Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'ingegneria delle cellule staminali, come ad esempio il modo in cui il microambiente cellulare altera i fenotipi e la funzione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce l'ambiente multiplo creato artificialmente per le cellule in un'unica piastra che non è possibile eseguire con un metodo convenzionale in micro-piastra a contatto, dimostrando che questa procedura sarà Koki Yoshimoto e Risako Sakai tecnici del nostro laboratorio. Dopo aver creato immagini 3D di maschere per array di nano fibre e stampi da strutture microfluidiche secondo il protocollo di testo.

Usa una stampante 3D per stampare le maschere e lo stampo. Per preparare soluzioni polimeriche per l'elettrofilatura, diluire il 13% di liquido PMGI con tetraidrofurano al nove percento. Sciogliere 0,08 grammi di PS in un rapporto di volume uno a uno di THF e dimetilformammide e utilizzare un reggente liquido per portare il volume fino all'ultimo millilitro dell'otto percento di soluzione di PS in peso per volume.

Sciogliere 0,1 grammi di GT in acqua, acido acido e acetato di etile e utilizzare la soluzione solvente miscelata per portare il volume fino al millilitro finale di soluzione GT al 10% in peso per volume. Successivamente, utilizzando una macchina sputtering magnetron, depositare uno strato di platino spesso cinque nanometri su una piastra di base in polistirene che funge da catodo nella configurazione di elettrofilatura. Caricare ciascuna soluzione polimerica in una siringa da cinque millilitri dotata di un ago smussato in acciaio inossidabile calibro 23.

Quindi ancorare le siringhe su una pompa a siringa a 12 centimetri di distanza dal collettore del dispositivo di elettrofilatura. Collegare l'ago della siringa a un alimentatore ad alta tensione e impostarlo a 11 kilovolt. Quindi impostare la velocità di pompaggio a 20 millilitri all'ora e mantenere la temperatura e l'umidità rispettivamente a 30 gradi Celsius e meno del 30% in volume.

Ora metti la maschera sulla piastra di base. Quindi, attraverso i fori della maschera, fabbricare nano fibre sulla piastra di base con densità distinte modificando il tempo di elettrofilatura. Rimuovere la maschera dalla piastra di base e ripetere la fabbricazione in nano fibra.

Quando l'array è completo, metterlo in un essiccatore a 25 gradi Celsius per 16 ore per far evaporare il solvente rimanente. Per reticolare le nanofibre GT, trattarle con EDC 0,2 molari e NHS 0,2 molari in etanolo. E incubare i campioni a 25 gradi Celsius per quattro ore.

Per risciacquare le nanofibre GT, utilizzare due volte etanolo al 99,5% e asciugare le piastre sottovuoto a 25 gradi Celsius per 16 ore. Per fabbricare strutture microfluidiche, mescolare 2 grammi di agente indurente PDMS e 20 grammi di base PDMS. Quindi versare la miscela pre-PDMS sullo stampo fabbricato.

In un essiccatore degassare la miscela pre PDMS per 30 minuti. Quindi polimerizzare la miscela pre PDMS in forno a 65 gradi Celsius per 16 ore. Per assemblare gli array Macme, staccare la struttura PDMS polimerizzata dallo stampo e utilizzare il 70% di etanolo per pulirla.

Quindi scaricare la corona atmosferica sul lato inferiore della struttura PDMS. Assembla rapidamente la struttura PDMS con l'array di nanofibre. Quindi cuocere in forno l'assemblaggio a 65 gradi Celsius per due giorni.

Utilizzando DPBS lavare gli H9HESC coltivati su un piatto da 35 millimetri. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tripsina proteasi leggera ricombinante al piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per un minuto. Aspirare con cautela sulla miscela di proteasi surnatante.

Aggiungere immediatamente il terreno HPSC ed erogare delicatamente il terreno contro la superficie della piastra ripetutamente per dissociare le cellule. Quindi trasferire le cellule staccate in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare la provetta a 200 volte la gravità per tre minuti.

Aspirare il surnatante e sospendere le cellule in un terreno HPSC preriscaldato. Quindi pipettare 12 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna camera microfluidica. Dopo aver etichettato le cellule in modo fluorescente secondo il protocollo di testo, staccare la struttura microfluidica PDMS dall'array Macme.

Quindi, rimuovere il PBMS residuo dall'array Macme, aggiungere il 90% di glicerolo in PBS alle cellule colorate e applicare un vetrino coprioggetti. Infine, capovolgere la lastra sul tavolino di un microscopio a fluorescenza invertito. E usa il software di imaging del microscopio per acquisire immagini a colori a 12 bit.

Qui sono mostrate immagini di immunofluorescenza di H9HPSC coltivate ad alta densità di semina iniziale su nano fibre di gelatina e colorate con 3 marcatori fenotipici cellulari. L'analisi SOM è stata utilizzata per convertire set di dati multiparametrici ad alta dimensione in mappe 2D a bassa dimensione per confrontare l'omogeneità e l'eterogeneità dei livelli di espressione per i quattro marcatori fenotipici in ciascun set di dati ed è stato eseguito un clustering gerarchico non supervisionato per i nodi SOM. Come indicato qui, tutti i gruppi hanno mostrato un'espressione di OCT4 più elevata rispetto a quella osservata sulla matrice gel della membrana basale, o MG. Il primo gruppo ha mostrato alti segnali EdU, indicando che la maggior parte delle cellule stava proliferando attivamente.

Pertanto, i microambienti del primo gruppo erano adatti per il mantenimento delle HPSC perché le HPSC indifferenziate proliferano rapidamente quando le fasi di gap del ciclo cellulare sono state accorciate. Il secondo gruppo comprendeva cellule seminate a una densità iniziale insufficiente e cellule cresciute su scaffold GT 2D che non supportavano l'autorinnovamento HPSC. Ad esempio, il segnale EdU di questo campione è andato perso e i livelli di annessina V sono stati leggermente aumentati, indicando che le cellule avevano perso la loro staminalità ed erano gradualmente diventate apoptotiche.

PMGI MidNF HighCD del gruppo tre, che rappresenta i microambienti che comprendono le matrici di nanofibre PMGI, ha mostrato le maggiori variazioni nei segnali OCT4 e EdU rispetto alle altre condizioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali per esplorare l'ingegneria tissutale e lo screening avanzato.