Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelnen Zellen von schicken Somiten oder Neuralröhren ein Plasmid zu injizieren, das für grün fluoreszierendes Protein kodiert. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikroinjektionspipetten mit einem entsprechenden Spitzenöffnungsdurchmesser gezogen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Plasmidstock für die Injektion vorzubereiten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Der vierte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikropipetten mit Plasmid-DNA zu bestücken. Der letzte Schritt des Eingriffs besteht darin, das gewünschte Gewebe zu injizieren.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Bandbreite der Derivate in der Anzahl der Zellen zeigen, die von einzelnen markierten Vorläuferzellen in ausgewählten SOM- und Neuralrohr-Subdomänen durch Immunfluoreszenzmikroskopie produziert werden. Hallo, ich bin Rael aus dem Labor von Professor Heim in der Abteilung für Medizinische Neurobiologie an der Hebräischen Universität Jerusalem. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion einzelner Zellen von Hühnersomiten und Neuralrohren.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Linientrennung von Milben- und Neuralrohrzellen zu untersuchen. Fangen wir also an: Um einzelne transfizierte Zellen in Hühnerembryonen zu erzeugen, beginnen Sie mit dem Ziehen von Mikropipetten. Wir ziehen unsere Pipetten auf einem Standard-Pipettenabzieher Naga PP 83 mit einer Heizstufe von 13,5.

Die genaue Einstellung muss kalibriert werden, um einen Pipettenspitzendurchmesser zwischen acht und 10 Mikrometern zu erreichen. Wir verwenden Filamente, die Boris-Silikatglasröhren mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,75 bis 0,78 Millimetern enthalten. Sie können auch handelsübliche Mikropipetten verwenden, denen ein Filament mit einem Millimeter Außendurchmesser und einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern fehlt.

Die vorbereiteten Pipetten werden in einer Kunststoffschale aufbewahrt, wobei die Spitzen vor dem Kontakt mit dem Rand der Schale geschützt sind. Um die DNA für die Mikroinjektion vorzubereiten, wird das Plasmid von Interesse in DH five alpha e coli transfiziert. Am nächsten Tag wird das Plasmid mit einem Maxi-Vorbereitungskit für nicht-klonale Injektionen mit Standardverfahren aufgereinigt, wobei eine DNA-Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter verwendet wird.

Bei Experimenten, bei denen einzelne Klone gewünscht werden, ist die Plasmidkonzentration viel niedriger und muss angepasst werden. Für P-C-A-G-G-F-P-A ist eine Konzentration von 0,05 bis 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter gut geeignet. Sobald die optimale Konzentration bestimmt wurde, empfehlen wir, den gesamten gereinigten Plasmidbestand zu verdünnen, anstatt einzelne Präparate auf eine vorgegebene Konzentration zu verwenden.

Letzteres könnte zu einer gewissen Varianz in den Erfolgsraten führen, wahrscheinlich aufgrund von Variationen in der Reinheit und anderen Parametern, wie z. B. dem Anteil des Supercoil-Plasmids zur Vorbereitung von Eiern für die Mikroinjektion. Hühnereier, die auf ihren langen Achsen liegend bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubiert wurden, werden mit 70 % Ethanol abgetupft und trocknen gelassen. Als nächstes stechen Sie das spitze Ende des Eies mit einer chirurgischen Schere ein. Mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 19-Gauge-Nadel zwei Milliliter Albumin aus dem Ei ziehen und die Löcher vor der Injektion mit heißem Paraffin verschließen.

Öffne mit einer chirurgischen Schere ein Fenster oben an der Eierschale, um zu verhindern, dass Schmutz in das Loch gelangt. Lege ein Stück Klebeband über das Fenster und schneide ein Loch hindurch. Um den Embryo besser sichtbar zu machen, verwenden Sie eine feuergezogene Kapillare, die an einem Aspirator befestigt ist, um eine ungiftige Tinte wie Pelican 17 unter die gestrahlte Haut zu injizieren.

Als nächstes greifen Sie auf den Embryo zu, indem Sie die vitalen und/oder Amnionmembranen mit 0,14 Millimeter Insektenstiften, die an einem Nadelhalter befestigt sind, durchtrennen und umleiten, um die DNA in die gezogene Pipette Eloqua zu laden, und fügen Sie eine kleine Menge des schnellen grünen Pulvers mit der Kapillare hinzu. Ziehen Sie eine minimale Menge einer in Plasmid gelagerten Kapillare mit ausreichendem Durchmesser auf einen Aspirator. Führen Sie es dann in das Ende der Pipette gegenüber der geschärften Spitze ein und laden Sie die DNA so nah wie möglich an das geschärfte Ende.

