Name: Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Impara a preparare l'array MACME per l'ingegneria delle cellule staminali umane pluripotenti. Questo metodo consente la manipolazione ad alto rendimento di microambienti cellulari artificiali per ottimizzare le condizioni di coltura.

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Ringraziamo la Prof. ssa N. Nakatsuji alla iCeMS, Università di Kyoto, per la fornitura di cellule umane ES. Ringraziamo anche la Prof. ssa A. Maruyama Tokyo Institute of Technology per il suo sostegno nell'uso del microscopio a forza atomica. Finanziamento è stato generosamente fornito dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); finanziamento è stato fornito anche dalla nuova energia e organizzazione di sviluppo industriale tecnologia (NEDO) e la Fondazione di Life Science di Terumo. Il WPI-iCeMS è supportato da mondo Premier International Research Centre iniziativa (WPI), il Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone. Una parte di questo lavoro è stata supportata da Kyoto University Nanotechnology Hub e l'impianto di Nano-elaborazione AIST in "Progetto di piattaforma nanotecnologie" sponsorizzato da MEXT, Giappone.

1. fabbricazione di matrice MACME
Nota: Tutti i materiali e le attrezzature sono elencati nella tabella materiali.
<ol><li>
Preparazione di maschere per una matrice di nanofibra e uno stampo per una struttura di microfluidica
	<ol>
<li>Creare immagini tridimensionali (3D) di maschere utilizzate per il nanofibra matrici e stampi per strutture di microfluidica utilizzando pacchetti software 3D-computer grafica (tabella 1). Nota: Le immagini 3D vengono letti e stampate da una stampante 3D. Le maschere stampate e muffa hanno le stesse dimensioni con immagini 3D definite utilizzando il software di grafica al punto 1.1.1.</li>
		<li>Stampare maschere e uno stampo sulla base di questi disegni utilizzando una stampante 3D. Nota: In questo protocollo, una stampante 3D di ink-jet-come con resina UV-curable era usato30. La risoluzione della stampante è stato 635 × 400 dpi e 15 µm in X, Y e Z, rispettivamente, tuttavia, la reale X, risoluzione Y era circa quattro volte inferiore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di nanofibre-matrice (Figura 3A)
	<ol>
<li>Preparare soluzioni di polimeri per elettrofilatura.<ol>
<li>Diluire il liquido PMGI 13% con tetraidrofurano 9% (p/v)22.</li>
			<li>Sciogliere 0,08 g di PS (peso molecolare medio numerico (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (rapporto 1:1 in volume)21e aggiungere THF:dimethylformamide per portare il volume fino al livello finale mL 1 (soluzione all'8% (p/v) PS).</li>
			<li>Sciogliere 0,1 g di GT in acqua: acido acetico: Etilacetato (rapporto volume 1:1.6:2.1) e aggiungere acqua: acido acetico: Etilacetato per portare il volume fino al livello finale mL 1 (soluzione al 10% (p/v) GT) come descritto23,31.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare un macchina di polverizzazione del magnetron, depositare un sottile strato di platino con uno spessore di 5 nm su un polistirene (PS) piastra di base (127.7 × 85,5 mm), che funge da catodo nel setup elettrofilatura.</li>
		<li>Caricare ogni soluzione di polimero in una siringa da 5 mL con ago smussato in acciaio inox 23-G.</li>
		<li>Posizionare e ancorare la siringa con l'ago su una pompa a siringa con 12 cm a parte il collettore del dispositivo elettrofilatura.</li>
		<li>Collegare l'ago della siringa ad un alimentatore ad alta tensione e set da applicare a 11 kV.</li>
		<li>Impostare la velocità di pompaggio di 0,2 mL/h.</li>
		<li>Mantenere la temperatura e l'umidità a 30 ° C e < 30% (v/v).</li>
		<li>Mettere la maschera sulla piastra di base preparato al punto 1.2.2.</li>
		<li>Fabbricare le nanofibre sulla piastra di base attraverso i fori della maschera con densità distinti modificando l'ora di elettrofilatura (ad es., 20, 60, 90 e 180 s).</li>
		<li>Rimuovere la maschera dalla piastra di base. Nota. Etanolo può essere spruzzato sulle nanofibre GT elettrofilate prima di rimuovere la maschera per evitare staccando le nanofibre GT insieme con la maschera.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.4-1.2.10 fino al completamento della fabbricazione di nanofibra-matrice.</li>
		<li>Inserire la matrice di nanofibra in un essiccatore a 25 ° C per 16 h per far evaporare il solvente residuo.</li>
		<li>Crosslink GT nanofibre con 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) e 0,2 M N-Idrossisuccinimide (NHS) in etanolo a 25 ° C per 4 h23.</li>
		<li>Sciacquare le nanofibre GT due volte con etanolo 99,5% (v/v) e vuoto-a secco a 25 ° C per 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fabbricazione di strutture di microfluidica (Figura 3B)
	<ol>
<li>Mescolare 2 g di PDMS indurimento agente e 20 g di base PDMS (01:10 peso rapporto; Pre-PDMS). 24
</li>
		<li>Versare il composto di pre-PDMS su stampo fabbricato al punto 1.2.</li>
		<li>De-gas la miscela di pre-PDMS in un essiccatore per 30 min.</li>
		<li>Curare la miscela di pre-PDMS in un forno a 65 ° C per 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Matrici assembly di MACME (Figura 3B)
