Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Toxizität des Beta-Amyloid-Peptids in einem InVivo-Modellsystem zu testen. Die Reproduzierbarkeit und relative Einfachheit dieses Assays ermöglicht eine schnelle Prüfung von Arzneimitteln, Umweltbedingungen oder genetischen Veränderungen auf die Beta-Amyloid-Toxizität. Ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung dieses Assays ist die Erzeugung von transgenen Klonwürmern mit muskelspezifischer temperaturinduzierbarer Expression des Beta-Amyloid-Peptids.

Diese temperaturempfindliche Expression wird durch die Konstruktion eines Transgens hergestellt, das eine ungewöhnlich lange untranslatierte Region mit drei Primzahlen enthält, was Transgen-mRNA zu einem Ziel der mRNA-Überwachung macht. Die Expression dieses Transgens ist daher bei Wildtyp-Würmern mit einem funktionellen mRNA-Überwachungssystem aufgrund des Abbaus der Transgen-mRNA schlecht. Wird dieses Transgen in einen genetischen Hintergrund eingeführt, der eine Mutation in einem wesentlichen Bestandteil des mRNA-Überwachungssystems enthält, ist die Transgenexpression deutlich höher. Wenn der genetische Hintergrund eine temperaturempfindliche Mutation im mRNA-Überwachungssystem enthält, dann blockiert die Vermehrung dieses trenchgenen Stammes bei der nicht permissiven Temperatur den Abbau von Trench-Gen-mRNA und führt zu einer hohen Trench-Genexpression bei Trench-Würmern, die dieses System verwenden, um die Körperwandmuskelexpression der Beta-Amyloid-Peptid-Temperaturerhöhung von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius zu regulieren. führt zu einer hohen Akkumulation des Beta-Amyloid-Peptids, einer Dysfunktion der Muskelzellen und einer Lähmung der Würmer.

Es braucht eine Population dieser grabengenen Würmer, um nach der Temperatur gelähmt zu werden. Upshift ist ein sensitiver Assay für Beta-Amyloid-Toxizität. Dies wird durch die Herstellung frischer Nematoden-Wachstumsmedienplatten für den Lähmungsassay erreicht, die dazu beitragen, Umweltvariablen zu minimieren, die die Lähmungsraten beeinflussen können.

Als zweiter Schritt werden alterssynchronisierte Populationen von Trenchgenwürmern oder initiiert, wodurch die Auswirkungen des Entwicklungsstadiums auf die Transgenexpression minimiert werden. Als nächstes wird im synchronisierten dritten Larvenstadium von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius hochgeschaltet, was die Stabilität der transgenen mRNA erhöht und zur Akkumulation des Beta-Amyloid-Peptids führt. Durch die Messung der Zeit von der Hochschaltung bis zur Lähmung für jeden Wurm wird die Rate der Muskeldysfunktion erfasst, wodurch die toxischen Wirkungen der Beta-Amyloid-Peptid-Akkumulation untersucht werden. Es werden Ergebnisse erzielt, die die Wirkung spezifischer Behandlungen auf die Toxizität von endogen exprimierten Beta-Amyloid-Peptiden zeigen.

Der Hauptvorteil unserer Technik im Gegensatz zur Verwendung transgener Mausmodelle zur Untersuchung der Wirkstoffaktivität besteht also darin, dass wir unsere Technik viel schneller und viel kostengünstiger durchführen können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Die Bewertung von L-4-Würmern in einem Lähmungsassay ist sehr schwer zu erlernen.

Wenn Sie also einen gelähmten L-Four-Wurm bewerten, sollten Sie sich die isolierte Halo-Bewegung der Kopfregion des Wurms ansehen. Sobald sich das bewegt und der gesamte Körper des Wurms gelähmt ist, würden wir diesen Wurm als gelähmt einstufen. Lähmungsaufsätze werden auf Platten mit Standard-Nematoden-Wachstumsmedien oder NGM durchgeführt, die routinemäßig für die Vermehrung und Genetik von CL egan verwendet werden.

Um die NGM-Lösung, die Natriumchlorid, Agar und Peptid enthält, in einem Erlenmeyerkolben autoklavieren zu lassen, fügen Sie dann die entsprechenden Mengen der folgenden sterilen Lösungen hinzu, die in dem begleitenden schriftlichen Protokoll zu finden sind. Aliquotieren Sie 10 Milliliter flüssiges NGM in jede 60 Millimeter x 15 Millimeter große Petrischale. Lassen Sie das NGM über Nacht bei Raumtemperatur erstarren.

Wenn Sie auf die Wirkung von Verbindungen oder Extrakten testen, aliquotieren Sie den Extrakt auf jede Platte und verteilen Sie ihn mit einem Streuer gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Volumina über einem Milliliter benötigen mehr Zeit zum Trocknen.

