Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer stereotaktischen Injektion im zentralen Nervensystem ein tierisches Modell für die Parkinson-Krankheit auf der Basis eines viralen Vektors zu entwickeln. Diese Methode kann verwendet werden, um normale Tiermodelle zu erzeugen, die präklinische Arzneimitteltests ermöglichen und hilfreich bei der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Parkinson-Krankheit sowie zahlreicher anderer neurodegenerativer Erkrankungen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine gezielte Behandlung bestimmter Hirnregionen ermöglicht.

Ein hoher Expressiongrad des Trenching-Genes im Gehirn kann erreicht werden, und dieser kann zur Erstellung von Tiermodellen in bestimmten Tierstämmen und -arten verwendet werden. Verschiedene endgültige Vektorsysteme wurden entwickelt. Die Wahl des Vektorsystems hängt von der Größe des zu exprimierenden Trenching-Gens, der Dauer der Genexpression, den zu targetenden Strukturen und biosicherheitsrelevanten Aspekten ab.

Die Durchführung des Verfahrens wird Annelies Aertgeerts, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, eine acht Wochen alte weibliche Wistar-Ratte gemäß den genehmigten Protokollen ordnungsgemäß zu anästhesieren. Überprüfen Sie, ob eine chirurgische Anästhesietiefe erreicht wurde, indem Sie jede Pfote zusammendrücken und das Fehlen des Withdrawal-Reflexes feststellen.

Verwenden Sie anschließend einen MicroTransponder-Implantator, um einen MicroTransponder auf dem Rücken der Ratte zu platzieren. Überprüfen Sie, ob der MicroTransponder korrekt positioniert ist und ein Ablesesignal erhalten werden kann. Schneiden Sie nun das Haar auf der Kopfhaut der Ratte und applizieren Sie ein Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut und die Ohren.

Überführen Sie die Ratte in eine sterile Flusswerkbank und führen Sie den Rest des Verfahrens unter aseptischen Bedingungen durch. Platzieren Sie die Ratte im stereotaktischen Rahmen, indem Sie zuerst die Ohrstifte und anschließend den Mund- und Nasenhalter befestigen. Bedecken Sie den Körper der Ratte mit einer Papierschürze, um einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden.

Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf, um zu verhindern, dass die Augen austrocknen. Desinfizieren Sie anschließend die Kopfhaut gemäß den genehmigten Verfahren. Hier wird 1 % Jod in 70 % Isopropylalkohol verwendet.

Nachdem ein kleiner Einschnitt in der Mittellinie der Kopfhaut gemacht wurde, vorsichtig die Membranen am Schädel abkratzen und mit Kochsalzlösung spülen. Nach dem Trocknen des Schädels sicherstellen, dass Bregma und Lambda deutlich sichtbar sind. Nun eine 10-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze mit 30-Gauge-20-Millimeter-Nadel mit rekombinantem AAV füllen und auf die motorisierte Mikroinjektionspumpe setzen, die mit dem stereotaktischen Instrument verbunden ist.

Für die gezielte Transduktion dopaminerger Neuronen der Substantia nigra sind rekombinante AV-Vektoren aufgrund ihrer hohen Titer und Effizienz bei der Transduktion dopaminerger Neuronen die erste Wahl. Prüfen Sie den Durchfluss, indem Sie einen Tropfen AAV freisetzen. Entsorgen Sie jeglichen freigesetzten AAV in einem mehrwertigen Reinigungsreiniger.

Überprüfen Sie visuell, ob der Kopf gerade im Kopfrahmen fixiert ist. Prüfen Sie anschließend, ob der Schädel eben liegt, indem Sie zunächst die Nadelspitze nach Bregma bewegen und die Höhe an diesem Punkt messen, indem Sie die Nadelspitze in dorsoventraler Richtung absenken, bis sie den Schädel berührt. Wiederholen Sie den Vorgang am Lambda.

Nachdem die Nadel zum Bregma zurückgebracht wurde, bewegen Sie die Nadel in anteroposteriorer und mediolateraler Richtung zu den stereotaktischen Koordinaten für die Mikroinjektion. Notieren Sie die Koordinaten. An der Injektionsstelle messen Sie die Schädellänge wie zuvor und stellen Sie sicher, dass sie nicht um mehr als 0,3 mm von der Höhe des Bregma abweicht.

Bohren Sie anschließend vorsichtig ein zwei Millimeter großes Loch in den Schädel. Sobald das Loch gebohrt ist, messen Sie die Höhe der Dura, um die Bezugsstelle für die dorsoventrale Koordinate zu bestimmen. Durchstoßen Sie die Dura mit einer 26-Gauge-Nadel.