	<ol>
<li>Staccare la struttura PDMS curata al punto 1.3.4 dallo stampo e pulito con etanolo al 70% (v/v).</li>
		<li>Trattare la scarica atmosferica corona sul lato inferiore del PDMS struttura32. Nota: In questo protocollo, la corona viene scaricata su tutta la superficie di uno strato di 3 o 4 volte con un apparato di effetto corona "Handy". Trattamento al plasma di ossigeno è stato sostituito con Scarica corona atmosferica per alterare l'adesività superficiale.</li>
		<li>Assemblare la struttura PDMS con la matrice di nanofibra rapidamente.</li>
		<li>Cuocere in forno a 65° C per 2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caricamento hESCs in MACME matrice
<ol><li>Per la coltura sistematica di H9 cellule staminali embrionali umane (hESC), mantenere le cellule in xeno-libero chimicamente definito terreno di coltura per hPSC manutenzione33 completati con 10 µM Y-27632 ROCK inibitore34 (denominato hPSC medio) in una coltura cellulare di 35 mm piatto rivestito con matrice di gel della membrana dello scantinato (MG).</li>
	<li>Cellule di passaggio ogni 4-7 giorni utilizzando una proteasi tripsina-simile ricombinante.</li>
	<li>Sterilizzare una matrice MACME con etanolo 99,5%, di caricamento negli alloggiamenti per 10 min e quindi rimuovere l'etanolo. Ripetere l'operazione 3 volte.</li>
	<li>Introdurre 12 µ l di MG, 10 µ g/mL vitronectina (VN), e 0,1% (p/v) GT nel controllo cultura chambers e incubare gli alloggiamenti a 37 ° C per 1 h a loro cappotto sulle superfici di alloggiamento. Nota: In questo protocollo, MG, VN e GT sono stati selezionati come proteine di riferimento per adesione delle cellule e la cultura. Perché MG e VN sono matrici standard di coltura cellulare per mantenere hPSC auto-rinnovamento, sono usati come controlli positivi; rivestimento di GT bidimensionale (2DGT) o non-rivestimento (NC) sono stati utilizzati come controlli negativi.</li>
	<li>Introdurre pre-riscaldato hPSC medio in tutti gli alloggiamenti della matrice MACME. Incubare gli alloggiamenti per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare H9 hESC coltivate su un piatto da 35 mm con DPBS, aggiungere 0,5 mL di una proteasi tripsina-simile ricombinante al piatto e incubare a 37 ° C per 1 min e aspirare accuratamente solo i surnatanti mescolati con proteasi. Nota: Nella fase di aspirazione, le cellule non sono staccate.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente hPSC medio, versare delicatamente il mezzo contro la superficie del piatto ripetutamente per dissociare le cellule e trasferire le cellule indipendente a un tubo conico di 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 200 x g per 3 min. aspirare il supernatante e sospendere le cellule in un mezzo di hPSC pre-riscaldato.</li>
	<li>Introdurre 12 µ l della sospensione delle cellule (1,2 × 106 cellule/mL) in ogni camera microfluidica. Nota: Introdurre le cellule per una camera da un altro utilizzando una micropipetta. Poiché il numero delle cellule seminate nelle stanze è proporzionale alla densità di colonna sopra il pavimento di camera, la densità di semina cellulare iniziale potrebbe essere controllata anche se sono stati utilizzati campioni da sospensione cellulare stesso. Garantire il pipettaggio è fatto delicatamente. Rimuovere eccesso di terreno dalle camere con un bastoncino di cotone con punta dopo il caricamento. La matrice MACME è compatibile con sistemi automatizzati pipetta e pipette da laboratorio comunemente usati, e non richiede particolari attrezzature.</li>
	<li>Cambiare la sostanza hPSC ogni 12 h e cultura per 4 giorni. Nota: Volumi di costante del mezzo (1.6, 3.2 e 6,4 µ l) vengono gestite tramite camere di diverse dimensioni. Cellule di cultura sotto una condizione statica per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio fatta eccezione per lo scambio del terreno di coltura cellulare35,36.</li>
</ol>3. quantitativo unicellulare profilatura
<ol><li>
Macchiatura delle cellule fluorescenti su piastra Nota: per analizzare i cambiamenti fenotipici di autorinnovanti hPSCs, questo protocollo selezionato tre marcatori fenotipici chiavi per questo protocollo: OCT4, 5-Etinil-2'-deoxyuridine (EdU) e Annessina V, per misurare lo stato di pluripotenza, proliferazione e apoptosi , rispettivamente (Figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) viene utilizzato per identificare i nuclei delle cellule. OCT4 è uno dei fattori di trascrizione critica di pluripotenza.<ol>
<li>Incubare H9 hESCs in matrici MACME in hPSC supplementato con alchini di EdU 10 µM a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Dopo il lavaggio con annessina-associazione buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2), macchia le celle con un coniugato di V Annexin colorante arancione fluorescente a 20 ° C per 15 min.</li>
		<li>Difficoltà cellule in PBS con paraformaldeide al 4% (v/v) a 20 ° C per 15 min e risciacquare le cellule con PBS due volte.</li>
