Name: Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Lernen Sie die Messung von β-Amyloid-Toxizität in transgenen C. elegans mit temperaturinduzierbarer Muskelexpression. Diese Methode ermöglicht schnelles Screening von genetischen und pharmakologischen Modulatoren.

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Wir möchten die aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Link-Labor, die für die Protokolle dazu beigetragen, hier beschriebenen, insbesondere Gin Fonte, der das ursprüngliche Verfahren entwickelt danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von den NIH (AG12423) und der Alzheimer Association (Zenith Award) zu CDL unterstützt

1) Vorbereiten Nematode Growth Medien Platten für Lähmungen Assay. Paralysis Assays basieren auf dem Standard Nematode Growth Media (NGM) Platten routinemäßig für C eingesetzt durchgeführt elegans Vermehrung und Genetik (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave der NGM Lösung mit NaCl, Agar und Pepton in einem Erlenmeyerkolben und fügen Sie die entsprechenden Mengen an sterile CaCl 2, Uracil, Cholesterin, 1M MgSO 4 und 1 M KPO 4. Aliquot von 10 ml Flüssigkeit NGM in jeweils 60 mm x 15 mm Petrischale. Lassen NGM über Nacht erstarren bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn der Test für die Wirkungen von Verbindungen / Extrakte, Aliquot des Extraktes auf jede Platte und mit einem Spreader zur gleichmäßigen Verteilung der Auszug über die Oberfläche der Platte. Lassen Sie zu extrahieren, um über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Mehr als 1 ml benötigen mehr Zeit zum Trocknen. </li><li> Spot jede Platte mit 250 ul E. coli-Stamm OP5O in LB-Medium über Nacht bei einer optischen Dichte von 0,4-0,6 gewachsen. Lassen Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. </li></ol> Relevante Variablen Das Alter der Platten hat einen signifikanten Einfluss auf die Lähmung Assay, da ältere Platten zum Austrocknen neigen. Verwenden Platten gegossen innerhalb einer Woche nach Lähmung Assay. Für optimale Ergebnisse, Platten gießen 3-4 Tage vor Beginn der synchronen Wurm Bevölkerung [siehe (2) unten]. Für jedes Experiment, verwenden Sie nur Platten aus der gleichen Charge gegossen. Das Ändern der Größe der Rasenfläche (dh gesichtet vs Spread) und / oder die Art der Bakterien verändern auch das Verhalten der Würmer. Paralysis Assays können unter Verwendung alternativer E. werden coli-Stämme als Nahrungsquelle (z. B. das HT115 Belastung in der Fütterung RNAi-Experimente verwendet werden), aber das kann die Kinetik der Lähmung ändern und erfordern somit angemessene interne Kontrollen. 2) Herstellung von Age-Synchron-Worm Populationen Der Stamm CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aß Minigen + rol-6 (su1006) Markergen] X wird am häufigsten für die Bestimmung von Aß-induzierte Lähmungen Dieser Stamm und andere transgene Modelle stehen zur Verfügung. die akademische Forscher für eine geringe Gebühr von der Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Um das Alter Synchronität der Test Bevölkerung ist es besser, mit einem synchronisierten elterlichen Generation beginnen zu maximieren. Eine Woche vor der Einleitung des Lähmung Test des Tests Bevölkerung, mit einem Platin-Wurm-Picker auf 20-30 gravid Erwachsenen auf mehrere 10 cm NGM-Platten mit OP50 für eine 2-stündige Eiaufstrich Übertragung lag bei 16 ° C (der permissiven Temperatur für CL4176 ). Entfernen Sie die gravid Erwachsenen und damit die Nachkommenschaft zu 7 Tage lang wachsen, in welcher Zeit sie werden "zweiten Tag" gravid Erwachsene. </li><li> (Tag 1) Der zweite Tag gravid Erwachsene werden verwendet, um die alters-Synchron-Test der Bevölkerung vorzubereiten. Für jeden experimentellen