Anschließend wird jede Platte mit 250 Mikrolitern E-Coli-Stamm OP 50 bestückt, die über Nacht in LB-Medien auf eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 gezüchtet wurden, und die Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen. Das Alter der Platte hat einen signifikanten Einfluss auf die Lähmungsrate, so dass ältere Platten zum Austrocknen neigen. Die Platten sollten innerhalb einer Woche nach dem Lähmungstest gegossen werden.

Im Idealfall möchten Sie Platten verwenden, die drei bis vier Tage vor der synchronen Eiablage gegossen wurden. Die Platten, die in jedem Experiment verwendet werden, sollten alle aus derselben Charge stammen, was die Größe des Rasens verändert und/oder die Bakterien verändern auch das Verhalten der Würmer. Lähmungstests können mit alternativen E-Coli-Stämmen durchgeführt werden. Zum Beispiel wird HT one 15 in RNAi-Experimenten verwendet. Dies kann jedoch die Kinetik des Lähmungsassays verändern.

Daher müssen Sie interne Kontrollen verwenden, die der Belastung angemessen sind. CL 476 wird am häufigsten zur Beurteilung einer beta-induzierten Lähmung verwendet. Dieser Stamm und andere transgene Modelle stehen akademischen Forschern gegen eine geringe Gebühr vom Saint Ahadi Genetic Center zur Verfügung.

Um die Alterssynchronität der Testpopulation zu maximieren, ist dies vorzuziehen. Beginnen Sie mit einer synchronisierten Elterngeneration. Eine Woche vor Beginn des Lähmungstests der Testpopulation verwenden Sie einen Platin-Wurmsammler, um 20 bis 30 verschüttete erwachsene Tiere auf mehrere 10 Zentimeter große NGM-Platten zu übertragen.

Mit OP 50 zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius ablegen, was der zulässigen Temperatur für CL 4 1 76 entspricht. Entferne die GR-Erwachsenen und lasse die Nachkommen sieben Tage lang wachsen, bis sie am zweiten Tag im Grab sind. Schwerkraft am zweiten Tag.

Erwachsene werden verwendet, um die alterssynchronen Testpopulationen für jede experimentelle Bedingung vorzubereiten. Das Ziel besteht darin, dreifache Platten mit 50 bis 75 alterssynchronen Würmern mit einem Platin-Wurmsammler zu erzeugen. Übertragen Sie 10 bis 12 des Tages, zwei gravierendere adulte Platten auf 60 Millimeter NGM-Platten, die mit OP 50 gesichtet wurden. Lassen Sie die Würmer zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius Eier legen, nehmen Sie dann die erwachsenen Tiere heraus und lassen Sie die Eier bei 16 Grad Celsius schlüpfen und wachsen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es am besten, jemanden zu haben, der die Platten nicht bewertet, um sie zu codieren, so dass die Punktzahl für experimentelle Bedingungen blind ist. Das Stadium der Embryonalentwicklung, in dem die Eier gelegt werden, das unter optimalen Bedingungen etwa dem 26-Zellen-Stadium für Wildtyp-Würmer entspricht, ist eine Funktion des Alters und der Ernährung des Erwachsenen. Wenn die für die Eiablage verwendeten adulten Tiere älter oder ausgehungert sind, werden später Eier gelegt und die synchrone Population wird nicht erreicht, wodurch die Kinetik des Lähmungsassays beeinflusst wird.

Es ist wichtig, dass monogene Bakterienkulturen wie z.B. e coli, OP 50 verwendet werden, da bakterielle Kontaminationen jeglicher Art diesen Assay stark beeinträchtigen können. Die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn Ihre dreifachen Platten eine ähnliche Anzahl von Würmern aufweisen, um das Transgen zu induzieren und den Lähmungstest durchzuführen. Platten auf 25 Grad Celsius hochschalten.

48 Stunden nach dem Ende der synchronen Eiablage sollte sich der Wurm im dritten Larvenstadium befinden. Die Platten sollten ohne Stapeln in einem 25 Grad Celsius heißen Inkubator angeordnet werden, damit die Platten diese Temperatur erreichen können. Beginnen Sie gleichzeitig mit der Bewertung der Lähmung der Würmer 18 bis 20 Stunden, nachdem die Hochschaltung eingeleitet wurde.

Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer in der Population das vierte Larvenstadium erreicht haben und in Zwei-Stunden-Schritten weiter bewerten, bis alle Würmer auf jeder der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen verläuft die Lähmung nicht gleichmäßig über die gesamte Körperlänge. Die Kopfregion ist der letzte Teil des Wurms, der sich nicht mehr bewegt

Würmer, die kürzlich eine Lähmung eingeleitet haben, können also nicht über die Platte übersetzen, sondern ihren Kopf bewegen, wodurch Bakterien um ihren Vorderreifen herum beseitigt werden und ein Heiligenschein aus beseitigten Bakterien hinterlassen wird. Diese Würmer werden ausnahmslos vollständig gelähmt und daher werden Würmer mit Halos als gelähmt bezeichnet. Einige Würmer haben keinen Halos, zeigen aber auch keine spontanen Bewegungen.

