Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode für den Anbau einer induzierbaren Flachssorte unter Bedingungen zu demonstrieren, die zu vererbbarer genomischer Variation führen. Darüber hinaus werden genomische Veränderungen überwacht und das Wachstum der induzierten Pflanzen in den nachfolgenden Generationen unter den verschiedenen Umweltbedingungen beobachtet. Um dies zu erreichen, wird Flachs unter einer Vielzahl von induzierenden Bedingungen angebaut.

Blatt- und Maris-Stängelgewebe wird dann zu verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums der Pflanzen unter den verschiedenen Umgebungen gesammelt. Als nächstes werden DNA und RNA aus den Gewebeproben isoliert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die PCR unter Verwendung der DNA-Proben und Q-R-T-P-C-R unter Verwendung der isolierten RNA durchzuführen, um genomische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression zu identifizieren, die aus dem Wachstum unter verschiedenen Umweltbedingungen resultieren.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, um die genomische Reaktion auf Wachstumsbedingungen mit dem Auftreten des LIS-Insertionselements an einem bestimmten Punkt im Genom und Expressionsunterschieden, die mit dem Vorhandensein dieses Elements verbunden sind, zu zeigen, wie sie durch PCR und R-T-P-C-R sichtbar gemacht werden, die mit Nukleinsäure durchgeführt wurden, die aus dem Gewebe behandelter Pflanzen isoliert wurde. Hallo, ich bin Chris Cull vom Department of Biology an der Case Western Reserve University. Ich bin Cory Johnson vom Cull Lab.

Und ich bin Tiffany Moss, auch aus dem Cull Lab. Und ich bin Marshall Lucas. Ein Student im Sommerprogramm für die Forschung im Cull-Labor.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen im Genom und in der Genexpression zu untersuchen, die sich aus Variationen in der Wachstumsumgebung ergeben. Also lasst uns loslegen. Um Flachs unter induzierenden Bedingungen anzubauen, beginnen Sie damit, Fünf-Zoll-Töpfe mit Erde zu füllen und zu festigen.

Als nächstes pflanze du drei Leinsamen pro Topf, einen Viertelzoll tief. Dann aus dem Boden über die Samen für die nicht induzierenden Kontrollbedingungen. Gieße die Pflanzen mit 100 Millilitern einer Wunder-Grow-Lösung der 10. Stärke.

Behandeln Sie die Pflanzen unter hohen Nährstoffbedingungen mit 100 Millilitern voller Stärke. Wunder wachsen. Zum Schluss anwenden.

Leiten Sie Wasser nur zu den nährstoffarmen Pflanzen. Lass die Pflanzen im Sommer unter natürlichem Licht wachsen, während die Pflanzen wachsen. Gießen Sie alle Pflanzen mit einem automatischen Sprühsystem zweimal täglich für fünf Minuten.

Wenden Sie die Wachstumsbedingungen einmal pro Woche auf die Pflanzen an. Sammeln Sie die Blätter in wöchentlichen Abständen zu Mari-Stängeln. Sechs Blätter werden für die DNA-Extraktion gesammelt, und drei Me-Stängel werden für die RNA-Extraktion nach der Entnahme benötigt, geben Sie das Pflanzenmaterial in ein Kryo-Fläschchen, frieren Sie es schnell in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie extrahiert werden.

Die drei Genotypen wachsen je nach den Bedingungen unterschiedlich schnell. Unter Kontrollbedingungen wächst am besten die Inzucht-Flachssorte Storm oder die PL-Linie. Von diesem Elternteil wurden mehrere Linien abgeleitet, wobei eine große oder L-Sorte wüchsiger war als die kleine oder S-Sorte.

Bei niedrigem Nährstoffgehalt wächst S jedoch besser als L oder pl. Und unter nährstoffreichen Bedingungen wächst L besser als pl, das nur geringfügig besser wächst als S.Ein Vergleich zwischen den einzelnen Linien, die unter den drei unterschiedlichen Behandlungen angebaut werden, zeigt, dass PL unter kontrollierten Bedingungen am besten wächst. L wächst am besten unter nährstoffreichen Bedingungen, und S wächst in ähnlicher Weise sowohl unter nährstoffreichen als auch unter Kontrollbedingungen.

Diese Daten zeigen, dass die drei Linien anhand ihres Wachstums in den drei Umgebungen unterschieden werden können. Während PL und L unter bestimmten Umgebungen besser wachsen, wächst S unter allen drei Bedingungen etwa gleich. S ist nicht in der Lage, die verbesserten Nährstoffbedingungen zu nutzen, ist aber besser in der Lage, unter sehr nährstoffarmen Bedingungen zu wachsen.