Zustand des Objekts ist dreifacher Ausfertigung Platten mit 50-75 Jahren-Synchron-Würmern zu generieren. Mit einem Platin-Wurm-Picker, Transfer 10-12 der Tag 2 gravid Erwachsenen auf 60 mm (10 ml Volumen) NGM-Platten mit OP50 gesichtet. Lassen Sie die Würmer Eier bei 16 ° C lag 2 Stunden, dann wählen Sie die Erwachsenen und lassen Eier auszubrüten und wachsen bei 16 ° C. An dieser Stelle ist es am besten jemanden, der nicht sein wird Scoring die Platten, um sie Code haben, so der Torschütze wird blind sein, um experimentellen Bedingungen. </li></ol> Relevante Variablen Das Stadium der embryonalen Entwicklung, wenn Eier gelegt werden (~ der 26-Zell-Stadium für Wildtyp-Würmern unter optimalen Bedingungen) ist eine Funktion von erwachsenen Alter und Ernährung. Wenn die gravid Erwachsene zur Vorbereitung des Tests Bevölkerung genutzt ältere oder verhungert sind, wird später Eier gelegt werden, wodurch das Alter Synchronität der Bevölkerung und die Reproduzierbarkeit der Lähmung Kinetik. Es ist wichtig, als Mono-axenic (dh nur OP50 Bakterien) Kulturen verwendet werden (mikrobielle Verunreinigungen stark beeinträchtigt diesen Test) und die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn der dreifach Platten ähnliche Anzahl von Würmern haben. 3) Transgene Induktion und Paralysis Assay <ol><li> (Tag 3) Hochschalten Platten bis 25 ° C 48 Stunden nach dem Ende des Synchron-Ei legen, Würmer sollten bei der dritten Larvenstadium (L3) werden. Die Platten sollten ohne Stapeln in einem 25 ° C Inkubator, damit alle Platten bis 25 ° C zur gleichen Zeit zu erreichen arrangiert werden. </li><li> (Tag 4) Begin der Punktwertung der Lähmung der Würmer (Stamm CL4176) bei 18-20 Stunden nach Beginn der Hochschalten. Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer in der Bevölkerung das vierte Larvenstadium (L4) Stadium erreicht haben. Weiter Scoring in zwei-Stunden-Schritten, bis alle Würmer auf jede der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen ist Lähmung nicht einmal über den Körper Länge: Kopfbereich ist der letzte Teil des Wurms aufhören zu bewegen. So wORMs, die vor kurzem Lähmung eingeleitet haben nicht über die Platte zu übersetzen, sondern können ihre Köpfe zu bewegen, dabei werden Bakterien in ihrer vorderen und Verlassen eines "Halo" geräumte Bakterien. Diese Würmer werden immer völlig gelähmt, und deshalb Würmer mit Halos sind kategorisiert als gelähmt. Einige Würmer werden nicht Halos, aber auch nicht zeigen spontane Bewegung; diese werden durch Drängen mit dem Wurm Picker getestet. Wenn ein prodded Wurm nicht eingehen kann eine Ganzkörper-Wellenausbreitung auf Drängen ist es auch erzielt, wie gelähmt. Für eine effiziente Scoring, ist es am einfachsten, den gelähmten Würmer zu einer unbefleckt Sektor der Platte zu bewegen, so dass sie nicht ungewollt rescored das nächste Scoring Zeitraum. (Dies ermöglicht auch mis-kategorisiert Würmer Bewegung zeigen, so dass ein Scoring-Korrektur). </li><li> Zur Erzeugung einer Lähmung Kurve zu jedem Zeitpunkt den Anteil der Würmer auf jeder Platte, die nicht gelähmt ist, um einen Prozentsatz umgewandelt, und die durchschnittliche "unparalyzed" Prozentsatz der Zeit von Hochschalten Einleitung dargestellt. (Die Begründung für das Plotten auf diese Weise, dass die resultierende Kurve formal analog zu einem Überleben Kurve ist, und kann daher mittels Standard nicht-parametrische Statistiken Überleben werden.) </li></ol> Relevante Variablen Das Hochschalten von transgenen myo-3/Aβ Würmer auftreten müssen, bevor sie Mitte der L4 Bühne für Lähmungen erreichen eingeleitet, wie die myo-3 Promotor ist entwicklungsmäßig reguliert werden, und hat maßgeblich Ausdruck in späten L4 oder erwachsenen Würmer reduziert. Ebenso