Name: Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Nährstoffstress genomische Variationen in Flachs induziert und das LIS-1-Insertionselement Wachstumsanpassungen beeinflusst. Diese Methode nutzt PCR und Q-RT-PCR zur Analyse genetischer Veränderungen.

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1. Das Wachstum der Flachs unter induzierenden Bedingungen. <ol><li> 5 "Töpfe mit Erde gefüllt und bestätigt. </li><li> Drei Samen pro Topf gepflanzt ¼ Zoll tief und der Boden gefestigt über die Samen. </li><li> Die Töpfe werden dann mit 100 ml der entsprechenden Nährlösungen getränkt <ol><li> Die nicht-induzierende Kontrolle (C) Bedingungen mit einem 1 / 10 th Stärke Miracle-Gro jede Woche. Der hohe Nährstoffgehalt Zustand (NPK-Behandlung) war voller Stärke Miracle Wachsen angewandt wöchentlich. Low Nährstoff - Pflanzen hatten nur Leitungswasser während ihres Wachstums eingesetzt. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li> Die Pflanzen sind unter natürlichem Licht im Sommer gewachsen. Im Winter sind sie unter Natrium-Lampen mit einer 16 / 8 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus entwickelt. </li><li> In wöchentlichen Abständen Blätter und Meristeme gesammelt werden. </li><li> Das Pflanzenmaterial ist schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren. </li></ol> Ergebnisse Die drei Genotypen wachsen bei unterschiedlichen relativen Preise abhängig von den Bedingungen (Abbildung 1). Deshalb unter Kontrollbedingungen der Pl Linie wächst am besten mit L als kräftiger als S (Abbildung 1a). Bei schwachem Nährstoffe (Wasser), wächst S besser als entweder L oder Pl (Abb. 1b). Unter hohem Nährstoffgehalt (NPK) L wächst besser als Pl, die wächst nur geringfügig besser als S (Abbildung 1c). Ein Vergleich zwischen den einzelnen Linien unter den drei unterschiedlichen Behandlungen gewachsen ist in Abbildung 1 d gezeigt - f. Pl wächst am besten unter Kontrollbedingungen (Abbildung 1d), L am besten unter hohen Nährstoffgehalt (Abbildung 1e) und S ebenfalls sowohl unter hohen Nährstoff-und Kontrollbedingungen (Abbildung 1f). Diese Daten zeigen, dass die drei Linien auf der Grundlage ihres Wachstums unter den drei Umgebungen unterschieden werden können. Zu beachten ist, dass Pl besten wächst unter der Kontrolle Bedingungen während L wächst am besten unter der NPK Bedingungen (unter denen es induziert wurde). S wächst etwa die gleiche in allen drei Bedingungen, das heißt, es ist nicht in der Lage, die Vorteile der verbesserten Nährstoff-Bedingungen stattfinden, sondern ist besser in der Lage, unter sehr nährstoffarmen Bedingungen wachsen. Das Wachstum Parameter, die für die Differenzierung der Pflanzen sind auch die Höhe der Pflanze (und damit verbunden die Internodienlänge, dass der Abstand zwischen jedem Blatt ist), das Blatt Größe und dem Grad der Verzweigung. Für Pl unter Kontrollbedingungen der Anlage ist groß mit Niederlassungen und die Blätter sind groß und dunkelgrün. Bei schwachem Nährstoffe der Pflanze sehr kurz ist, ist der Abstand zwischen jedem Blatt auch sehr kurz und die Blätter sind klein und hellgrün. Die Blätter an der Spitze sind dunkler grün als die weiter unten den Stamm. Unter hohem Nährstoffe der Pflanze sehr ähnlich sieht, dass unter Kontrolle, außer dass beide den Hauptstamm und die Seitentriebe kürzer als in der Kontroll-Pflanzen sind. Für die große genotroph die Pflanzen sehen sich sehr ähnlich zu denen von Pl, außer dass das stärkste Wachstum in unter hohem Nährstoffe. Auch bei geringen Nährstoffe der Pflanze ist sehr kurz und hat hellgrüne Blätter. Die S genotroph wächst ähnlich wie in allen drei Umgebungen, obwohl die Blätter leichter grün sind unter den niedrigen Nährstoffe. Doch in den nährstoffarmen Bedingungen der S genotroph ist viel kräftiger als die beiden Pl oder L-Linien. 