Befestigen Sie dann die Pipette an einem manuellen Luftdruckinjektor, der an einem Mikromanipulator montiert ist. Üben Sie bei Bedarf einen minimalen Druck aus, damit die Plasmidlösung die Spitze der Pipette erreichen kann. Manipulieren Sie die Pipette in das flüssige Medium des Eies und üben Sie dabei etwas Luftdruck aus, um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu verhindern.

Ist die relevante Gewebedomäne erst einmal durchstochen, reicht die Druckänderung oft aus, um das Plasmid mit sichtbarem schnellem Grün freizusetzen. Ist dies nicht der Fall, üben Sie leichten Druck auf die Spritze aus, bis das Plasmid-Schnellgrüngemisch ausgestoßen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang entlang der Achse des Embryos nach der Injektion, PBS kann hinzugefügt werden.

Zum Schluss verschließen Sie das Fenster mit Klebeband und legen die Eier wieder in den Brutkasten. Vermeide Belüftung und stelle kleine Behälter mit Wasser in den Inkubator, um die Feuchtigkeit zu halten und den Ertrag zu steigern. Wenn die Zielstelle der Injektion oberflächlich genug war, um leicht erkennbar zu sein, wie z. B. innerhalb des dorsalen Somiten-Neuralrohrs oder des Ektoderms, kann man die Erfolgsrate des Experiments messen, indem man eine Beobachtung des gesamten Berges mit einem fluoreszierenden Fernglas durchführt.

Dieser Schritt ist besonders hilfreich, um zu bewerten, ob zu viele oder zu wenige Zellen beschriftet wurden. Wenn eine weitere Inkubation gewünscht wird, fügen Sie dem Ei nach dem Betrachten Antibiotika hinzu, die PBS-Lösung enthalten, und ersetzen Sie das Deckenband. Darüber hinaus kann man die Erfolgsrate der Injektion beurteilen, indem man die Embryonen seriell schneidet und Immunhistochemie durchführt.

Nach vier Stunden oder mehr werden die Embryonen nach der Injektion fixiert und für die Paraffinsektion aufbereitet. Die auf Glas montierten Schnitte werden dann depa-finalisiert und Immunfärbungen für Amplifikationsmethoden zur Reportervisualisierung, wie z. B. Biotin Streptavidin, könnten wünschenswert sein. Schließlich werden die seriellen Abschnitte gescannt, um markierte Zellen in injizierten Segmenten zu erkennen.

Werden bei ersten Versuchen mehrere statt einzelner Zellen gewonnen, so muss der Plasmidbestand in dem wiederholten Prozess verdünnt werden, bis angemessene Ergebnisse erzielt werden. In der Regel führen wir eine einzige Injektion von P-C-A-G-G-F-P pro Milbe durch, wobei wir auf sechs bis 12 Segmente pro Embryo abzielen. Unter dieser Einstellung kann ein klares Signal durch Beobachtung des gesamten Mount acht Stunden nach der Injektion in mindestens einem Segment eines von 10 Embryonen nachgewiesen werden.

In diesem Beispiel wurde einer Soo-Milbe ein GFP-kodierendes Plasmid injiziert, und fünf Stunden später wird eine einzelne fluoreszierende Zelle in einer ganzen Bergansicht des hier gezeigten Embryos beobachtet. Wenn 24 Stunden nach der Injektion in die zentrale Milbe beobachtet wird, wird ein Klon von fluoreszierenden Zellen in einem ganzen montierten Embryo zwei Tage nach der klonalen Injektion beobachtet. Die Schnittierung dieses Segments zeigt das Vorhandensein von klonalen Nachkommen sowohl in der Dermis als auch im Muskel, was zeigt, dass einzelne Vorläuferzellen beide Derivate erzeugen.

Was die Somiten betrifft, so können auch einzelne neuroepitheliale Vorläuferzellen im dorsalen Neuralrohr aufgespießt werden, wie in diesem Querschnitt dargestellt, der hier fünf Stunden nach der Injektion aufgenommen wurde. Die Analyse der seriellen Schnitte zeigte, dass klonale Transfekten erreicht wurden, wenn die Erfolgsrate bei etwa 10% lag. Das bedeutet, dass die Technik zur Erreichung der Klonalität per Definition sehr ineffizient ist. Andererseits erwiesen sich unter diesen Bedingungen mehr als 93 % der positiven Markierungsereignisse als klonal.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren einzelne Zellen von Hühnerembryonen injizieren können. Es ist wichtig, daran zu denken, große Mengen an Stammplasmid auf eine ideale Konzentration für Einzelzellinfektionen zu verdünnen und es dann in Ihren Experimenten zu verwenden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.