ist Ausdruck dieses Transgen blockiert, wenn Würmer ausgehungert werden, so ist es wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut genährt sind. Wir haben noch nie einen gelähmten Wurm unter allen Bedingungen zu erholen beobachtet, und nach 12-16 h Hochschalten, alle CL4176 Würmer lähmt, auch wenn sie auf 16 ° C sind heruntergeschaltet In Belastung CL4176, um eine ausreichende Hochregulation der Transgenexpression Lähmung kann bei niedrigeren Temperaturen auftreten (dh 20-25 ° C), obwohl der Zeitpunkt der Lähmung wird verändert werden. Die Lähmung ist abhängig von der spezifischen transgenen Stamm (wir haben myo-3/Aβ Stämme mit schneller und langsamer auf als CL4176 gebaut), so mit alternativen Stämme der Scoring-Fenster muss unter Umständen angepasst werden. 4) Repräsentative Ergebnisse In Abbildung 1 ist ein Grundstück von einer Lähmung Kurve für CL4176, sowohl unbehandelt und ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Endkonzentration in NGM-Platte). Diese Behandlung führt zu einer statistisch hoch signifikante Verzögerung in Lähmung von ca. 4 Stunden, die wir interpretieren als Indikator für die Unterdrückung von Aß Toxizität in diesem Modell. In Abbildung 2 ist ein unabhängiges Experiment Untersuchen der Auswirkungen von Cafestol, eine andere Verbindung in Kaffee zu finden. Dieses Grundstück ist typisch für Behandlungen, die nicht Einfluss haben Aß Toxizität. Beachten Sie, dass in beiden Versuchen etwa die Hälfte der unbehandelten CL4176 Bevölkerung bei 24 Stunden sind wie gelähmt, und die Lähmung ist komplett um 28 Stunden. Dies sind typische Zeitrahmen für die Lähmung der Kontrolle CL4176 Populationen. Wesentliche Abweichungen von diesem Zeitpunkt sind bezeichnend für veränderte Umgebungsbedingungen oder spontane Deletion der Transgen-Kopien. (CL4176 enthält eine chromosomal integrierte transgene Array mit mehreren Kopien des Transgens myo-3/Aβ. Obwohl diese transgenen Array wird in der Regel recht stabil, der die Verbreitung des Stammes bei Temperaturen&gt; 16 ° C wird für seltene Würmer, die eine unterzogen haben wählen spontane Löschung von Transgenen, die sich in Varianten, die Aß Ausdruck und langsamer Lähmung Ergebnisse reduziert werden.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Paralysis Kurve für DMS CL4176 Würmer unbehandelt oder ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Sigma). Die angegebenen Zeiten sind von der Einleitung des Temperatur Hochschalten. Fehlerbalken = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Paralysis Kurve für CL4176 Würmern ausgesetzt auf 0,48 mM Cafestol (Sigma). Fehlerbalken = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Das Protokoll wir beschrieben haben, können effektiv zum Testen der Auswirkungen von Verbindungen auf Aß Toxizität verwendet werden. Veröffentlicht Beispiele sind die Effekte von Ginkgo biloba-Extrakt Bestandteile (Wu et al. 2006) und Reserpin (Arya et al. 2009). Verbindungen, die Schutz gegen Aß Toxizität in anderen Systemen haben, haben auch gezeigt, dass sein Schutz in diesem Modell (zB Memantin, unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Ein wichtiger Grund für die Erstellung dieses Modells ist, dass die gut entwickelten genetischen und molekularen Werkzeugen in C verfügbar elegans kann verwendet werden, um Mechanismen der Aß Toxizität untersucht werden. So können die Auswirkungen spezifischer Mutationen auf Aß Toxizität untersucht (zB den Effekt der Reduzierung Insulin-like-Signalisierung durch die Einführung einer daf-2 loss-of-function-Mutation, Florez-McClure et al. 2007), und dieses Modell kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen der Überexpression Transgene (Fonte et al. 2008) zu untersuchen. Wir haben