Für die DNA-Extraktion Puffer, AP einen aus der Qiagen, DNEZ-Pflanze, DNA-Vorbereitungskit auf sechs Blätter mit sterilem Sand in einem Mikrofuge-Röhrchen geben, das Gewebe mit einem Mikrostößel zerkleinern, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Setzen Sie die Extraktion fort, indem Sie die Anweisungen des Kits befolgen, um mit dem Transfer der RNA-Extraktion zu beginnen, drei Maris-Stängel plus einige umgebende Blätter aus einem Kryo-Fläschchen zur Lagerung in ein Mikro-Fuge-Röhrchen. Geben Sie sterilen Sand in die Tube und mahlen Sie das Gewebe mit einem Mikrostößel, bis es fein gemahlen ist.

Wirbeln Sie die Probe 15 Sekunden lang vor, um die Lyse zu unterstützen, und drehen Sie sie dann eine Minute lang mit 13.000 U/min, um Sand und Schmutz zu sammeln. Geben Sie das SNAT in die Spin-Säule und fahren Sie mit der RNA-Vorbereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Sobald die RNA aus dem Gewebe extrahiert ist, werden 10 XDNA-Puffer bei einem Zehntel des RNA-Probenvolumens zur Reaktion übertragen.

Und bei 30 Einheiten D Ns inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Führen Sie eine reverse Transkription mit dem Applied Biosystems RNA to CD NA Kit durch. Inkubieren Sie die Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers und S eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und dann fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Lassen Sie schließlich fünf Mikroliter des CDNA auf ein 1,5%iges AROS-Gel laufen, um die Ausbeute zu bestimmen. Sobald die Flachs-CD NA hergestellt wurde, wird sie für die QPCR verwendet. Führen Sie die QPCR mit einem A BI Step 1-System durch.

Führen Sie alle Assays für jeden Lauf in dreifacher Ausfertigung durch und verwenden Sie das Housekeeping-Gene Acton als Kopienzahlkontrolle, um die Reaktionen für die QPCR vorzubereiten. Geben Sie einen Mikroliter des entsprechenden Primerpaares in jede Tube. Verdünnen Sie die CD NA auf die entsprechende Konzentration und geben Sie neun Mikroliter in jedes Röhrchen.

Zum Schluss geben Sie 10 Mikroliter der beiden x cyberg green PCR Mastermix in jedes Röhrchen. Richten Sie als Nächstes das Verstärkungsprogramm nach der Verstärkung ein. Berechnen Sie die relativen Ausdruckspegel aus der Zyklusnummer für den Schwellenwert, die durch die Standardparameter in der Step One-Software bestimmt und durch Inspektion der Verstärkungskurven bestätigt wird.

Die PCR-Amplifikation aus der DNA, die aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang des Stängels isoliert wurde, zeigt das Auftreten eines DNA-Fragments mit einer einzigen Kopie von 5,7 Kilobasen, das als Linieneinführungssequenz oder LIS bezeichnet wird, wenn die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen angebaut werden. LIS eins tritt auf, wenn PL unter nährstoffarmen Bedingungen angebaut wird und schließlich homozygot wird. Hier. Die Blattproben eins bis sechs wurden in wöchentlichen Abständen isoliert, wobei die erste Probe die früheste war, nachdem die Näh-DNA aus den Proben extrahiert wurde.

PCR-Amplifikation zeigt das Vorhandensein beider Termini von LAS, eins in allen Proben mit Ausnahme der ersten. Dies entspricht dem Verschwinden der eingefügten Stelle und keinem Nachweis davon durch die QPCR des fünften Blattes. Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von LAS 1 oder anderen genomischen Veränderungen, die mit der Induktion verbunden sind, die Expression von Genen in unmittelbarer Nähe eines S beeinflussen.

Die sechs hier gezeigten Gene sind alle differentiell in PL und S exprimiert. Vier der Gene haben eine höhere Expression in pl, das LIS nicht hat. Umgekehrt haben zwei eine höhere Expression in S, die LIS eins hat. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man induzierbare Flachslinien züchtet. Das Genom verändert sich also als Reaktion auf die Wachstumsumgebung und die Wachstumsmerkmale der nachfolgenden Generationen.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Wachstumsbedingungen repliziert werden müssen, um eine reproduzierbare Induktion von Veränderungen zu ermöglichen. Das war's also. Ich weiß, dass viele von euch diesem Phänomen skeptisch gegenüberstehen, aber jetzt könnt ihr die Beobachtungen selbst reproduzieren.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.