Lautstärke , indem Sie einen Tropfen Vektor Freigabe und in einem polyvalenten Reinigungsmittel pH 9 (zB RBS) zu beseitigen. </li><li> Optisch prüfen, ob der Kopf gerade in der Kopfrahmen befestigt ist und die Links-Rechts-Achse zu bewerten. Sorgfältig visuell die von vorne nach hinten und mediolateral Koordinaten für Bregma und Lambda definieren und deren Höhe eine 30-Gauge-20 mm-Nadel in dorsoventraler Arm des stereotaktischen Rahmen mit messen. <ol><li> Erlauben Uhraximale von 0,3 mm Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda. Legen Sie die Nadel wieder auf Bregma und wenden die von vorne nach hinten und mediolateral Koordinaten durch die von vorne nach hinten und die mediolateral Arm des stereotaktischen Rahmen bewegen. </li></ol></li><li> Am Ort der Injektion, messen die Höhe des Schädels und sicherzustellen, dass er nicht mehr als 0,3 mm von der Höhe des Bregma unterscheidet. Bohren Sie ein Loch in den Schädel mit einem Durchmesser von etwa 2 mm. Messen Sie die Höhe der Dura, dies dient als Referenz der dorsoventrale anzuwenden koordinieren. Alternativ subtrahieren für den Schädel einer festen Dicke (0,9 mm). </li><li> Dringen die Dura eine 26-Gauge-Nadel und das Blut mit einem sterilen Gewebe absorbieren. Warten Sie, bis alle Blutungen, bevor Sie fortfahren gestoppt hat. </li><li> einfügen langsam die 10 &amp; mgr; l Mikroinjektionsspritze mit Vektor-Lösung in das Gehirn auf die vorgegebene Tiefe vorbelastet (dorsoventrale Koordinate). Warten Sie 1 min mit der Nadel an Ort und Stelle. Injizieren 3 ulder Vektorlösung (3,0 E11 Genomkopien / ml (mittlerer Vektor Dosis) oder 1,0 E12 GC / ml (high Vektor Dosis) von rAAV2 / 7 α-SYN oder eGFP Kontrollvektor) des motorisierten Mikroinjektionspumpe mit einem Durchsatz von 0,25 &amp; mgr; l unter Verwendung von / Minute </li><li> Nach der Injektion, halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für eine weitere min 5, bevor es langsam zu entfernen. Nähen Sie die Kopfhaut mit beschichteten geflochtenen Polyester 3.0, desinfizieren mit 1% jodium in 70% Isopropanol und sanft das Tier aus dem Gerät zu entfernen Stereotaxie. Lösen Sie zuerst die Nase und den Mund Bar, dann die beiden Ohr Bars. </li><li> Um die Anästhesie umkehren, injizieren die Ratte intraperitoneal mit 0,5 mg / kg Atipamezol und legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einer Heizplatte von 38 ° C, bis er aufwacht. Decken Sie die Ratte mit einem Papiertuch einen Abfall der Körpertemperatur zu verhindern. </li><li> Bieten Sie einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser für die ersten Stunden. Überwachen Sie die Ratte für die ersten paar Tage. Bei Bedarf anwenden Analgesie. Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die Maschen von t zu entfernen,er Schädel. Nach 1-2 Wochen wird der Schädel vollständig repariert und die Stiche lösen. </li></ol> 3. Bewertung der rAAV2 / 7 α-SYN injizierten Ratten mit nicht-invasiven PET-Bildgebung, Verhaltenstests und immunhistochemischen Analyse <ol><li> Um die Kinetik der nigrostriatale dopaminergen Neurodegeneration nicht-invasiv im Laufe der Zeit in den einzelnen Tieren verfolgen, zu quantifizieren Dopamin - Transporter (DAT) Bindung unter Verwendung von Kleintier - Positronen - Emissions - Tomographie (PET) und einen Tracer des DA - Transporter zB [18 F] -Fect 16 . </li><li> Um zu untersuchen, ob die Höhe der dopaminergen Neurodegeneration ausreicht motorischen Beeinträchtigungen bei den Ratten zu induzieren, die Ratten zu dem Zylinder Test unterziehen, um spontane forelimb Gebrauch zu bewerten. <ol><li> Legen Sie die Ratte in einer Breite von 20 cm Klarglaszylinder und Video das Verhalten bei vertikalen Bewegungen entlang der Wand und der Landung nach einem hinten. Ergebnis die Anzahl der Kontakte von jedem forepaw für insgesamt 20 gemachtKontakte. Ausführliche Beschreibung der Bewertungskriterien siehe Schallert et al. 18 Express die Anzahl der beeinträchtigten forelimb Kontakte (zB linke forepaw) als Prozentsatz der gesamten forelimb Kontakte (links und rechts forepaw). Hinweis: Nicht-lädierten Kontrollratten beide Pfoten mit ebenso sollte etwa 50% in diesem Test punkten. </li></ol></li><li> Führen Sie immunhistochemischen (IHC) Analyse der Ebene der Transgen-Expression und dopaminergen Zellverlust zu bewerten. <ol><li> Zu verschiedenen Endstadien opfern die Ratten mit einer Überdosis von Natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) und eine intrakardiale Perfusion mit kalter Kochsalzlösung mit 4% Paraformaldehyd in PBS 19 gefolgt zuführen. Fixieren Sie die Gehirne über Nacht bei 4 ° C und schnitt 50 um dicke koronale Hirnschnitten einen vibrierenden Mikrotom. </li><li> Führen Sie IHC-Färbung auf frei schwebenden Abschnitte Antikörper gegen α-SYN und Tyrosin-Hydroxylase unter Verwendung des Ausdrucks α-SYN Ebenen zu analysieren und die level der Neurodegeneration 16. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass es keine tatsächlichen oder potenziellen Interessenkonflikt.

Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb des Protokolls. Der Vektor-Titer sowie der Vektor Reinheit beeinflusst direkt die phänotypische Ergebnis des Modells. Übermäßige Vektor-Titer oder unzureichend gereinigte Vektor Chargen können in nicht-spezifische Toxizität führen. Daher ist die Verwendung von hochwertigen Vektor Chargen und geeignete Kontrollvektoren unverzichtbar. Ferner wird die genaue Positionierung des Kopfes der Ratte in den stereotaktischen Rahmen und die genaue Bestimmung der Koordinaten essentiell in ...

Um die Pathophysiologie von PD studieren und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen, die eng an die Neuropathologie ähneln, Physiologie und motorischen Symptome der menschlichen PD. Je höher der prädiktive Wert ist, desto besser können wir neue Therapien von Tiermodellen für die Patienten zu übersetzen. Die Entdeckung von alpha-Synuclein (α-SYN) als erstes PARK-Gen 1997 führte zu der Entwicklung der ersten genetischen PD-Modellen. Viele transgene Mäuse, die menschliche Wildtyp (WT) oder eine Mutante (A30P, A53T) α-SYN wurden in den letzten zehn Jahren erzeugt überexprimieren. Die Gehalte an α-SYN-Überexpression haben sich bei der Entwicklung der Pathologie von entscheidender Bedeutung zu sein. Auch die Mausstamm, das Vorhandensein oder Fehlen von endogenem α-SYN und ob die in voller Länge oder eine verkürzte Form exprimiert wird , spielt eine Rolle (detaillierte Überprüfung durch Magen und Chesselet 1). Die Überexpression von sowohl WT und mehreren klinischen Mutanten des menschlichen &amp;# 945; -syn in transgenen Mäusen induziert pathologischen Akkumulation von α-SYN und neuronale Dysfunktion 2-6. Doch bis jetzt sind die meisten transgenen α-SYN Maus-Modellen keine klaren dopaminergen Zellverlust und Dopamin-abhängige Verhaltensdefiziten anzuzeigen. Diese Hürde wurde durch direkte Ausrichtung der Substantia nigra (SN) mit viralen Vektoren überexprimiert, α-SYN überwinden. Virale Vektoren sind aus Viren stammen, die Zellen leicht infizieren können, stellen genetischem Material in ihren Wirtsgenom und zwingen die Wirtszelle das virale Genom, um zu replizieren, um neue Viruspartikel produzieren. Viren können zu nicht-replizierenden viralen Vektoren konstruiert werden, die ihre Fähigkeit behalten, in Zellen einzudringen und Gene einzuführen. Durch Teile des viralen Genoms zu löschen und sie durch die Gene von Interesse ersetzt, die Anwendung des Vektors in einer einzigen Runde Infektion ohne Replikation in der Wirtszelle führen, die allgemein als &quot;Transduktion&quot; bezeichnet. Virale Vektoren cein sowohl für die Überexpression und gene silencing verwendet werden. Das exprimierte Transgen ein Reporterprotein (zB grün fluoreszierende Protein oder Glühwürmchen - Luciferase) 7, ein therapeutisches Protein für Gentherapie - Anwendungen sein können 8-10 oder, wie wir in diesem Papier konzentrieren wird, um ein krankheitsbedingtes Protein für Krankheitsmodelle verwendet 11 -14. Virusvektor-vermittelte Genabgabe bietet eine alternative Möglichkeit Transgenen im ZNS mit mehreren Vorteilen auszudrücken. Mit lokalen Transgen Lieferung, können bestimmte Hirnregionen ausgerichtet sein. Ferner kann die Transgenexpression im Erwachsenenalter die Gefahr der Kompensationsmechanismen während der Entwicklung abnimmt induziert werden. Außerdem können Modelle in unterschiedlichen Arten und Stämme erstellt werden. Und schließlich können verschiedene Transgene leicht kombiniert werden. Verwendung von viralen Vektoren können hohe Transgen-Expressionsniveaus erreicht werden, was wichtig sein könnte, da der Beginn der Erkrankung und der Schwere auf der Ebene