2. RNA-und DNA-Extraktion aus Flachs Meristeme und Blätter sind separat erfolgen. Die Roche-Gesamt-RNA prep Kit wurde für die RNA-Extraktion und die Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit wurde für die DNA-Extraktionen verwendet. RNA-Extraktion <ol><li> 3 Meristeme sowie einige umliegende Blätter sind von der Lagerung Kryoröhrchen in Eppendorf-Röhrchen bewegt und platziert in flüssigem Stickstoff bis zur fertig geschliffen werden. </li><li> Sterile Sand ist zu Röhrchen gegeben und Gewebe unter Verwendung einer Mikropistill bis gut. </li><li> 400 ul Lyse / Bindungspuffer aus Roche Gesamt-RNA prep Kit zugegeben und Gewebe wird weiter an Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind. </li><li> Die Probe wird gevortext, 15 Sek. lang um Lyse Hilfe und dann versponnen für 1 min bei 13.000 rpm, um Sand und alle Ablagerungen sammeln. </li><li> Der Überstand wird hinzugefügt, um Spalte Spin und den Rest der RNA prep Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen. </li></ol> DNAse Behandlung <ol><li> 1 / 10 RNA-Probe von 10X DNAse-Puffer zugegeben. </li><li> 30 Einheiten DNAse zugegeben und die Reaktion wird bei 37 ° C für 30 min und 70 ° C für 5 min. </li></ol> Reverse Transkription <ol><li> Applied Biosystems RNA zu cDNA-Kit ist nach Richtungen, Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde und 95 ° C für 5 Minuten. Verwendet </li></ol> Die cDNA wird dann in PCR oder für die qPCR eingesetzt qPCR qPCR wurde mit einem ABI Step One-System. Alle Assays wurden in dreifacher Ausführung auf jedem Lauf durchgeführt. Die Aktin-Gen wurde als Kopienzahl Kontrolle verwendetdie besten verfügbaren Housekeeping-Gen. <ol><li> Die entsprechende Primerpaar wurde zu jedem Röhrchen in 1μl aufgenommen. </li><li> Die cDNA wurde auf die geeignete Konzentration und 9μl verdünnt hinzugefügt, um jedes Rohr </li><li> 10 &amp;mgr; l der 2x Power SYBR Green PCR Mastermix (ABI) und wurde in jedes Röhrchen gegeben </li><li> Das Programm Verstärkung Programm war: <ul><li> 10 Minuten bei 95 ° C </li><li> 40 Zyklen von 15sec bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C </li></ul> Thermische Denaturierung der Amplifikation Spezifität zu überprüfen </li><li> Die relative Expression wurden durch den Wert von 2 (- CTactin CTunknown) bestimmt. </li></ol> DNA-Präparation <ol><li> Buffer AP1 von Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit ist auf 6 Blätter mit sterilem Sand in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgenommen. Das Gewebe wird mit Mikropistill Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind. </li><li> Das Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen. </li></ol> Ergebnisse PCR-Amplifikation von DNA aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang der Stammzellen isoliert zeigt, dass das Erscheinungsbild der LIS-1, während die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen (4) wachsen auftritt. Der qPCR Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von LIS-1 (oder anderen genomischen