vor kurzem umfangreiche Verwendung dieses Modells gemacht, um die Auswirkungen auf die Toxizität der einzelnen Aminosäure-Substitutionen in Aß (unveröffentlichte Daten) zu untersuchen. Die transgenen Modell hier beschriebenen Tests die Wirkung einer akuten Aß Ausdruck auf Muskel-Zell-Funktion. Zur Zeit der Lähmung Muskelzellen und deren Sarkomer sind intakt; die Lähmung Phänotyp ist nicht das Ergebnis einer Muskelzelle Tod. Doch nach der Lähmung (~ 48 Stunden nach der ersten Hochschalten) gibt es einen Abbau der Muskeln, Integrität und schließlich zum Tod der Würmer. Wir haben nicht diesen nachgeschalteten Wirkung von Aß Ausdruck untersucht oder verwendet es als eine Toxizität Marker. Die induzierbare Aß Ausdruck hier beschriebene Modell ist nicht geeignet für die Untersuchung von Behandlungen, die β-Amyloid-Bildung per se modulieren. Obwohl transgene Würmer mit konstitutiver Aß Ausdruck Form leicht erkennbar Amyloid-Ablagerungen (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), transgene Würmer mit induzierbarer Aß Ausdruck selten Amyloid-Ablagerungen und die Lähmung Phänotyp scheint unabhängig von Amyloid-Ablagerung (Drake et al. 2003). Unsere Ergebnisse stimmen mit der Auffassung, dass die akute Toxizität von induzierten Aß Ausdruck ergibt sich aus der Ansammlung von löslichem oligomeren Aß, nicht Amyloid-Ablagerung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien </td><td> Quantity/2L </td><td> Unternehmen / Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 2mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> Cholesterin </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 5mg/ml in Ethanol (nicht Autoklav) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50 mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in ddH 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyerkolben </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying β-amyloid-toxizität mit hilfe eines transgenen c. elegans modell

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Akkumulation des β-Amyloid-Peptid (Aß) wird allgemein angenommen, eine zentrale Rolle bei der Induktion der Alzheimer-Krankheit, sondern den entsprechenden Mechanismus (s) der Toxizität sind noch unklar. Aß ist auch intramuskulär in Inclusion Body Myositis, eine schwere menschliche Myopathie hinterlegt. Die intensiv studiert Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann transgen entwickelt werden, um menschliche Aß Ausdruck zu bringen. Je nach Gewebe-oder Timing der Aß Ausdruck können transgene Würmer leicht messbaren Phänotypen, die als read-out von Aß Toxizität dienen. Zum Beispiel haben transgene Würmer mit pan-neuronalen Aß Ausdruck Mängel ist assoziativen Lernens (Dosanjh et al 2009.), Während transgene Würmer mit konstitutiver Muskel-spezifische Expression zeigen eine progressive, altersabhängige Lähmung Phänotyp (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Eine besonders nützliche C. elegans Modell beschäftigt temperatursensitive Mutation in der mRNA-Surveillance-System auf Temperatur-induzierbaren Muskel Ausdruck einer Aß Transgen-Ingenieur, was zu einer reproduzierbaren Lähmung Phänotyp der Temperatur Hochschalten (Link et al. 2003). Behandlungen, die gegen Aß Toxizität in diesem Modell [z. B. Ausdruck einer schützenden Transgen (Hassan et al. 2009) oder durch Einwirkung von Ginkgo biloba-Extrakten (Wu et al. 2006)] reproduzierbar verändern die Rate der Lähmung durch die Temperatur Hochschalten dieser transgenen induzierten Würmer. Hier beschreiben wir unsere Verfahren zur Messung der Geschwindigkeit der Lähmung in diesem transgenen C. elegans-Modell, mit besonderem Augenmerk auf experimentellen Variablen, dass diese Messung beeinflussen können.