der ÜBERBEL häufig abhängigression. Mehrere Vektorsysteme basieren auf verschiedenen Viren entwickelt worden. Die Wahl des Vektorsystems hängt von der Größe des Gens von Interesse, die erforderliche Dauer der Genexpression, die Zielzelle und die biologische Sicherheit Probleme. Zur stabilen Gentransfer in das Gehirn, lentivirale (LV) und rekombinantem adeno-assoziierter viraler (rAAV) -Vektoren sind nun die Vektorsysteme der Wahl angesehen, da sie auf effiziente und langfristige Genexpression im Nagetier Gehirn führen. Für spezifische Targeting der dopaminergen Neuronen (DN) des SN, rAAV Vektoren sind Vektoren LV allmählich outcompeted wegen ihrer höheren Titern und Transduktionseffizienz von DN. Die besten α-SYN Basis Nagetiermodellen derzeit haben aus einem kombinierten Einsatz mit neueren AAV - Serotypen (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) und optimierte Vektorkonstrukte, Titer und Reinheit 15,16 entwickelt. Der Vektor-Titer sowie der Vektor Reinheit direkt beeinflusstdas phänotypische Ergebnis des Modells. Übermäßige Vektor-Titer oder unzureichend gereinigte Vektor Chargen können in nicht-spezifische Toxizität führen. Daher sind geeignete Kontrollvektoren unverzichtbar. Erhebliche Zeitinvestitionen in den viralen Vektor Produktion, Upscaling und Reinigungsverfahren wurden ebenfalls als wesentlich erwiesen reproduzierbare und qualitativ hochwertige Vektor-Chargen zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Weibchen 8 Wochen alt Wistar Ratten</td><td>Janvier</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>Ketamin (Nimatek)</td><td>Eurovet Tiergesundheit</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin (Dormitor)</td><td>Orion-Pharma/ Janssen Animal Health</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Lokalanästhetikum für Kopfhaut und Ohren: Xyloca&iuml; ne 2% Gel</td><td>Astrazeneca</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>Terramycin</td><td>Pfizer</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>Bupr&eacute; Norphin (Vetergesik)</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>Jodium 1% Isopropanol</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>stereotaktischer Kopfrahmen</td><td>Stoeling</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (30 gauge -20 mm -pst 2)</td><td>Hamilton/ Filter Service</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol (Antisedan)</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T & alpha;-SYN Vektor</td><td>LVVC, KU Leuven</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr> <tr><td>Natrium-Pentobarbital (Nembutal)</td><td>Ceva Sant&eacute;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Microm</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonales Synuclein Ab</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5.000</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonal TH Ab</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Lutetiumoxyorthosilikat-Detektor basierend auf FOCUS 220 Tomograph</td><td>Siemens/ Concorde Microsystems</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Radioligand: 18F-FECT</td><td>Im Haus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-Dopa: Prolopa 125</td><td>Roche</td><td></td><td>6 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD lineares Polyethylenimin (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 1 watston steretactic atlas, vierte Auflage</td><td>Elsevier</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung eines alpha-synuklein based rattenmodell für parkinson-krankheit durch stereotaktische injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten viralen vektor,