Veränderungen mit der Induktion verbunden) die Expression von Genen beeinflusst in unmittelbarer Nähe der LIS-1 (Abbildung 2). Die sechs Gene in Abbildung 2 dargestellt sind alle unterschiedlich in Pl und S mit vier mit höheren Ausdruck in PL (ohne LIS-1) und zwei mit höheren Ausdruck in S (was LIS-1 haben) ausgedrückt. Panel 1 und 2 sind die beiden Gene am nächsten an der Einfügemarke der LIS-1. Die Expression dieser Gene s in den großen genotroph (die Änderungen bewogen hatte, aber nicht LIS-1) und die Expression unter verschiedenen Wachstumsbedingungen wird benötigt, um eine kausale Beziehung zwischen LIS-1 und der Gesichtsausdruck verändert sich zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Pl, L und S unter drei verschiedenen Nährstoffen Regimes geworden. Panels a - Kontrolle, b - geringe Nährstoffe und c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Panels d - f von links nach rechts: low Nährstoffe, Kontrolle und NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Daumenfigur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2 Daumen"> Abbildung 2. Genexpression um die Ansatzstelle des LIS-1. Gene 1 (Inhibitor des Wachstums) wird sofort 5 'LIS1 und das Gen 2 (Kip-bezogene Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor-ID 3 "des LIS-1. Die anderen Gene sind alle auf dem gleichen Gerüst (~ 500kb) aus dem eingebauten komplette Flachs Genomsequenz. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">klicken Sie hier, um eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. PCR Amplifikationen von DNA aus einzelnen Blättern von Pflanzen von Stormont Cirrus unter nährstoffarmen Bedingungen angebaut extrahiert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% Agarose-TBE-Gel aufgetrennt. Die uninserted Standort Gremium wird gezeigt, sind die beiden Enden des eingefügten Seiten in Panels b und c gezeigt Blattproben von 1 bis 6 wurden in wöchentlichen Abständen mit Probe 1 wird frühestens nach der Aussaat isoliert.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

Flachs scheint ein instabiles Genom haben. Eine Reihe von kommerziellen Faserflachs Sorten schnell ungleichmäßig, wenn für ein paar Generationen gewachsen. Die gleichen Beobachtungen scheinen nicht zu halten für die Öl-Flachssorten wahr. Deshalb scheint es einen Zusammenhang zwischen der Wahl für Faserqualität und Genominstabilität werden. Die umweltbedingten vererbbare Veränderungen in Flachs wurden ursprünglich durch die Untersuchung der agronomischen Beobachtungen des Wachstums der Faser Ernte identifiziert. Diese wiederholbare Beobachtungen von spezifischen phänotypischen und genomische Varianten stellt sich die Frage, wie ökologische Belastung kann die Suite von genomischen Umlagerungen, die auftreten können beeinflussen. Das wiederholte Auftreten von LIS-1 in Reaktion auf bestimmte Umgebungen steht im Einklang mit dieser Mutation, die direkt oder indirekt gewählt. Das Wachstum der Linien durch verschiedene Behandlungen induzierten zeigt auch eine verbesserte Leistung im Rahmen der einschlägigen induzierenden Bedingungen. Die Veränderungen in der Expression auch mit der Anwesenheit von LIS-1 wieder verbunden zeigt, dass diese Insertion-Anlage die Leistung beeinträchtigen. Die Video-Präsentation bietet ein Forum zur Beobachtung der Pflanzen phänotypische Veränderungen in einer Art und Weise unmöglich, durch traditionelle gedruckte Material zu vermitteln.