Die intensiv studiert Fadenwurm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Kann transgen entwickelt werden, um die menschlichen β-Amyloid-Peptid (Aß) auszudrücken. Induzierte Expression von Aß in<em&gt; C. elegans</em&gt; Muskels führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Lähmung Phänotyp, die verwendet werden, um Behandlungen, die Aß Toxizität modulieren überwacht werden können.

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Es wird allgemein angenommen, dass die Akkumulation des $\beta$-Amyloid-Peptids (A$\beta$) eine zentrale Rolle bei der Induktion der Alzheimer-Krankheit spielt, aber die relevanten ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Toxizität des Beta-Amyloid-Peptids in einem In-vivo-Modellsystem zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und relative Einfachheit dieses Assays ermöglicht eine schnelle Prüfung von Wirkstoffen, Umweltbedingungen oder genetischen Modifikationen hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Toxizität von Beta-Amyloid. Ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung dieses Assays ist die Erzeugung transgener C. elegans-Würmer mit muskelspezifischer, temperaturinduzierbarer Expression des Beta-Amyloid-Peptids.Dieser temperatursensitive Expressionsmechanismus wird durch die Konstruktion eines Transgens erreicht, das einen ungewöhnlich langen drei-primär-unübersetzten Bereich enthält, wodurch die Transgen-mRNA ein Ziel der mRNA-Überwachung wird. Die Expression dieses Transgens ist daher in Wildtyp-Würmern mit einem funktionsfähigen mRNA-Überwachungssystem aufgrund des Abbaus der Transgen-mRNA gering. Wenn dieses Transgen in einen genetischen Hintergrund eingeführt wird, der eine Mutation in einer essentiellen Komponente des mRNA-Überwachungssystems aufweist, wird die Transgenexpression deutlich höher sein. Enthält der genetische Hintergrund eine temperatursensitive Mutation im mRNA-Überwachungssystem, so führt die Züchtung dieses transgenen Stammes bei der nicht-permissiven Temperatur zum Block des Abbaus der transgenen mRNA und resultiert in einer hohen Expression des Transgens. Transgene Würmer, die dieses System zur Regulation der Expression des Beta-Amyloid-Peptids in den Körperwandmuskeln nutzen, zeigen nach einer Temperaturerhöhung von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius eine starke Anreicherung des Beta-Amyloid-Peptids, Dysfunktion der Muskelzellen und Lähmung der Würmer. Die Messung der Zeit bis zum Eintritt dieser Effekte...Es bedarf einer Population dieser trenchgenen Würmer, um nach einer Temperaturerhöhung gelähmt zu werden. Der Upshift ist ein empfindlicher Test für die Toxizität von Beta-Amyloid. Dies wird erreicht, indem frische Nematoden-Wachstumsmedienplatten für den Lähmungstest hergestellt werden, was dazu beiträgt, Umweltfaktoren zu minimieren, die die Lähmungsraten beeinflussen können.Als zweiten Schritt werden alterssynchronisierte Populationen transgener Würmer hergestellt, um die Auswirkungen des Entwicklungsstadiums auf die Transgenexpression zu minimieren. Anschließend werden synchronisierte Larven im dritten Larvenstadium von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius hochgeschaltet, wodurch die Stabilität der Transgen-mRNA erhöht und die Anreicherung des Beta-Amyloid-Peptids begünstigt wird. Die Messung der Zeit vom Hochschalten bis zur Lähmung jedes einzelnen Wurms erfasst die Rate der Muskelbeeinträchtigung und ermöglicht so die Untersuchung der toxischen Wirkung der Anreicherung von Beta-Amyloid-Peptid. Auf diese Weise erhält man Ergebnisse, die den Einfluss spezifischer Behandlungen auf die Toxizität des endogen exprimierten Beta-Amyloid-Peptids zeigen.Der Hauptvorteil unserer Technik im Vergleich zur Verwendung transgener Mausmodelle zur Untersuchung der Wirkstoffaktivität liegt also darin, dass wir sie viel schneller und deutlich kostengünstiger durchführen können. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend. Das Auswerten von L4-Würmern in einem Lähmungsassay ist sehr schwierig zu erlernen.Wenn Sie einen gelähmten L4-Wurm bewerten, sollten Sie auf die isolierte Halo-Bewegung des Kopfbereichs des Wurms achten. Sobald dieser sich bewegt und der gesamte Körper des Wurms gelähmt ist, wird der Wurm als gelähmt gewertet. Lähmungstests werden auf Platten mit standardisiertem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM durchgeführt, das üblicherweise für die Züchtung und Genetik von C. elegans verwendet wird.Um die Platten vorzubereiten, sterilisieren Sie die NGM-Lösung, die Natriumchlorid, Agar und Peptid enthält, in einer Erlenmeyerkolben, und geben Sie anschließend die entsprechenden Mengen der folgenden sterilen Lösungen hinzu, die in der beigefügten schriftlichen Anleitung angegeben sind. Portionieren Sie jeweils 10 Milliliter flüssiges NGM in jede 60 Millimeter mal 15 Millimeter große Petrischale. Lassen Sie das NGM über Nacht bei Raumtemperatur erstarren.Wenn die Wirkung von Verbindungen oder Extrakten getestet wird, aliquotieren Sie den Extrakt auf jede Platte und verwenden Sie einen Verteiler, um ihn gleichmäßig über die Oberfläche der Platte zu verteilen. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Volumina über einem Milliliter benötigen länger zum Trocknen.Besprühen Sie anschließend jede Platte mit 250 Mikrolitern E. coli-Stamm OP50, der über Nacht in LB-Medium auf eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 gezüchtet wurde, und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Das Alter der Platte hat einen erheblichen Einfluss auf die Lähmungsrate, wobei ältere Platten dazu neigen, auszutrocknen. Die Platten sollten innerhalb einer Woche nach dem Gießen für den Lähmungstest verwendet werden.Im Idealfall sollten Sie Platten verwenden, die drei bis vier Tage vor der synchronen Eiablage vorbereitet wurden. Alle in einem Experiment verwendeten Platten sollten aus derselben Charge stammen. Eine Veränderung der Größe des Bakterienrasens und/oder der Bakterienstämme beeinflusst ebenfalls das Verhalten der Würmer. Paralyse-Assays können mit alternativen Stämmen von E. coli durchgeführt werden. Beispielsweise wird HT115 in RNAi-Experimenten verwendet. Dies kann jedoch die Kinetik des Paralyse-Assays verändern.Daher müssen Sie interne Kontrollen verwenden, die für den jeweiligen Stamm geeignet sind. CL 476 wird am häufigsten zur Untersuchung einer Beta-induzierten Paralyse eingesetzt. Dieser Stamm und andere transgene Modelle sind für akademische Forscher gegen eine geringe Gebühr vom Saint Ahadi Genetic Center erhältlich.Um die Alterssynchronität der Testpopulation zu maximieren, ist es vorzuziehen, mit einer synchronisierten Elterngeneration zu beginnen. Eine Woche vor dem Start des Paralyseassays der Testpopulation übertragen Sie mit einem Platin-Wurmabstreifer 20 bis 30 gravide adulte Tiere auf mehrere 10 cm NGM-Platten.Verteilen Sie OP 50 für eine zweistündige Eiablage bei 16 Grad Celsius, was die permissive Temperatur für CL 4 1 76 ist. Entfernen Sie die GR-Erwachsenen und lassen Sie die Nachkommen sieben Tage lang wachsen, wodurch sie am zweiten Tag erwachsene Gravitätstiere sein werden. Zweiter