Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein auf viralen Vektoren basierendes Tiermodell für die Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion in das zentrale Nervensystem zu entwickeln. Diese Methode kann verwendet werden, um normale Tiermodelle zu entwickeln, die präklinische Wirkstofftests ermöglichen und bei der Untersuchung des molekularen Mechanismus der Parkinson-Krankheit sowie vieler anderer neurodegenerativer Erkrankungen von Vorteil sein können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für das spezifische Targeting von Gehirnregionen verwendet werden kann.

Es kann eine hohe Trenching-Gehirnexpression erreicht werden und dass es zur Erstellung von Tiermodellen in bestimmten Tierstämmen und -arten verwendet werden kann. Die verschiedenen endgültigen Vektorsysteme wurden entwickelt. Die Wahl des Vektorsystems hängt von der Größe des Grabens ab, den Sie exprimieren möchten, von der Dauer der Genexpression, von den Geräuschen, auf die Sie abzielen möchten, und von Fragen der biologischen Sicherheit.

Verfahren wird von Annelies Aertgeerts, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der ordnungsgemäßen Betäubung einer acht Wochen alten weiblichen Wistar-Ratte nach genehmigten Protokollen. Vergewissern Sie sich, dass eine chirurgische Anästhesieebene erreicht wurde, indem Sie jede Pfote zusammendrücken und feststellen, dass der Rückzugsreflex nicht vorhanden ist.

Verwenden Sie anschließend einen MicroTransponder-Implanter, um einen MicroTransponder auf dem Rücken der Ratte zu platzieren. Prüfen Sie, ob der MicroTransponder richtig positioniert ist und ob eine Auslesung möglich ist. Schneiden Sie nun die Haare auf der Kopfhaut der Ratte ab und tragen Sie ein Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut und die Ohren auf.

Bringen Sie die Ratte in eine Laminar-Flow-Haube und führen Sie den Rest des Eingriffs mit aseptischer Technik durch. Platzieren Sie die Ratte in den stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrstangen sichern, gefolgt von der Mund- und Nasenstange. Decken Sie den Körper der Ratte mit einer Papierdecke ab, um ein Absinken der Körpertemperatur zu vermeiden.

Tragen Sie ein Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Desinfizieren Sie anschließend die Kopfhaut nach zugelassenen Verfahren. Hier kommt ein Prozent Jod in 70% Isopropyl zum Einsatz.

Nachdem Sie einen kleinen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut gemacht haben, kratzen Sie die Membranen am Schädel vorsichtig ab und spülen Sie sie mit Kochsalzlösung ab. Nachdem Sie den Schädel trocknen gelassen haben, stellen Sie sicher, dass Bregma und Lambda deutlich zu sehen sind. Füllen Sie nun eine 10-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze mit 30 Gauge und 20 Milometern mit rekombinantem AAV und setzen Sie sie auf die motorisierte Mikroinjektionspumpe, die mit dem stereotaktischen Instrument verbunden ist.

Für die spezifische Transaktion der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra sind rekombinante AV-Vektoren aufgrund ihrer hohen Titer und ihrer Effizienz bei der Transduktion dopaminerger Neuronen die erste Wahl. Testen Sie den Durchfluss, indem Sie einen Tropfen AAV freisetzen. Entsorgen Sie freigesetztes AAV in einem mehrwertigen Reinigungsmittel.

Überprüfen Sie visuell, ob der Kopf gerade im Kopfrahmen befestigt ist. Überprüfen Sie dann, ob der Schädel flach ist, indem Sie zuerst die Spitze der Nadel zum Bregma bewegen und die Höhe an dieser Stelle messen, indem Sie die Spitze der Nadel in dorsal-ventraler Richtung absenken, bis sie den Schädel berührt. Wiederholen Sie den Vorgang bei lambda.

Nachdem Sie die Nadel wieder in das Bregma zurückversetzt haben, bewegen Sie die Nadel in anterior-posteriorer und medialer lateraler Richtung zu den stereotaktischen Koordinaten für die Mikroinjektion. Notieren Sie sich die Koordinaten. Messen Sie an der Injektionsstelle wie zuvor die Höhe des Schädels und stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr als 0,3 mm von der Höhe des Bregmas abweicht.

Bohren Sie dann vorsichtig ein zwei Millimeter großes Loch in den Schädel. Sobald das Loch gebohrt ist, messen Sie die Höhe der Dura, um die Referenz zu bestimmen, von der aus die dorsal-ventrale Koordinate angewendet werden soll. Stechen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel in die Dura ein.

