Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di microfabbricare dispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule in ambienti di coltura bidimensionali e tridimensionali. Ciò si ottiene utilizzando una tecnica di stampaggio e impilamento a sandwich multistrato per produrre una serie di micro perni azionati verticalmente. Come seconda fase, il micro post array azionato verticalmente viene modificato per allungare un film di coltura, che applica ceppi ben controllati alle cellule coltivate sul film.

In alternativa, l'array può essere modificato per comprimere costrutti di biomateriali micromodellati al fine di applicare la stimolazione meccanica alle cellule. Coltivati in una serie di idrogel tridimensionali, si ottengono risultati che mostrano l'applicazione simultanea di una gamma di ceppi di compressione bidimensionali, ecoassiali e tridimensionali attraverso l'array, sulla base dell'analisi delle immagini di marcatori fiduciari fluorescenti. Ciao, sono Chris Mariahs e lavoro presso il Dipartimento di Ingegneria Meccanica e Industriale e l'Istituto di Biomateriali e Ingegneria Biomedica dell'Università di Toronto.

Oggi vi mostreremo una procedura per fabbricare micro dispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come le cellule rispondono a una varietà di forze meccaniche in coltura in vitro. Quindi iniziamo.

Il processo di fabbricazione dello stampo a sandwich include l'applicazione di una trasparenza sopra la testa su polidimetilSloane non polimerizzato o PDMS su un master SU otto. Il panino viene posto in una pila di vetro espanso e metallo e polimerizzato in un forno sotto compressione. Infine, la pila viene smontata e la trasparenza viene rimossa mantenendo lo strato PDMS modellato.

Per iniziare questo processo miscelare accuratamente PDMS, monomero e reticolante. Nel rapporto standard di 10 a uno, depositare tre millilitri di miscela PDMS non polimerizzata su un SU otto master precedentemente fabbricato e DGA il polimero in una camera a vuoto. Quindi, posiziona il pad in schiuma e il master SU eight su una piastra di base in plexiglass.

Abbassare con cautela il lato liscio di una trasparenza a getto d'inchiostro sul PDMS non polimerizzato, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria. Quindi posizionare un vetrino in vetro siloizzato sopra la trasparenza sotto il secondo cuscinetto in schiuma e una piastra superiore in plexiglass. Fissare il panino insieme usando un morsetto a C.

Polimerizzare il panino PDMS in forno a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Dopo l'indurimento, togliete il panino dal forno e lasciatelo raffreddare. Una volta raffreddato, rimuovere la fascetta e smontare il panino.

Staccare con cura la trasparenza dal master SU eight trattenendo la pellicola PDMS brevettata. Tagliare i bordi della pellicola del modello per rimuovere il PDMS in eccesso, conservare gli strati del modello in un ambiente privo di polvere fino a quando non sono pronti per l'uso. La parte successiva di questo protocollo prevede la costruzione di una serie di micro pali ad azionamento verticale.

Per realizzare la serie di micro pali è necessario un processo di fabbricazione multistrato. Lo strato PDMS più basso e modellato viene preparato mediante fabbricazione di stampi a sandwich. Per questi esperimenti, sono stati utilizzati modelli circolari che vanno da 600 a 1.200 micron di diametro.

Per trasferire lo strato di PDMS su un vetrino pulito, utilizzare un'unità di scarica Corona per trattare il PDMS e le superfici in vetro con plasma di ossigeno. Posizionare quindi le due superfici a contatto tra loro. Posizionare la pila su una piastra calda a 80 gradi Celsius per 10 minuti per completare il processo di incollaggio.

Staccare la trasparenza e scartarla. Questo processo garantisce che il film PDMS modellato non venga mai rilasciato da un substrato rigido, il che impedisce il restringimento dei singoli strati. Il secondo strato stampato a sandwich è formato come una replica negativa dello stampo del diaframma e della struttura del palo desiderati.

In questa dimostrazione, sono stati utilizzati pali circolari di 500 micron di diametro per formare questo strato. In primo luogo, fissare temporaneamente lo stampo di replica negativa a un vetrino utilizzando del nastro biadesivo e isolarlo in un deposito essiccato sottovuoto PDMS non polimerizzato sul sandwich, strato di stampo, Degas e rivestimento di centrifuga per 45 secondi A 1000 rotazioni al minuto che producono un diaframma di azionamento di 60 micron di spessore, polimerizzare parzialmente lo strato PDMS rivestito di rotazione a 80 gradi Celsius per circa 20 minuti o fino a quando il PDMS è appiccicoso ma non si deforma in modo permanente. Quando viene toccato, rimuovere il vetrino e il nastro biadesivo dallo strato PDMS parzialmente polimerizzato e dalla pellicola trasparente fissarlo a una coppia di vetrini per la manipolazione e al plasma.