<ul><li> Leinsamen der ursprünglichen Stormont Cirrus Vielfalt bezeichnet Pl und die genotrophs L und S. </li><li> 5 &quot;Töpfe </li><li> Blumenerde </li><li> Miracle-Gro </li><li> Gewächshaus </li><li> Natriumdampf-Hochdrucklampen Lichter </li><li> Flüssiger Stickstoff </li><li> Mörser und Stößel </li><li> Micropestles und Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> Thermocycler </li><li> Agarosegelelektrophorese Ausrüstung </li><li> Digital Imaging-Setup </li><li> StepOne qPCR-Modul </li><li> Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit </li><li> Applied Biosystems RNA zu cDNA-Kit </li><li> Roche Gesamt-RNA prep kit </li></ul>

umweltfreundliche induced vererbbare veränderungen in flax

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Einige Flachs Sorten Nährstoff Stress reagieren, indem Sie ihr Genom und diese Änderungen können über viele Generationen vererbt werden. Auch bei diesen genomischen Veränderungen verbunden sind vererbbare phänotypische Variationen 1,2. Der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder bleiben induzierbarer (unter der Kontrolle Bedingungen), oder werden stabil geändert, um die große oder kleine genotroph durch das Wachstum bei hohen oder niedrigen Nährstoff-Bedingungen jeweils entweder. Die Linien, die sich aus der anfänglichen Wachstum unter jeder dieser Bedingungen scheinen besser wachsen, wenn unter den gleichen Bedingungen in den nachfolgenden Generationen gewachsen, vor allem die Pl Linie wächst am besten unter der Kontrolle der Behandlung darauf hinweist, dass die Pflanzen sowohl unter den hohen und niedrigen Nährstoffe unter sich Stress. Einer der genomischen Veränderungen, die mit der Induktion von vererbbaren Veränderungen verbunden sind, ist das Auftreten von ein Einsatzelement (LIS-1) 3, 4, während die Pflanzen unter den Nährstoff Stress wächst. Im Hinblick auf diese Insertion, der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder unverändert bleiben (unter der Kontrolle Bedingungen), die Einfügung in alle Pflanzen erscheinen (bei geringen Nährstoffen) und haben diese übertragen an die nächste Generation, oder das Einfügen (oder Teile davon) erscheinen, aber nicht über Generationen (unter hohem Nährstoffe) 4 übertragen werden. Die Häufigkeit des Auftretens dieser Einfügung zeigt an, dass es unter positiver Selektion, die auch im Einklang mit dem Wachstum Reaktion in den nachfolgenden Generationen ist. Blätter oder Meristeme in den verschiedenen Stadien des Wachstums geerntet werden für die DNA-und RNA-Isolierung verwendet. Die RNA wird verwendet, um Unterschiede in der Expression mit den verschiedenen Wachstums-Umgebungen und / oder t er Anwesenheit / Abwesenheit von LIS-1 assoziiert zu identifizieren. Die isolierte DNA wird verwendet, um die Anlagen, in denen das Einsetzen aufgetreten identifizieren.

Wachsende etwas Flachs Sorten unter Nährstoff-Stress führt zu genomischen Variation innerhalb einer Teilmenge der Genom-und phänotypische Variation. Eine komplexe Insertion an einem bestimmten Ort ist mit einem Wachstum unter verschiedenen Nährstoffe Regimes und mit Veränderungen in der Genexpression um diese Site verknüpft ist.

Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Einige Flachsvarietäten reagieren auf Nährstoffstress durch Modifikationen ihres Genoms, und diese Modifikationen können über viele Generationen hinweg vererbt werden. Zudem ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Kultivierung einer induzierbaren Flachssorte unter Bedingungen zu demonstrieren, die vererbbare genomische Variation hervorrufen. Außerdem werden genomische Veränderungen überwacht und das Wachstum der induzierten Pflanzen in nachfolgenden Generationen unter verschiedenen Umweltbedingungen beobachtet. Um dies zu erreichen, wird Flachs unter einer Vielzahl an induzierenden Bedingungen kultiviert. Anschließend werden Blatt- und Maris-Stängelgewebe zu verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums der Pflanzen unter den unterschiedlichen Umweltbedingungen gesammelt. Danach werden DNA und RNA aus den Gewebeproben isoliert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, PCR mit den DNA-Proben und Q-R-T-PCR mit der isolierten RNA durchzuführen, um genomische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression zu identifizieren, die aus dem Wachstum unter verschiedenen Umweltbedingungen resultieren.