		<li>Permeabilize celle utilizzando PBS con 0,3% (v/v) X-100 Triton a 20 ° C per 16 h. Nota: Paraformaldeide indebolisce il legame tra una piastra di base in plastica e una struttura di microfluidica PDMS. Così, il distacco dello strato PDMS dalla matrice al punto 3.2.1 può essere eseguito anche dopo questo passaggio.</li>
		<li>Incubare le cellule in tampone di reazione basata su Tris con un azoturo di colorante rosso fluorescente a 20 ° C per 30 min.</li>
		<li>Incubare le cellule in tampone bloccante (PBS con siero di capra normale 5% (v/v), siero di donkey normale 5% (v/v), albumina di siero bovino di 3% (p/v), 0.1% (v/v) di Tween-20 e 0,1% (p/v) N-dodecil-β-D-maltoside) a 4 ° C per 16 h.</li>
		<li>Incubare in PBS con 0.5% (v/v) soluzione di Triton X-100 e umano OCT3/4 anticorpo (IgG di topo) a 4 ° C per 16 h.</li>
		<li>Incubare in tampone bloccante con del anti-mouse verde fluorescente tingere-contrassegnati asino IgG (H + L) a 37 ° C per 60 min.</li>
		<li>Incubare in PBS con DAPI a 20 ° C per 30 min.</li>
		<li>Sostituire PBS-DAPI con PBS.</li>
		<li>Preservare la matrice MACME a 4 ° C fino alla acquisizione immagine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione immagini (Figura 4)
	<ol>
<li>Rimuovere la struttura di microfluidica PDMS dalla matrice MACME.</li>
		<li>Rimuovere il PBS residuo dalla matrice MACME, applicare 90%(v/v) glicerolo in PBS le cellule e posizionare i vetrini coprioggetti sopra le cellule marcate.</li>
		<li>Mettere la piastra capovolta sul palco di un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
		<li>Acquisire immagini a colori di 12 bit utilizzando automaticamente tutti i componenti motorizzati (fase, filtri, otturatore e sistemi di messa a fuoco) che sono stati controllati da un microscopio software di imaging. Nota. In questo protocollo, tempi di esposizione vengono regolati per raggiungere vicino a valori di intensità massima (massima intensità di pixel: 4096), ma non la saturazione, per ogni immagine, DAPI, OCT4, Annessina V ed EdU.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione del segnale di fluorescenza e di elaborazione delle immagini di computer-guidata (Figura 5) Nota: la seguente analisi di immagine di cella viene eseguita basata su un metodo descritto in precedenza37.<ol>
<li>Convertire immagini a colori in scala di grigi.</li>
		<li>Calcolare un valore di soglia singola per ogni immagine DAPI con il metodo Otsu e classificare pixel sopra la soglia come primo piano e di seguito come sfondo. Assicurarsi che il valore foreground corrisponde all'intensità fluorescente di DAPI. Nota: Il processo di analisi di immagine contiene 5 passi; identificazione di oggetti principali in DAPI immagini, identificazione di oggetti secondari in OCT4, Annessina V ed EdU immagini, rispettivamente e la misurazione dell'intensità di oggetto. Figura 3 fornisce le immagini dell'interfaccia di utente grafica (GUI) all'impostazione di elaborazione delle immagini.</li>
		<li>Misurare le intensità fluorescente di OCT4 ed EdU su ogni immagine.</li>
		<li>Identificare l'area macchiata con Annessina V con il metodo di propagazione e quantificare l'intensità di fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3.4. statistica analisi di visualizzare singoli fenotipi cellulari su formazione immagine singola cellula
	<ol>
<li>Normalizzare le intensità fluorescente inpue di ogni marcatore fenotipico di centratura e ridimensionamento queste variabili per dare loro uguale peso.</li>
		<li>Eseguire auto-organizzanti mappa (SOM) analisi utilizzando un ambiente software per elaborazione statistica e grafica come descritto da precedenti studi38,39.<ol>
<li>Creare 25 SOM nodi con distintivo quattro "codebook vettori" corrispondente alle intensità fluorescente di quattro indicatori, DAPI, EdU, Annessina V e OCT4.</li>
			<li>Assegnare le singole celle in ogni microambiente a un nodo (più simile) "vincente" e tracciare come frequenza di cella, in base al quale i vettori del codebook del nodo vincente vengono aggiornati utilizzando una media ponderata, in cui il peso è il tasso di apprendimento (qui, 0.05 come (impostazione predefinita). Nota: Omettere dati da camere contenenti meno di 1.000 cellule perché DataSet contenente alcune cellule non ha fornito risultati statisticamente rilevanti SOM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire il clustering gerarchico non supervisionato con i valori di SOM-nodo utilizzando il metodo di media-sollevatore basato sulla correlazione di Pearson di un clustering software40.</li>
		<li>Il rendering dei dati clustering in dendrogramma e heatmap viste41.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Questo protocollo viene illustrato il primo metodo di screening per stabilire un sistema di cultura robusta per la manutenzione di hPSCs qualificato. In primo luogo, abbiamo descritto come preparare una piattaforma con diversi ECMs artificiale e densità di semina utilizzando un dispositivo microfluidico integrato con una matrice di nanofibra, la matrice MACME cellulare. Secondo, quantitativa basata su immagine unicellulare phenotyping era eseguita50 per valutare risultati cellulari individuali e c...