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Um die molekularen Mechanismen der Parkinson-Krankheit (PD) und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu untersuchen, setzen wissenschaftliche Forscher an Tiermodellen. Die Identifizierung von PD-assoziierten Genen hat zu der Entwicklung von genetischen PD Modelle geführt. Die meisten transgenen α-SYN Mausmodelle entwickeln schrittweise α-SYN Pathologie aber nicht klar dopaminergen Zellverlust und Dopamin-abhängige Verhaltensdefiziten anzuzeigen. Diese Hürde wurde durch direkte Ausrichtung der Substantia nigra mit viralen Vektoren überexprimiert, PD-assoziierten Gene zu überwinden. Lokale Genübertragung mittels viraler Vektoren bietet eine attraktive Möglichkeit, Transgene in das zentrale Nervensystem zu exprimieren. Spezifischen Hirnregionen ausgerichtet werden können (zB der Substantia nigra), kann die Expression im adulten Einstellung und hohe Expressionsniveaus erreicht werden kann induziert werden. Ferner können verschiedene Vektor-Systeme auf der Basis verschiedener Viren verwendet werden. Das Protokoll legt alle entscheidenden Schritte, um einen viralen Vektor auszuführenInjektion in der Substantia nigra der Ratte einen viralen Vektor-basierte alpha-Synuclein-Tiermodell für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Das Gesamtkonzept des Experiments ist in Abbildung 1 dargestellt 2 rAAV / 7-vermittelte Überexpression von A53T α-SYN induziert Dopamin-abhängige motorische Defizite. Um zu untersuchen , ob die Höhe der α-SYN - Überexpression ausreichend ist , motorischen Beeinträchtigungen bei Ratten zu induzieren, wir die Ratten zur Zylindertest unterzogen , um spontane forelimb Verwendung (3A...

