Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu Phosphotransferenzymen zu beantworten, einschließlich Enzymsubstratspezifität und Reaktionskinetik. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle Erfassung mehrerer Datensätze ermöglicht, die sehr konsistent sind und eine statistisch robuste Quantifizierung der Enzymaktivität ermöglichen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es viel einfacher zu demonstrieren als zu erklären ist, die Reaktionen auf die TLC-Platten zu erkennen und die radioaktiven Arten in den Reaktionen zu quantifizieren.

Neben Astha wird Asia Poudel, eine weitere Studentin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie dieses Protokoll mit induzierbarer Überexpression eines Histidin-getaggten Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie einen Milliliter Nickel-Nittriloessigsäureharz in einer Gravitationssäule vor, um das Protein zu reinigen.

Am Tag vor dem Gebrauch, gleicht die Säule über Nacht bei vier Grad Celsius mit zwei MilliliterN Gleichgewichtspuffer aus. Am nächsten Tag bringen Sie die Säule von vier Grad Celsius auf Raumtemperatur, bevor Sie das geklärte Lysat beladen und etwa zwei bis drei Stunden stehen lassen. Dann das Pellet im Lysepuffer wieder aussetzen.

Sonicatdie Zellen auf Eis für 10 mal 10-Sekunden-Intervalle, Pausieren 30 Sekunden zwischen den Impulsen. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 3 080 mal g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit einer Mikrozentrifuge. Bereiten Sie das geklärte Lysat mit gleichen Mengen lysepuffer numerisch vor, wenden Sie dann das vorbereitete, geklärte Lysat auf die Säule an und sammeln Sie den Durchfluss.

Wenden Sie den geklärten Lysatdurchfluss erneut auf die Säule an und sammeln Sie den sekundären Durchfluss. Dann waschen Sie die Säule mit fünf Milliliter Waschpuffer ein sund sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule erneut mit fünf Milliliterwaschpuffer zwei und sammeln Sie den Durchfluss.

Wenden Sie nun zwei Milliliter Elutionspuffer an. Sammeln Sie den Durchfluss in zwei Bruchteilen von je einem Milliliter. Bei der Proteinreinigung ist die Aufnahme von Magnesiumchlorid in die Reinigungspuffer, eine Änderung des Herstellerprotokolls, für die enzymatische Aktivität unerlässlich.

Um die Proteinreinigung durch SDS-PAGE qualitativ zu bewerten, führen Sie 20 Mikroliter-Aliquots aller Spaltenfraktionen auf einem 4%-Stacking aus, 10%laufendes Polyacrylamid-Gel für 60 Minuten bei 170 Volt. Färben Sie das Gel mit 0,1%Coomassie blau bei Raumtemperatur für fünf Stunden, schaukeln sanft auf einem Tisch Rocker. Dann das Gel in 40%Methanol-10%Eisessigsäure über Nacht bei Raumtemperatur destainieren und auf der Tischplatte Schaukeln.

Dialyse die eluierte Fraktion zwei gegen Dialysepuffer im Verhältnis 200:1 mit einem Ein-Milliliter-Dialysegerät mit einem 20-Kilodalton-Molekulargewicht über Nacht bei vier Grad Celsius. Bestimmen Sie die Konzentration der dialysierten Proteinprobe, indem Sie die Absorption bei 280 Nanometern messen und den berechneten Molaren-Aussterbekoeffizienten verwenden. 100-Mikroliter-Aliquots der dialysierten Proteinprobe bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung lagern.

Vor der Reaktion bereiten Sie PEI-Zellulose-Dünnschichtchromatographieplatten vor, indem Sie sie in entionisiertem Wasser waschen. Die Platten in eine Glaskammer mit doppelt destilliertem Wasser bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern legen. Nachdem Sie das Wasser an die Spitze der Platte wandern lassen, die Platten aus der Glaskammer holen und auf einem Tischträger über Nacht trocknen lassen.

Markieren Sie die getrockneten Platten zwei Zentimeter von einer Kante mit einem weichen Bleistift, um anzugeben, wo die Proben für TLC angewendet werden. Bei Proben mit zwei Mikrolitern Proben nicht weniger als einen Zentimeter voneinander entfernt anwenden. Lassen Sie bei der Planung von Experimenten immer einen Fleck auf jeder Platte ungenutzt, um als leere Spur für die Probenquantifizierung zu dienen.

Um den Enzymaktivitätstest durchzuführen, bereiten Sie individuelle Reaktionen mit Gamma P32 ATP vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie die RSH hinzu, nachdem die anderen Komponenten gemischt wurden, da die Zugabe von RSH zum Nukleotid-haltigen Mix den enzymatischen Aktivitätstest einleitet. Um die ATP-Hydrolyse von der kontaminierenden Nukleaseaktivität zu steuern, montieren Sie eine 10-Mikroliter-Reaktion, die kein Protein enthält, und inkubieren Sie sie parallel.

Erkennen Sie Zwei-Mikroliter-Proben bei T gleich Null und am Ende des Experiments, um sicherzustellen, dass ATP ohne Protein nicht hydrolysiert wurde. Unmittelbar nach Zugabe von RSH zwei Mikroliter entfernen und auf der beschrifteten PEI-Zelluloseplatte erkennen, da die T einer Null-Minuten-Probe entspricht. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius, wodurch zwei Mikroliter Aliquots zu den gewünschten Zeitpunkten entfernt werden.