Pluripotenti umane cellule staminali (hPSCs)1,2 auto-rinnovarsi illimitatamente e differenziare in varie linee cellulari del tessuto, che potrebbero rivoluzionare lo sviluppo di farmaci, terapie basate su cellule, ingegneria tissutale e medicina rigenerativa 3 , 4 , 5 , 6. cultura generale piatti e piastre di microtitolazione, tuttavia, non sono progettati per consentire la manipolazione precisa delle cellule fisiche e chimiche a livello cellulare con la gamma di nano - per micrometri, che è un fattore critico per l'espansione cellulare, auto-rinnovamento e differenziazione. Per risolvere questo inconveniente, studi hanno studiato i ruoli di microambienti cellulari nella regolazione decisioni di destino delle cellule e cellula funzioni4. Negli ultimi anni, un numero crescente di studi è stati condotti per ricostruire microambienti cellulari in vitro7,8. Processi di nano - e micro-fabbricazione hanno stabilito questi microambienti attraverso la manipolazione chimica9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e stimoli ambientali fisici18,19,20 . Fino ad ora, c'erano rapporti di indagare sistematicamente i meccanismi di fondo di stimoli ambientali chimici e fisici sulle decisioni di destino delle cellule e funzioni all'interno di una singola piattaforma.
Qui, presentiamo una strategia basata sui principi di progettazione semplice per stabilire una piattaforma di screening robusto (Figura 1). In primo luogo, descriviamo la procedura di sviluppo di una piattaforma integrata per la creazione di microambienti cellulare versatile, artificiale utilizzando una matrice di nanofibra e una struttura di microfluidica: matrice di The Multiplexed artificiale cellulare microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). La matrice di nanofibra ha 12 differenti microambienti in diverse combinazioni di materiali nanofibra e densità. Elettrofilatura è stato usato per fabbricare le nanofibre. I materiali di nanofibra, quali polistirolo (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, sono stati progettati per testare le loro proprietà chimiche, che possono pregiudicare adesione cellulare e mantenimento della pluripotenza ( Figura 2B). Nanofibra densità sono state variate cambiando tempo elettrofilatura e le nanofibre generate sono state definite secondo la loro densità (DNF, con D = XLow/bassi/medi/alti). La struttura di microfluidica è composta di polidimetilsilossano (PDMS) che harboring 48 alloggiamenti di coltura cellulare, che possono essere posizionate lungo le dimensioni standard della micropiastra 96 pozzetti. PDMS è un polimero biocompatibile e gas-exchangeable generalmente usato per fabbricare di dispositivi microfluidici24. Ogni canale di microfluidica è stato progettato per essere 700 µm di larghezza e 8,4 mm lungo e aveva due ingressi ai relativi bordi (tabella 1). La chambers ebbe diverse altezze (250, 500 e 1000 µm) per manipolare le densità iniziale delle cellule-semina (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 cellule/cm2), che potrebbero correlare con la sopravvivenza, proliferazione e differenziazione di hPSCs25 (Figura 2C). Il numero delle cellule seminate in una camera è proporzionale alla densità di colonna sopra il pavimento di camera, e così semina la densità iniziale delle cellule era controllata introducendo la stessa sospensione di cellule in alloggiamenti di cultura con diverse altezze. Tutti i canali sono stati progettati per essere ≥ 250 µm-altezza26 per minimizzare gli effetti di tensione basso ossigeno27 e shear stress28 sulle cellule. Altezze di canale di 250, 500 e 1000 µm sono abbreviate qui come XCD con X = Low, Mid e High, rispettivamente. Gli ambienti con nanofibra distinte densità e densità di semina delle cellule iniziali sono stati accorciati come "Material_NF density_Cell densità" (ad es., GT_HighNF_HighCD: un ambiente caratterizzato da nanofibre GT ad alta densità e alta cella-seeding iniziale densità).
Successivamente, descriviamo come eseguire analisi unicellulare per studiare sistematicamente il comportamento delle cellule in risposta a fattori ambientali (Figura 1B). Come un proof-of-concept, abbiamo identificato l'ambiente cellulare ottima per hPSC auto-rinnovamento, che è una funzione chiave per hPSC manutenzione (Figura 1B)29. Basata su immagine cytometry, seguita da analisi statistiche, consente di interpretazione quantitativa delle singole risposte cellulari fenotipiche agli ambienti cellulari. Tra una varietà di funzioni cellulari, questo libro fornisce una procedura dettagliata per individuare le condizioni ottimale per il mantenimento di hPSC auto-rinnovamento.