Trattare il PDMS parzialmente polimerizzato, quindi capovolgere il PDMS e posizionarlo in un allineatore personalizzato. L'allineatore è costituito da un mandrino a vuoto montato su un micromanipolatore. Successivamente il plasma tratta il primo strato PDMS, quindi lo posiziona su uno stadio rotante sotto il mandrino a vuoto.

Osserva l'allineamento tra i due livelli con un sistema di visione artificiale con zoom 12 volte avatar. Utilizzando il manipolatore, allineare gli strati e portarli con cura a contatto. Applicare una leggera pressione con un dito per incollare gli strati insieme.

Quindi rimuovere il sandwich dall'allineatore. Rimuovere le guide di manipolazione del vetro e assicurarsi che gli strati siano a pieno contatto tra loro. Polimerizzare un forno a 80 gradi Celsius per altri 30 minuti.

Dopo 30 minuti, la trasparenza e la replica dello stampo PDMS siloizzato possono essere staccati dal dispositivo e scartati. Il dispositivo viene quindi completamente polimerizzato a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore per condurre esperimenti su cellule coltivate su un substrato bidimensionale deformante. L'array di micro attuatori viene modificato legando un terzo strato PDMS al dispositivo.

Il terzo strato PDMS è costituito da una struttura a due strati. Il cerchio inferiore corrisponde alle dimensioni della cavità di azionamento sotto i micro perni azionati. Il diametro del cerchio superiore è di 100 micron maggiore del diametro dei pali di carico.

Un microcanale largo 200 micron collega queste caratteristiche a un'area di connessione e verrà utilizzato per lubrificare i montanti di carico e il film di coltura. Per modificare il dispositivo per la cultura 2D, fabbricare e collegare i connettori ad esso come descritto nel protocollo scritto. Quindi centrifugare uno strato di PDMS da 10 a 15 micron sul lato liscio di una polimerizzazione trasparente.

Il sottile film PDMS a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Il passaggio successivo consiste nell'applicare il vuoto agli attuatori e nell'incollare lo strato PDMS al dispositivo. Per raggiungere questo obiettivo.

Innanzitutto, applicare un vuoto di basso livello agli attuatori abbassando la serie di perni di trattamento e incollaggio al plasma. Il film PDMS rivestito in rotazione sul microdispositivo azionato come descritto nel protocollo scritto, i perni e il film di coltura rimarranno idrofili per un breve periodo. Quindi collegare la siringa del lubrificante al dispositivo e riempire i canali di lubrificazione con una soluzione di glicerolo al 90% in acqua deionizzata.

Oltre alla lubrificazione, questa formulazione mantiene indefinitamente l'idrofilia del PDMS riducendo i coefficienti di attrito. Posizionare il dispositivo su una piastra calda a 40 gradi Celsius e continuare a iniettare lubrificante nel canale, provocando un piccolo aumento della pressione. Dopo alcuni minuti, le bolle d'aria si sono diffuse attraverso il PDMS e tutte le superfici saranno lubrificate.

Per il passaggio finale, rimuovere la pressione negativa rilasciando i perni utilizzando un bisturi. Tagliare intorno alla pellicola sottile PDMS. Staccare con cura il supporto trasparente dal legame al plasma del dispositivo.

Una guarnizione PDMS tagliata a mano attorno all'area di coltura del dispositivo. Sterilizzare il dispositivo immergendolo in etanolo al 70% per cinque minuti, seguito da un trattamento sotto una luce UV germicida in una cabina di sicurezza biologica per 45 minuti. Plasmare, trattare la superficie e incubare con 100 microgrammi per millilitro di collagene durante la notte a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione notturna, lavare il dispositivo con soluzione salina tamponata con fosfato sterile o PBS e seminare le cellule a 10-15.000 cellule per centimetro quadrato. Seguendo i protocolli standard di coltura cellulare, l'array di microattuatori può essere modificato per condurre esperimenti per cellule coltivate in costrutti tridimensionali di idrogel con modelli fotografici. Innanzitutto, viene fabbricata una piattaforma multistrato basata su PDMS.