Nachdem alle Aliquots gesammelt wurden, führen Sie eine Dünnschichtchromatographie durch, indem Sie die Chromatographiekammer mit 1,5-molaren monobasisem Kaliumphosphat bis zu einer Tiefe von 0,5 Zentimetern füllen. Tauchen Sie den unteren Rand der Platte in Lösungsmittel ein und lassen Sie das Lösungsmittel über ca. 90 Minuten an die Plattenoberseite wandern. Entfernen Sie die Platte aus dem Chromatographietank und legen Sie sie auf einen Tischtrockner, um sie über Nacht zu trocknen.

Nachdem die Platte trocken ist, wickeln Sie die Platte in Kunststofffolie, um eine Übertragung radioaktiven Materials auf die Bildkassette zu vermeiden und durch Autoradiographie zu analysieren. Setzen Sie die PEI-Zelluloseplatte mit getrennten Reaktionen auf eine Phosphorimagerkassette für vier Stunden bei Raumtemperatur aus. Zeigen Sie nach der Belichtung die Kassette auf einem Phosphorimager ab.

Zeichnen Sie mithilfe von Bildverarbeitungssoftware mit grafischer Benutzeroberfläche Interessenbereiche oder ROIs, indem Sie zuerst Ein Rechteck zeichnen auswählen, und verwenden Sie dann die Maus, um rechteckige ROIs um eine ganze Spur zu zeichnen, und die IN dieser Spur enthaltenen ATP- und Guanosin-Tetraphosphat-Spots. Verwenden Sie die Befehle Auswählen, Kopieren und Einfügen, um identische ROIs innerhalb der anderen Fahrspuren zu zeichnen, um sicherzustellen, dass die ROIs das Signal in identischen Bereichen in jeder Spur messen. Fügen Sie ROIs aus einer nicht verwendeten Spur ein, die als Leerzeichen verwendet werden soll.

Wählen Sie mit den Befehlen Analysieren, Tools, ROI-Manager, Hinzufügen der Imaging-Software alle ROIs aus, die auf der PEI-Zelluloseplatte gezeichnet werden. Verwenden Sie nun die Befehle Analysieren, Messen festlegen, Messen, um die Signalintensität innerhalb jedes ROI zu quantifizieren und die Messungen als Spreadsheeet zu exportieren. Subtrahieren Sie in der Kalkulationstabelle leere ROI-Werte von experimentellen Signalen.

Die Konvertierung der Daten in das prozentuale Guanosin-Tetraphosphat-Synthetisierte ist entscheidend, da es sicherstellt, dass Datensätze, die an verschiedenen Tagen mit unterschiedlichen Proteinchargen oder verschiedenen Gamma-P32-ATP gesammelt werden, konsistent sind und für statistische Strenge gepoolt werden können. Diese Karikatur zeigt, wie Interessensgebiete verwendet werden, um eine Spur zu definieren, die das gesamte radioaktive Signal in einer Probe und die Komponente radioaktive ATP- und Guanosintetraphosphat-Regionen von Interesse enthält. ATP- und Guanosin-Tetraphosphatsignale werden auf das Gesamtsignal normalisiert, anstatt die absoluten Werte zu melden, da Pipettierfehler oder Zerfall des radioaktiven Substrats das Gesamtsignal in der Probe beeinflussen können, aber nicht die Enzymaktivität beeinflussen.

Hier ist eine tatsächliche TLC-Platte einer Reaktion mit gereinigtem C.difficile RSH. Eine Kontrollreaktion, die kein Protein enthält, ermöglicht die Quantifizierung der nicht katalysierten ATP-Hydrolyse, während eine leere Spur eine genaue Signalquantifizierung ermöglicht. In den ATP- und Guanosin-Tetraphosphat-Spots überträgt das Enzym das radioaktive Phosphat vom ATP-Substrat auf den BIP-Vorläufer und erzeugt radioaktives Guanosintetraphosphat.

Dies bestätigt, dass die vermeintliche Guanosintetraphosphatsynthetase von C.difficile ein aktives Enzym ist. Durch die Probenahme der Reaktion in Intervallen kann der Fortschritt beobachtet werden. Hier wird das Rohsignal zu jedem Zeitpunkt beobachtet.

ATP nimmt ab und Guanosintetraphosphat nimmt zu. Hier sind die normalisierten Daten zu sehen. Die Fehlerbalken sind viel kleiner, da die Normalisierung für pipettierende Fehler verursacht.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Harz auf der TLC-Platte nicht zerkratzt wird, da dies die Lösungsmittelmigration beeinträchtigen kann. Dies ist eine sehr zugängliche Technik mit einfacher Datenanalyse, die schnell eine robuste Quantifizierung der Enzymaktivität ermöglichen kann. Wir haben es verwendet, um zu bestätigen, dass Clostridium difficile Guanosintetraphosphat synthetisiert, das noch nie zuvor berichtet wurde.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann, und Sie müssen die Regeln Ihrer Institution für die Lagerung und Verwendung radioaktiver Materialien befolgen, während Sie dieses Verfahren durchführen. Diese Methode kann Einblick in Guanosin Tetraphosphat-Synthese bieten, aber es kann auch auf andere Phosphotransfer-Reaktionen angewendet werden, einschließlich Proteinkinase-Aktivität und zyklische Digulylat-Synthese.