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die genomische Antwort auf Wachstumsbedingungen zeigen, mit dem Auftreten des LIS-1-Insertionselements an einer bestimmten Stelle im Genom und expressionsbezogenen Unterschieden, die mit der Präsenz dieses Elements assoziiert sind, sichtbar gemacht durch PCR und Echtzeit-PCR, die mit aus den Geweben behandelter Pflanzen isolierter Nukleinsäure durchgeführt wurden. Hallo, ich bin Chris Cull vom Fachbereich Biologie der Case Western Reserve University. Ich bin Cory Johnson aus dem Cull-Labor.Und ich bin Tiffany Moss, ebenfalls aus dem Cull-Labor. Und ich bin Marshall Lucas, ein Bachelorstudent im Sommerforschungsprogramm am Cull-Labor.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um genomische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression zu untersuchen, die sich aus Variationen der Wachstumsbedingungen ergeben. Beginnen wir also. Um Lein unter induzierenden Bedingungen zu kultivieren, füllen Sie zunächst Töpfe mit einem Durchmesser von fünf Zoll mit Erde und verdichten diese.Nächste Pflanze, drei Leinsamen pro Topf, eine Viertelzoll tief. Anschließend Erde über die Samen geben für die nicht induzierenden Kontrollbedingungen. Bewässern Sie die Pflanzen mit 100 Milliliter einer zehntelstarken Miracle-Gro-Lösung.Behandeln Sie die Pflanzen unter hohen Nährstoffbedingungen mit 100 Milliliter voller Stärke. Miracle Grow. Schließlich auftragen.Nur Leitungswasser zu den nährstoffarmen Pflanzen geben. Die Pflanzen während des Wachstums im Sommer unter natürlicher Beleuchtung kultivieren. Alle Pflanzen zweimal täglich für jeweils fünf Minuten mit einer automatischen Sprühanlage bewässern.Wenden Sie die Wachstumsbedingungen einmal pro Woche an den Pflanzen an. Sammeln Sie die Blätter wöchentlich in Mari-Stängeln. Für die DNA-Extraktion werden sechs Blätter gesammelt und für die RNA-Extraktion nach der Sammlung werden drei Me-Stängel benötigt. Geben Sie das Pflanzenmaterial in ein Kryo-Röhrchen, gefrieren Sie es schnell in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie extrahiert werden.Die drei Genotypen wachsen je nach Bedingungen mit unterschiedlichen relativen Wachstumsraten. Unter Kontrollbedingungen wächst die inzüchtige Leinsorte Storm bzw. die PL-Linie am besten. Mehrere Linien wurden von diesem Elter ausgeleitet, wobei eine große oder L-Varietät kräftiger wächst als die kleine oder S-Varietät.Doch unter geringen Nährstoffbedingungen wächst S besser als entweder L oder pl. Und unter hohen Nährstoffbedingungen wächst L besser als pl, das nur geringfügig besser wächst als S. Ein Vergleich zwischen den jeweiligen Linien, die unter den drei unterschiedlichen Behandlungen kultiviert wurden, zeigt, dass PL unter Kontrollbedingungen am besten wächst. L wächst am besten unter hohen Nährstoffbedingungen, und S wächst unter hohen Nährstoffbedingungen und Kontrollbedingungen ähnlich gut.Diese Daten zeigen, dass die drei Linien anhand ihres Wachstums unter den drei Umgebungen unterschieden werden können. Während PL und L unter bestimmten Umgebungen besser wachsen, wächst S in allen drei Bedingungen etwa gleich. S kann sich verbesserte Nährstoffbedingungen nicht zunutze machen, ist jedoch unter sehr geringen Nährstoffbedingungen besser in der Lage zu wachsen.Für die DNA-Extraktion Puffer AP1 aus dem Qiagen DNEasy Plant DNA Gewinnungskit zusammen mit sechs Blättern und sterilem Sand in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und das Gewebe mit einem Mikrostab bis zur Auflösung aller Klumpen homogenisieren. Die Extraktion gemäß den Anweisungen des Kits fortsetzen. Für den Beginn der RNA-Extraktion drei Maisstängel sowie umgebende Blätter aus einer