Diese werden getestet, indem sie mit dem Wurmsammler angestoßen werden. Wenn ein angestoßener Wurm beim Anstoßen keine volle Körperwellenausbreitung durchlaufen kann, wird er für eine effiziente Bewertung ebenfalls als gelähmt gewertet. Am einfachsten ist es, die gelähmten Würmer in einen ungefleckten Sektor der Platte zu bringen, damit sie in der nächsten Wertungsperiode nicht ungewollt erneut gewertet werden.

Dies ermöglicht es auch falsch kategorisierten Würmern, Bewegungen zu demonstrieren, was eine Bewertungskorrektur ermöglicht, um eine Lähmungskurve zu erzeugen. Zu jedem Zeitpunkt wird der Anteil der Würmer auf jeder Platte, die nicht gelähmt wurden, in einen Prozentsatz umgerechnet, und der durchschnittliche beispiellose Prozentsatz wird gegen die Zeit ab dem Zeitpunkt aufgetragen, an dem die Hochschaltung eingeleitet wurde. Die resultierende Kurve ist formal analog zu einer Überlebenskurve und kann daher mit Hilfe von nicht-parametrischen Standard-Überlebensstatistiken analysiert werden.

Die Hochschaltung der transgenen Myo drei A beta Würmer muss bis zur Mitte L vier Stufe durchgeführt werden, damit die Lähmung eingeleitet werden kann. Der Myo-3-Promotor wird entwicklungsreguliert. Sobald die Würmer das späte L-4-Alter oder das Erwachsenenalter erreicht haben, ist das Expressionsniveau signifikant verringert.

Die Expression des Transgens wird blockiert, wenn die Würmer ausgehungert werden, daher ist es sehr wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut gefüttert werden. Wir haben noch nie einen gelähmten Wurm beobachtet, der sich unter irgendwelchen Bedingungen erholt hat. Nach 12 bis 16 Stunden Hochschalten wird CL 41 76 gelähmt, unabhängig davon, ob Sie es auf 16 Grad Dehnung herunterschalten, CL 41 76 Hochregulierung der Transgenexpression, die Lähmungen verursacht, kann bei niedrigeren Temperaturen auftreten.

Bitte beachten Sie jedoch, dass die Lähmungsrate in ihrem Timing beeinflusst wird. Die Lähmungsrate hängt vom verwendeten Transgenstamm ab. Wir haben myo drei A-Beta-Stämme entwickelt, die eine schnellere und langsamere Lähmungsrate als der CL 41 76 aufweisen, und daher müssen Sie Ihr Bewertungsfenster für den Lähmungsassay entsprechend anpassen.

Hier ist ein Plot einer Lähmungskurve für CL 4 1 76 gezeigt, sowohl unbehandelt als auch mit 6,27 millimolar Koffein exponiert. Diese Behandlung führt zu einer statistisch hochsignifikanten Verzögerung der Lähmung von etwa vier Stunden, was wir als Hinweis auf eine Unterdrückung einer Beta-Toxizität interpretieren. In diesem Modell untersuchte dieses Experiment die Auswirkungen einer anderen Verbindung, die im Kaffee vorkommt.

Das Diagramm ist typisch für Behandlungen, die keinen Einfluss auf eine Beta-Toxizität haben. Es ist zu beachten, dass in beiden Experimenten etwa die Hälfte der unbehandelten CL 4 1 76-Populationen nach 24 Stunden gelähmt ist und die Lähmung nach 28 Stunden abgeschlossen ist. Dies sind typische Zeitrahmen für eine Lähmung der Kontrolle.

CL 4 1 7 6 Populationen signifikante Abweichungen von diesem Zeitpunkt deuten auf veränderte Umweltbedingungen oder eine spontane Deletion von Transgenkopien hin. Weitere Informationen zum Stamm CL 4 1 76 finden Sie im beigefügten Protokoll. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, das Alter der Platten, das Stadium der Wurmpopulation und die Fähigkeit, die Lähmungsrate der Würmer zu bewerten, im Auge zu behalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie dieses See-Elgan-System verwenden können, um die Beta-Amyloid-Toxizität sorgfältig zu testen. Sie sollten in der Lage sein, recht subtile Auswirkungen auf diese Toxizität einer Vielzahl von Umwelt- oder Arzneimittelbehandlungen zu erkennen. Es ist wichtig, auf die Variablen zu achten, über die wir gesprochen haben, da dies Ihnen ermöglicht, den Assay sehr reproduzierbar und mit einer konsistenten Lähmungskinetik durchzuführen.

Dies ist sehr wichtig, wenn Sie Ihre Ergebnisse vergleichen möchten, die zu unterschiedlichen Zeiten von verschiedenen Personen in Ihrem Labor erstellt wurden, oder wenn Sie Ihre Ergebnisse mit anderen Forschern vergleichen möchten, die dieses Modellsystem verwenden.