Tag Gravitation.Erwachsene werden verwendet, um für jede experimentelle Bedingung alterssynchrone Testpopulationen herzustellen. Das Ziel besteht darin, dreifach durchgeführte Platten mit 50 bis 75 alterssynchronen Würmern mithilfe eines Platin-Wurm-Pickers herzustellen. Übertragen Sie 10 bis 12 frisch geschlüpfte erwachsene Würmer auf 60 Millimeter große NGM-Platten, die mit OP50 beimpft sind. Lassen Sie die Würmer zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius Eier legen, entfernen Sie danach die erwachsenen Würmer und lassen Sie die Eier bei 16 Grad Celsius ausschlüpfen und wachsen.An diesem Punkt ist es am besten, wenn eine Person, die die Platten nicht auswerten wird, diese codiert, sodass die Auswertung blind gegenüber den experimentellen Bedingungen erfolgt. Der Entwicklungsstadium der Embryonen zum Zeitpunkt der Eiablage, das unter optimalen Bedingungen für Wildtyp-Würmer etwa dem 26-Zell-Stadium entspricht, hängt vom Alter und der Ernährung der erwachsenen Tiere ab. Wenn die erwachsenen Würmer, von denen die Eier stammen, älter sind oder verhungert wurden, werden später entwickelte Eier abgelegt, und es kann keine synchronisierte Population erreicht werden, was die Kinetik des Lähmungsassays beeinträchtigt.Es ist unerlässlich, monogene Bakterienkulturen wie e coli, OP 50 zu verwenden, da jegliche bakterielle Kontamination diesen Assay erheblich beeinträchtigen kann. Die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn Ihre Tripelplatten eine ähnliche Anzahl von Würmern aufweisen, um das Transgen zu induzieren und den Lähmungsassay durchzuführen. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius.48 Stunden nach dem Ende der synchronen Eiablage sollten die Würmer im dritten Larvenstadium sein. Die Platten sollten unge stapelt in einem 25 Grad Celsius warmen Inkubator angeordnet werden, damit die Platten diese Temperatur erreichen können. Gleichzeitig sollte die Erfassung der Lähmung der Würmer 18 bis 20 Stunden nach Beginn der Temperaturerhöhung begonnen werden.Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer der Population das vierte Larvenstadium erreicht haben. Setzen Sie die Auswertung im Zwei-Stunden-Takt fort, bis alle Würmer auf jeder der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen ist die Lähmung entlang der Körperlänge nicht gleichmäßig. Der Kopfbereich ist der letzte Teil des Wurms, der die Bewegung einstellt.Daher können Würmer, die kürzlich mit der Lähmung begonnen haben, sich nicht über die Platte bewegen, aber sie können ihre Köpfe bewegen, wodurch sie die Bakterien um ihre Vorderseite herum entfernen und einen Halo aus abgeräumten Bakterien hinterlassen. Diese Würmer werden zwangsläufig vollständig gelähmt sein, weshalb Würmer mit einem solchen Halo als gelähmt klassifiziert werden. Einige Würmer weisen keinen Halo auf, zeigen aber ebenfalls keine spontane Bewegung.Sie werden getestet, indem man sie mit dem Wurmpicker anstößt. Wenn eine ange stupste Wurmwesen keine vollständige Körperwellenpropagation nach dem Anstupsen durchführen kann, wird sie ebenfalls als gelähmt gewertet, um eine effiziente Auswertung zu ermöglichen. Am einfachsten ist es, die gelähmten Würmer in einen unbestrichenen Bereich der Platte zu verlegen, damit sie während der nächsten Auswertungsperiode nicht versehentlich erneut bewertet werden.Dies ermöglicht es auch falsch klassifizierten Würmern, Bewegungen zu zeigen, sodass eine Korrektur der Bewertung erfolgen kann, um eine Lähmungskurve zu erstellen. Zu jedem Zeitpunkt wird der Anteil der Würmer auf jeder Platte, die