<table><tbody><tr><td>Polistirene (PS)</td><td>Sigma</td><td>#182435</td><td>Mw medio: 290.000, Mn medio: 130.000</td></tr><tr><td>Polimetilglutarimide (PMGI)</td><td>MicroChem</td><td>G113113</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (GT)</td><td>Sigma</td><td>G2625</td><td>Dalla pelle suina,</td></tr><tr><td>kit di elastomero siliconico Sylgard 184</td> di tipo A <td>Doe Corning Toray</td><td>#1064291</td><td>L'agente indurente PDMS e la base di elastomero siliconico sono componenti di questo kit.</td></tr><tr><td>OpenSCAD</td><td></td><td></td><td>Questo è un software gratuito di computer grafica 3D (http://www.openscad.org/) utilizzato per progettare lo stampo del dispositivo microfluidico.</td></tr><tr><td>AutoCAD 2014</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Si tratta di un software di computer grafica 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilizzato per la progettazione della maschera utilizzata nella preparazione di array di nanofibre.</td></tr><tr><td>Stampante 3D, AGILISTA-3000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina polimerizzabile UV, AR-M2</td><td>Keyence</td><td></td><td>Viene utilizzata per la stampa 3D da Agilista.</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>#338826</td><td>&ge; 99,99%</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma</td><td>#270989</td><td>Anidro, 99,8%</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano (THF)</td><td>Sigma</td><td>#401757</td><td></td></tr><tr><td>MSP-30T</td><td>Dispositivo</td><td></td> per vuoto <td>Magnetron sputtering machine</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#242811</td><td>Questa è una piastra di base in polistirene su cui viene creato l'array di nanofibre. Questa dimensione della lastra è in genere 127,7 x 85,5 mm.</td></tr><tr><td>Macchina a scarica corona a pistola</td><td>Shinko Electric & Strumentazione</td><td>CFG-500</td><td>Questo pratico dispositivo viene utilizzato per generare corona per l'attivazione della superficie inferiore dello strato PDMS al passaggio 1.5 "Assemblaggio degli array MACME" nel protocollo.</td></tr><tr><td>Siringa da 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato in acciaio inossidabile (calibro 23)</td><td>Nipro</td><td>#2166</td><td>Il diametro esterno e la lunghezza sono rispettivamente di 0,6 e 32 mm.</td></tr><tr><td>Alimentatore ad alta tensione</td><td>TechDempaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimmide, cloridrato</td><td>Dojindo</td><td>W001</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimide</td><td>Sigma</td><td>#56480</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>#354277</td><td>Questa proteina è indicata come matrice di gel della membrana basale nel protocollo.</td></tr><tr><td>CellAdhere Vitronectina, Umana, Soluzione</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07004</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#05940</td><td>Terreno di coltura privo di feeder e xeno per il mantenimento di cellule ES e iPS umane</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>#253-00513</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1X), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12605028</td><td>Si tratta di una proteasi ricombinante tripsina-simile per la dissociazione delle cellule di mammifero aderenti.</td></tr><tr><td>Kit di imaging Click-iT EdU con Alexa Fluor 647 Azides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10086</td><td>La marcatura fluorescente delle cellule proliferanti nella colorazione fluorescente su piastra è stata eseguita insieme al manuale del prodotto di questo kit.</td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 594 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13203</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)</td><td>abcam</td><td>ab96875</td><td>Si tratta di un anticorpo secondario utilizzato nella colorazione di cellule fluorescenti su piastra.</td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Si tratta di un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo CFI Plan Fluor 4&times;/0.13 N.A. (Nikon), fotocamera CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lampada al mercurio (Intensilight, Nikon), tavolino automatizzato XYZ (tavolino motorizzato Ti-S-ER con encoder, Nikon) e cubi filtranti per quattro canali di fluorescenza (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>Questo è un software di imaging per microscopio utilizzato per l'acquisizione automatica delle immagini.</td></tr><tr><td>CellProfiler, Versione 2.1.0</td><td></td><td></td><td>Questo è un software aperto gratuito per l'analisi delle immagini cellulari (http://cellprofiler.org/).</td></tr><tr><td>L'analisi R</td><td></td><td></td><td>SOM viene eseguita dal pacchetto kohonen di questo software. Questo è disponibile gratuitamente (https://www.r-project.org/).</td></tr><tr><td>Cluster 3.0</td><td></td><td></td><td>Questo è il software di clustering open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Con questo software viene eseguito il clustering gerarchico non supervisionato.</td></tr><tr><td>Java TreeView</td><td></td><td></td><td>Questo software open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) viene utilizzato per visualizzare i dati di clustering come una mappa di calore e un dendrogramma.</td></tr><tr><td>H9 cellula staminale embrionale umana</td><td>WiCell Stem Cell Bank</td><td>WA09</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Microambienti cellulari consistono di una varietà di segnali, quali fattori di crescita, matrici extracellulari e interazioni intercellulari. Questi spunti sono ben orchestrati e sono fondamentali nella regolazione di funzioni cellulari in un sistema vivente. Anche se un numero di ricercatori hanno tentato di studiare la correlazione tra fattori ambientali e funzioni cellulari desiderate, molto rimane sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della mancanza di una corretta metodologia di imitare tali stimoli ambientali in vitroe testare simultaneamente diversi stimoli ambientali sulle cellule. Qui, segnaliamo una piattaforma integrata di canali microfluidici e una matrice di nanofibra, seguita da analisi unicellulare ad alto contenuto, per esaminare i fenotipi di cellule staminali alterati da fattori ambientali distinti. Per illustrare l'applicazione di questa piattaforma, questo studio si concentra sui fenotipi di autorinnovanti cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Qui, presentiamo le procedure di preparazione per una matrice di nanofibra e la struttura di microfluidica nella fabbricazione di una matrice di Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME). Inoltre, procedura generale della singolo-cella profilatura, con marcatori fluorescenti multiple, multiple imaging di fluorescenza e analisi statistiche, di colorazione cellulare è descritti.