Dieses Manuskript beschreibt, wie die virale vektorvermittelte lokale Genabgabe eine attraktive Möglichkeit bietet, Transgene im zentralen Nervensystem zu exprimieren. Das Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte zur Durchführung einer viralen Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte, um ein auf viralen Vektoren basierendes Tiermodell für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer stereotaktischen Injektion im zentralen Nervensystem ein tierisches Modell für die Parkinson-Krankheit auf der Basis eines viralen Vektors zu entwickeln. Diese Methode kann verwendet werden, um normale Tiermodelle zu erzeugen, die präklinische Arzneimitteltests ermöglichen und hilfreich bei der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Parkinson-Krankheit sowie zahlreicher anderer neurodegenerativer Erkrankungen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine gezielte Behandlung bestimmter Hirnregionen ermöglicht.Ein hoher Expressiongrad des Trenching-Genes im Gehirn kann erreicht werden, und dieser kann zur Erstellung von Tiermodellen in bestimmten Tierstämmen und -arten verwendet werden. Verschiedene endgültige Vektorsysteme wurden entwickelt. Die Wahl des Vektorsystems hängt von der Größe des zu exprimierenden Trenching-Gens, der Dauer der Genexpression, den zu targetenden Strukturen und biosicherheitsrelevanten Aspekten ab.Die Durchführung des Verfahrens wird Annelies Aertgeerts, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, eine acht Wochen alte weibliche Wistar-

development-an-alpha-synuclein-based-rat-model-for-parkinson-s

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

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Quelle: Tagliafierro, L., et al. Lentivirale Vektorplattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-Editing-Werkzeugen in humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Krankheitsmodelle. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) zur gezielten epigenetischen Modifikation von alpha-Synuclein, einem Schlüsselprotein bei der Parkinson-Krankheit. Das Protokoll ermöglicht eine Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung,...

Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erstellung eines Rattenmodells der Parkinson-Krankheit, indem das Neurotoxin 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in das Gehirn injiziert wird. Die Neurotoxin-Infusion in das mediale Vorderhirnbündel (MFB) zielt spezifisch auf dopaminerge Neuronen ab, die für die motorische Kontrolle verantwortlich sind, was zu ihrer Zerstörung und Replikation von Parkinson-Symptomen führt.

Generierung des 6-Hydroxydopamin-Rattenmodells der Parkinson-Krankheit

Dieses Video zeigt den Prozess der Injektion eines viralen Vektors in die Substantia nigra der Ratte, um die Parkinson-Krankheit zu modellieren. Es werden die Schritte zur Vorbereitung der Ratte, zur Mikroinjektion des viralen Vektors in die Substantia nigra und das Wiederherstellungsverfahren beschrieben.

Eine virale Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte zur Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Schritte zu skizzieren, die für die Herstellung von Fibrillen aus monomem Alpha-Synuclein, anschließende Qualitätskontrolle und die Verwendung der vorgeformten Fibrillen in vivo erforderlich sind.

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Diese Arbeit analysiert die Vektordosis und die Expositionszeit, die erforderlich sind, um Neuroinflammation, Neurodegeneration und motorische Beeinträchtigung in diesem präklinischen Modell der Parkinson-Krankheit zu induzieren. Diese Vektoren, die das menschliche α-Synuclein kodieren, werden in die Substantia nigra geliefert, um die mit der Parkinson-Krankheit verbundene Synuclein-Pathologie zu rekapitulieren.

Analyse des Parkinson-Mausmodells, das durch Adeno-assoziierte virale Vektoren induziert wird, die menschliches α-Synuclein kodieren

In diesem Artikel beschreiben wir die Identifikation des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 (AAV3) als die effizienteste Vektor für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebszellen.

High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren

Ein Protokoll zur Durchführung einseitige 6-OHDA Läsionen der mediale Vorderhirnbündel in Mäusen beschrieben. Dieses Verfahren hat eine niedrige Mortalitätsrate (13,3%) mit 89% der überlebenden Tiere mit&gt; 95% Verlust von striatalen Dopamin und 90,63 ± -4,02% ipsiversive Drehvorspannung nach der Seite der Läsion.

Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

Erfahren Sie die stereotaktische Injektion eines rekombinanten AAV-Vektors zur Entwicklung eines Rattenmodells für die Parkinson-Krankheit. Diese Methode ermöglicht gezielte Genexpression in der Substantia nigra für präklinische Studien.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor, (Video) | JoVE Journal

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

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