Lagertube (Kryoröhrchen) in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Sterilen Sand zum Röhrchen hinzufügen und das Gewebe mit einem Mikrostab fein mahlen.Vortexen Sie die Probe 15 Sekunden lang, um die Lyse zu unterstützen, und zentrifugieren Sie sie anschließend eine Minute bei 13.000 U/min, um Sand und jegliche Rückstände zu pelletieren. Geben Sie den SNAT auf die Säule und fahren Sie gemäß den Herstelleranweisungen mit der RNA-Präparation fort. Sobald die RNA aus dem Gewebe extrahiert ist, geben Sie 10 XDNA-Puffer in einem Zehntel des RNA-Proben-Volumens zur Reaktion hinzu.Und bei 30 Einheiten DNs die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von fünf Minuten bei 70 Grad Celsius. Führen Sie die Reverse Transkription mit dem RNA-zu-CDNA-Kit von Applied Biosystems gemäß Hersteller- und S-Anweisungen durch. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und anschließend fünf Minuten bei 95 Grad Celsius.Abschließend werden fünf Mikroliter der cDNA in einem 1,5 %igen AROS-Gel zur Bestimmung der Ausbeute laufen gelassen. Sobald die Lein-cDNA hergestellt wurde, wird sie für die qPCR verwendet. Führen Sie die qPCR mit einem ABI StepOne-System durch.Führen Sie alle Assays in jeder Durchführung im Dreifachansatz durch und verwenden Sie das Housekeeping-Gen Actin als Kopienzahlkontrolle, um die Reaktionen für die QPCR vorzubereiten. Geben Sie ein Mikroliter des entsprechenden Primerpaares in jedes Reaktionsgefäß. Verdünnen Sie die DNA auf die geeignete Konzentration und geben Sie neun Mikroliter zu jedem Reaktionsgefäß hinzu.Fügen Sie schließlich 10 Mikroliter der zweifachen Cybergreen-PCR-Mastermix-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu. Richten Sie danach das Amplifikationsprogramm gemäß der Amplifikation ein. Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus anhand der Zyklenzahl für die Schwelle, die durch die Standardparameter der Step-One-Software bestimmt und durch Überprüfung der Amplifikationskurven bestätigt wird.Die PCR-Amplifikation aus der DNA, die aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang des Stängels isoliert wurde, zeigt das Auftreten eines einzelnen 5,7 Kilobasen langen DNA-Fragments, das als Insertionssequenz der Linie oder LIS eins bezeichnet wird, wenn die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen gezüchtet werden. LIS eins erscheint, wenn PL unter nährstoffarmen, induzierenden Bedingungen gezüchtet wird, und wird schließlich homozygot. Hier wurden Blattproben eins bis sechs in wöchentlichen Abständen isoliert, wobei Probe eins die früheste nach der Aussaat war. Anschließend wurde die DNA aus den Proben extrahiert.Mittels PCR-Amplifikation lässt sich das Vorhandensein beider Termini von LAS one in allen Proben nachweisen, mit Ausnahme der ersten Probe. Dies entspricht dem Verschwinden der nicht eingefügten Insertionsstelle, wobei bis zum fünften Blatt mittels QPCR kein Hinweis auf deren Existenz mehr vorliegt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von LAS one oder anderer genomischer Veränderungen, die mit der Induktion assoziiert sind, die Expression von Genen in unmittelbarer Nähe von S one beeinflusst.Die sechs hier gezeigten Gene werden alle unterschiedlich in PL und S exprimiert; vier der Gene weisen eine höhere Expression in pl auf, das LIS nicht besitzt. Umgekehrt zeigen zwei Gene eine höhere Expression in S, das LIS besitzt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man induzierbare Flachslinien züchtet. Demnach verändert sich das Genom als Reaktion auf die Wachstumsumgebung sowie die Wachstumseigenschaften der nachfolgenden Generationen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Wachstumsbedingungen repliziert werden müssen, um eine reproduzierbare Induktion von Veränderungen zu gewährleisten. Das war's. Ich weiß, dass viele von Ihnen diesem Phänomen gegenüber skeptisch sind, doch nun können Sie die Beobachtungen selbst reproduzieren.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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