Nehmen Sie jegliches Blut mit dem sterilen Gewebe auf und fahren Sie erst fort, wenn alle Blutungen aufgehört haben. Senken Sie nun die Nadel der vorgeladenen Mikroinjektionsspritze langsam in das Gehirn bis zur dorsal-ventralen Koordinate ab. Und halten Sie eine Minute inne.

Injizieren Sie dann drei Mikroliter AAV mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion weitere fünf Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss entlang der Nadelschiene zu verhindern, bevor Sie sie langsam entfernen. Nähen Sie die Kopfhaut mit codiertem, geflochtenem Polyester 3.0 und desinfizieren Sie die Haut mit einem Prozent Jod und 70 % Isopropyl.

Lösen Sie den Nasen- und Mundbügel und dann die beiden Ohrbügel, um das Tier vorsichtig aus dem stereotaktischen Instrument zu entfernen. Verabreichen Sie zu diesem Zeitpunkt eine Analgesie und, falls erforderlich, ein Anästhesieumkehrmittel. Setzen Sie die Ratte dann in einen sauberen Käfig auf eine auf 38 Grad Celsius eingestellte Heizplatte und überwachen Sie sie genau, bis sie aufwacht.

Nach der Operation kann die Kinetik der Neurodegeneration am ganzen Tier mit Hilfe von Verhaltenstests und PET-Bildgebung und nach der Tötung mit immunhistochemischen Techniken untersucht werden. Der Zylindertest zur Bewertung der spontanen Nutzung der Vordergliedmaßen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Mikroinjektion von rekombinantem AAV, das A53T-Mutation alpha-Synuclein exprimiert, in die Substantia nigra durchgeführt. Ab drei Wochen nach der Injektion wurde die signifikante motorische Beeinträchtigung bei Ratten beobachtet, die die mittlere Dosis erhielten.

Vier Wochen nach der Injektion wurde ein Rückgang der spontanen kontralateralen Anwendung der Vorderpfoten um 50 % beobachtet. Während die kontrollierten eGFP-injizierten Tiere keine Asymmetrie bei der Verwendung der Vorderpfoten zeigten. Ratten, die eine höhere Dosis von rekombinantem AAV 2/7A53T alpha-Synuclein erhielten, zeigten 29 Tage nach der Injektion eine ausgeprägtere Beeinträchtigung der Verwendung mit der Vorderpfote.

Um zu beweisen, dass die beobachtete motorische Beeinträchtigung Dopaminabhängig war, wurde eine Einzeldosis L-Doba verabreicht. Als der Zylindertest 45 Minuten nach der L-Dopa-Behandlung wiederholt wurde, wurde eine vollständige Wiederherstellung der Vorderpfotenverwendung bei den rekombinanten Tieren mit AAV 2/7A53T alpha-Synuclein injiziert. Um die Kinetik der nigrostriatalen dopaminergen Neurodegeneration nicht-invasiv über die Zeit zu verfolgen, wurde bei einzelnen Tieren die Dopamin-transportierte Bindung mittels Positronenemissionstomographie bei Kleintieren mit F-18FECT als Radioliganden quantifiziert.

DAT-Bindung nahm im ipsilateralen Caudatbudan von rekombinanten AAV 2/7A53T-alpha-Synuclein-injizierten Ratten im Laufe der Zeit signifikant ab. Nach 32 Tagen wurde eine Abnahme der DAT-Bindung um bis zu 85 % beobachtet. Als Positivkontrolle induzierte die Injektion des Neurotoxins 6 OHDA in das SN innerhalb von sieben Tagen einen Verlust der DAT-Bindung von 90%.

Gehirnschnitte von Ratten, die im Laufe der Zeit mit rekombinantem AAV 2/7A53T alpha-Synuclein mikroinjiziert wurden, wurden immungefärbt für Tyrosinhydroxylase, einen Marker für dopaminerge Neuronen. Diese Abbildung zeigt den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen über einen Zeitraum von 29 Tagen nach der Mikroinjektion. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten durchgeführt werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, qualitativ hochwertige endgültige Vektorübereinstimmungen zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie nicht-invasive PET-Bildgebung, Verhaltensanalyse und immunhistochemische Analyse durchgeführt werden, um den Grad der Neurodegeneration und Neuropathologie zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine virale Vektorinjektion in die Substantia nigra durchführen können, um auf viralen Vektoren basierende Tiermodelle für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren gefährlich sein kann und dass nach diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter laminarer Strömung und die ordnungsgemäße Dekontamination von Abfällen getroffen werden sollten.