Binden Sie das Blut mit dem sterilen Tupfer auf und fahren Sie erst fort, wenn die Blutung vollständig gestoppt ist. Senken Sie nun langsam die Nadel der vorbeladenen Mikroinjektionsspritze in das Gehirn bis zur dorsoventralen Koordinate ab. Warten Sie dann eine Minute lang.

Injizieren Sie anschließend drei Mikroliter AAV mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion weitere fünf Minuten lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss entlang der Nadelbahn zu verhindern, bevor Sie sie langsam entfernen. Nähen Sie die Kopfhaut mit codiertem, geflochtenem Polyester 3,0 und desinfizieren Sie die Haut mit einprozentigem Jod und 70 % Isopropylalkohol.

Um die Nasen- und Mundhalterung sowie anschließend die beiden Ohrhalterungen zu lösen, um das Tier vorsichtig aus dem stereotaktischen Instrument zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt Analgetika sowie gegebenenfalls ein Anästhesie-Antagonist verabreichen. Danach die Ratte in einen sauberen Käfig auf eine auf 38 Grad Celsius eingestellte Heizplatte legen und engmaschig überwachen, bis sie aufwacht.

Nach der Operation können die Kinetik der Neurodegeneration im gesamten Tier mithilfe von Verhaltensuntersuchungen und PET-Bildgebung sowie nach der Tötung mithilfe immunhistochemischer Techniken untersucht werden. Der Zylindertest zur Beurteilung der spontanen Vordergliedmaßenbenutzung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Mikroinjektion eines rekombinanten AAV, der die A53T-Mutation des alpha-Synucleins exprimierte, in die Substantia nigra durchgeführt. Ab drei Wochen nach der Injektion zeigte sich bei Ratten, die die mittlere Dosis erhalten hatten, eine signifikante motorische Beeinträchtigung.

Vier Wochen nach der Injektion wurde eine 50%ige Abnahme der spontanen Nutzung der kontralateralen Vorderpfote beobachtet. Die Kontrolltiere, die mit eGFP injiziert wurden, zeigten hingegen keine Asymmetrie in der Vorderpfotentätigkeit. Ratten, die eine höhere Dosis des rekombinanten AAV 2/7A53T Alpha-Synuclein erhielten, wiesen 29 Tage nach der Injektion eine stärkere Beeinträchtigung der Vorderpfotentätigkeit auf.

Um zu beweisen, dass die beobachtete motorische Beeinträchtigung dopaminabhängig war, wurde eine Einzeldosis L-Dopa verabreicht. Bei Wiederholung des Zylindertests 45 Minuten nach der L-Dopa-Behandlung zeigte sich eine vollständige Erholung der Vorderpfotenbenutzung bei den Tieren, die mit dem rekombinanten AAV 2/7A53T Alpha-Synuclein injiziert worden waren. Um die Kinetik der nigrostriatalen dopaminergen Neurodegeneration nichtinvasiv über die Zeit bei einzelnen Tieren zu verfolgen, wurde die Bindung des Dopamintransporters mittels Kleintier-Positronenemissionstomographie mit F-18FECT als Radioligand quantifiziert.

Die DAT-Bindung nahm bei Ratten, die rekombinantes AAV 2/7A53T Alpha-Synuclein in den kontralateralen Caudatus erhielten, im Zeitverlauf signifikant ab. Nach 32 Tagen wurde ein Rückgang der DAT-Bindung um bis zu 85 % beobachtet. Als positiver Kontrolle führte die Injektion des Neurotoxins 6-OHDA in die Substantia nigra innerhalb von sieben Tagen zu einem Verlust der DAT-Bindung um 90 %.

Gehirnschnitte von Ratten, die über einen Zeitraum hinweg mit rekombinantem AAV 2/7A53T Alpha-Synuclein mikroinjiziert worden waren, wurden auf Tyrosinhydroxylase, einen Marker dopaminerger Neuronen, immungefärbt. Diese Abbildung zeigt den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen innerhalb eines Zeitraums von 29 Tagen nach der Mikroinjektion. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in 45 Minuten durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, hochwertige finale Vektormatchs zu verwenden. Nach diesem Verfahren können weitere Techniken wie nicht-invasive PET-Bildgebung, Verhaltensanalyse und immunhistochemische Analyse durchgeführt werden, um das Ausmaß der Neurodegeneration und Neuropathologie zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man eine Vektorinjektion in die Substantia nigra durchführt, um auf viraler Vektorbasis basierende Tiermodelle für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit viralen Vektoren gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einer laminarer Luftströmung und die ordnungsgemäße Dekontamination von Abfällen gemäß diesem Verfahren getroffen werden sollten.