Matrici MACME: progettazione e fabbricazione: In combinazione con la tecnologia di nanofibra, abbiamo usato coltura cellulare microfluidica e screening tecniche impiegate in precedenza per identificare le condizioni ottimali per hPSC auto-rinnovamento o differenziazione35,36 (Figura 1). Questo è adatto per stabilire solide analisi cell-based di alto-rendimento perché gli alloggiamenti...

Questo articolo descrive la metodologia dettagliata per preparare una matrice Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME) per manipolazione di alto-rendimento di fisica e chimica di stecche che imita in vivo cellulare microambienti e a identificare l'ambiente cellulare ottima per le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con l'analisi di singole cellule.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'ingegneria delle cellule staminali, come ad esempio il modo in cui il microambiente cellulare altera i fenotipi e la funzione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce l'ambiente multiplo creato artificialmente per le cellule in un'unica piastra che non è possibile eseguire con un metodo convenzionale in micro-piastra a contatto, dimostrando che questa procedura sarà Koki Yoshimoto e Risako Sakai tecnici del nostro laboratorio. Dopo aver creato immagini 3D di maschere per array di nano fibre e stampi da strutture microfluidiche secondo il protocollo di testo.Usa una stampante 3D per stampare le maschere e lo stampo. Per preparare soluzioni polimeriche per l'elettrofilatura, diluire il 13% di liquido PMGI con tetraidrofurano al nove percento. Sciogliere 0,08 grammi di PS in un rapporto di volume uno a uno di THF e dimetilformammide e utilizzare un reggente liquido per portare il volume fino all'ultimo millilitro dell'otto percento di soluzione di PS in peso per volume.Sciogliere 0,1 grammi di GT in acqua, acido acido e acetato di etile e utilizzare la soluzione solvente miscelata per