Dopo aver coperto la piattaforma di base con una metanfetamina, viene iniettata una soluzione precursore di idrogel vetrino in vetro. Quindi un biomateriale prenotabile in fotopolimero viene micromodellato nell'array e la soluzione precursore rimanente viene espulsa. La serie di perni di carico ad azionamento verticale può quindi essere utilizzata per applicare forze meccaniche di compressione a cellule coltivate in biomateriali tridimensionali con pezzi di nastro adesivo che mascherano le aree intorno ai perni rivestono il dispositivo con paralina C in un sistema PDS 2010 lab COTER two.

Ciò migliorerà la cinetica di polimerizzazione per il sistema di biomateriali. Una volta rivestito, rimuovere il dispositivo dal sistema di rivestimento e staccare lo scotch, lasciando uno strato conforme di paralina C sui montanti. Quindi metanfetamina vetrino di vetro ACRL per immersione in una soluzione al 2% in volume di tre trimeth oxy profile Metacrilato in etanolo al 95% per due minuti.

Risciacquare il coperchio. Inserire l'etanolo al 100%, quindi la cottura a 100 gradi Celsius, lasciando i gruppi di metacrilato sulla superficie. Fusione di un distanziatore PDMS di 200 micron di spessore.

Filmare in una capsula di Petri e tagliarla in piccole sezioni. Il plasma lega quattro di queste piccole sezioni attorno al bordo del vetrino di copertura correlato al meac. Quindi il plasma lega gli spazi alle aree PDMS del dispositivo che coprono il rivestimento Lene C.

Infine sterilizzato il dispositivo mediante lavaggio in etanolo al 70% ed esposto a germicida o luce UV in una cabina di sicurezza biologica per 45 minuti. Per modellare fotolitograficamente gli idrogel PEG carichi di cellule nei dispositivi. Preparare le soluzioni del precursore e del fotoiniziatore come descritto nel protocollo scritto e mescolarle accuratamente per ottenere una soluzione con una concentrazione dello 0,4% in peso per volume di fotoiniziatore.

Filtrare la miscela attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron per sterilizzare e rimuovere il particolato, le colture cellulari di ghiaccio di tripsina e preparare una sospensione cellulare in terreni di coltura al doppio della concentrazione di cellule finali desiderata. Quindi mescolare la sospensione cellulare e la soluzione filtrata del fotoiniziatore del precursore dell'idrogel in un rapporto uno a uno. Iniettare la soluzione nel microdispositivo utilizzando un ago lungo da 25 gauge.

Evitare accuratamente di intrappolare bolle nel dispositivo. Allineare una maschera di trasparenza stampata ai segni di allineamento sulla superficie del dispositivo. Configura un sistema di illuminazione UV per fornire una dose UV di lunghezza d'onda di 365 nanometri di 17,5 milliwatt per centimetro quadrato sulla superficie del dispositivo.

Illuminare l'idrogel attraverso la maschera per 195 secondi dopo l'illuminazione. Lavare via la soluzione precursore dell'idrogel non polimerizzato con PBS e sostituire il PBS con terreni di coltura, azionare i perni di carico per comprimere i costrutti di idrogel. Qui viene mostrato un dispositivo campione completo per la coltura meccanostimolatoria 2D.

Il colorante rosso viene utilizzato per contrassegnare i canali di erogazione della pressione di azionamento e il blu D viene utilizzato per contrassegnare la caratterizzazione della deformazione dei canali di lubrificazione. Gli esperimenti possono essere utilizzati per determinare i campi di deformazione applicati tracciando il movimento delle perle fluorescenti sui substrati. Le macchie rosse rappresentano la posizione informe delle perline, mentre le macchie verdi rappresentano le posizioni deformate.

Qui si può vedere un dispositivo campione per esperimenti di compressione tridimensionale in cui il colorante verde viene utilizzato per marcare i canali di pressione di attuazione. La vista dall'alto verso il basso del micro post array rivela il costrutto di idrogel modellato sulla parte superiore del lato del perno, immagini ricostruite di perline fluorescenti nel costrutto di idrogel. Le pressioni di azionamento a riposo e 55 kilopascal dimostrano il processo di caratterizzazione del ceppo in un sistema di coltura tridimensionale.

Quindi vi abbiamo appena mostrato come fabbricare dispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule in sistemi di coltura bidimensionali o tridimensionali. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere i dispositivi il più puliti e privi di polvere possibile e di essere pazienti, soprattutto durante le fasi di allineamento. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.