Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von (p)ppGpp-Nukleotiden, die aus stressinduzierten Bakterien isoliert wurden

Beginnen Sie mit radioaktiv markierten Nukleotidextrakten, die vor und nach der Stressinduktion aus einer Bakterienkultur gewonnen wurden.

Unter Stress wandeln bakterielle Enzyme Guanosintriphosphat und Guanosindiphosphat in stressinduzierte Nukleotide Guanosinpentaphosphat und Guanosintetraphosphat um.

Spotten Sie die Extrakte auf eine Dünnschicht-Chromatographieplatte, die mit einem kationischen Polymer als stationärer Phase vorbeschichtet ist.

Stellen Sie die Platte in eine Kammer, die einen Puffer als mobile Phase enthält, und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit unter dem Spot bleibt, um eine frühe Diffusion zu verhindern.

Lassen Sie den Puffer durch Kapillarwirkung aufsteigen, indem Sie die negativ geladenen Nukleotide basierend auf ihrer Ladung und Größe in unterschiedliche Banden aufteilen.

Entfernen Sie nach der Entwicklung die Platte, trocknen Sie sie an der Luft und schneiden Sie die Oberseite ab, um freie Isotope zu eliminieren und das Hintergrundsignal zu reduzieren.

Setzen Sie die Platte einem strahlungsempfindlichen Bildschirm aus, um das radioaktive Signal zu erkennen.

Erhöhte Spiegel von Guanosintetraphosphat und Guanosinpentaphosphat nach Stressinduktion zeigen dynam