noch nicht gelähmt sind, in Prozent umgerechnet, und der durchschnittliche nicht gelähmte Prozentsatz wird über der Zeit seit Beginn des Hochschaltens aufgetragen. Die resultierende Kurve ist formal analog zu einer Überlebenskurve und kann daher mithilfe standardmäßiger nichtparametrischer Überlebensstatistiken analysiert werden.Die Hochschaltung der transgenen myo drei A beta Würmer muss bis zum mittleren L4-Stadium erfolgen, damit die Lähmung einsetzen kann. Der Myo-drei-Promotor wird entwicklungsgesteuert reguliert. Sobald die Würmer das späte L4-Stadium oder das Erwachsenenstadium erreicht haben, ist der Expressionspegel deutlich gesunken.Die Expression des Transgens wird blockiert, wenn die Würmer verhungern, daher ist es äußerst wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut gefüttert werden. Wir haben nie beobachtet, dass sich ein gelähmter Wurm unter irgendwelchen Bedingungen erholt. Nach 12 bis 16 Stunden Upshift wird CL 41 76 gelähmt sein, unabhängig davon, ob man auf 16 Grad herunterreguliert; bei Stamm CL 41 76 kann die Hochregulation der Transgenexpression, die zur Lähmung führt, bei niedrigeren Temperaturen auftreten.Beachten Sie jedoch, dass sich die Paralyserate in ihrer zeitlichen Abfolge ändert. Die Paralyserate hängt von der verwendeten spezifischen Transgen-Sorte ab. Wir haben myo-drei-A-beta-Sorten konstruiert, die eine schnellere und langsamere Paralyserate im Vergleich zu CL4176 aufweisen, weshalb Sie Ihr Auswertungszeitfenster für den Paralysetest entsprechend anpassen müssen.Hier ist ein Diagramm einer Lähmungskurve für CL 4 1 76 gezeigt, sowohl unbehandelt als auch nach Exposition gegenüber 6,27 Millimolar Koffein. Diese Behandlung führt zu einer statistisch hochsignifikanten Verzögerung der Lähmung um etwa vier Stunden, was wir als Hinweis auf eine Unterdrückung der Beta-Toxizität interpretieren. In diesem Modell wurde mit diesem Experiment die Wirkung eines weiteren in Kaffee enthaltenen Verbindungsstoffes untersucht.Die Kurve ist typisch für Behandlungen, die keine Wirkung auf eine Beta-Toxizität haben. Beachten Sie, dass in beiden Experimenten etwa die Hälfte der unbehandelten CL 4 1 76-Populationen nach 24 Stunden gelähmt ist und die Lähmung nach 28 Stunden vollständig ist. Dies sind typische Zeitrahmen für die Lähmung der Kontrollen.Bei Populationen von CL 4 1 7 6 weisen signifikante Abweichungen von diesem Zeitpunkt auf veränderte Umweltbedingungen oder einen spontanen Verlust von Transgenkopien hin. Weitere Informationen über den Stamm CL 4 1 76 finden Sie im begleitenden Protokoll. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Alter der Platten, das Entwicklungsstadium der Wurmpopulation und die Fähigkeit zur Erfassung der Lähmungsrate der Würmer zu berücksichtigen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie dieses Sea Elgan-System verwenden können, um die Toxizität von Beta-Amyloid sorgfältig zu untersuchen. Sie sollten in der Lage sein, recht subtile Effekte dieser Toxizität durch verschiedene Umwelt- oder Wirkstoffbehandlungen nachzuweisen. Die Variablen, über die wir gesprochen haben, sind wichtig, da sie es Ihnen ermöglichen, den Assay sehr reproduzierbar durchzuführen und eine konsistente Paralyse-Kinetik zu erzielen.Dies ist tatsächlich sehr wichtig, wenn Sie Ihre in Ihrem Labor zu verschiedenen Zeitpunkten und von verschiedenen Personen erhaltenen Ergebnisse vergleichen möchten oder Ihre Ergebnisse mit denen anderer Forscher, die dieses Modellsystem verwenden, vergleichen wollen.

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