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In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Un metodo combinatorio screening funzionale per ottenere approfondimenti sugli impatti della composizione molecolare di microambienti su funzioni cellulari è descritto. Il metodo si avvale di microarray esistenti basate su tecnologie per generare matrici di microambienti definite combinatorie che supportano l'adesione cellulare e analisi funzionale.

Realizzazione e utilizzo di microarrays microambiente (MEArrays)

Questo protocollo descrive la fabbricazione di una grande scala, DNA o anticorpi array bidimensionale multiplato, con potenziali applicazioni in studi di segnalazione cellulare e rilevazione biomarker.

Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori, tra cui l'architettura ambientale, l'abbondanza dei membri, i tratti e le interazioni. Questo protocollo descrive un ambiente sintetico e microfabbricato per il monitoraggio simultaneo di migliaia di comunità contenute nei pozzetti di femtoliter, in cui si possono approssimare fattori chiave come la dimensione e il confinamento di nicchia.

Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all&#39;interno di una piattaforma di array Microwell

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l'analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Il presente protocollo descrive una piattaforma sperimentale per valutare gli effetti dei segnali meccanici e biochimici sulle risposte chemioterapiche delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente in colture 3D matrix-mimetiche utilizzando un dispositivo di illuminazione UV su misura che facilita il fotocrosslinking ad alto rendimento di idrogel con caratteristiche meccaniche sintonizzabili.

Gli array di idrogel consentono una maggiore produttività per gli effetti di screening dei componenti della matrice e delle terapie nei modelli tumorali 3D

Tradizionalmente, la coltura cellulare viene eseguita su substrati planari che imitano male l'ambiente naturale delle cellule in vivo. Qui descriviamo un metodo per produrre substrati di coltura cellulare con geometrie curve fisiologicamente rilevanti e proteine extracellulari micropatternate, consentendo indagini sistematiche sul rilevamento cellulare di questi segnali extracellulari.

Generazione di microambienti cellulari multicue mediante fotopatterning UV di substrati tridimensionali di colture cellulari

Impara a preparare l'array MACME per l'ingegneria delle cellule staminali umane pluripotenti. Questo metodo consente la manipolazione ad alto rendimento di microambienti cellulari artificiali per ottimizzare le condizioni di coltura.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

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