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Beginnen Sie mit Bakterien, die in einem Glycerol-Bestand erhalten sind, der zuvor bis zur frühen exponentiellen Phase gezüchtet wurde, um einheitliche physiologische Zustände und reproduzierbares Wachstum zu gewährleisten.
Fügen Sie Wachstumsmedium und einen Wirbel hinzu, um die Bakterien gleichmäßig wieder zu suspendieren.
Die Suspension in Serie mit frischem Medium zu verdünnen, um eine Reihe von Startzelldichten zu erhalten.
Laden Sie die Proben in die inneren Brunnen einer Mehrfachbohrlochplatte und lassen Sie die Randbrunnen mit Blankmaterial gefüllt, um die verdunstungsbedingte Variabilität zu minimieren.
Setzen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser, der das ständige Schütteln und eine optimale Temperatur für das Bakterienwachstum ermöglicht.
Mit der Vermehrung der Bakterien steigt die optische Dichte oder OD der Kultur.
Messen Sie den OD in festen Abständen.
Subtrahieren Sie die initialen OD-Werte, die aus den leeren Brunnen erhalten werden, um die Hintergrundabsorption zu korrigieren.
Anschließend wird die Wachstumsrate aus aufeinanderfolgenden OD-Werten berechnet, die in definierten Zeitintervallen gemessen werden, was einen hohen Durchsatz und eine präzise Quantifizierung der bakteriellen Wachstumsdynamik ermöglicht.
Für die Echtzeiterfassung des Wachstums geben Sie etwa 25 Milliliter M63 in ein sterilisiertes Reagenzreservoir. Anschließend geben Sie 900 Mikroliter M63 zu den Mikroröhren zur Vorbereitung für die Durchführung von seriellen Verdünnungen. Als Nächstes geben Sie 900 Mikroliter M63 zum aufgetauten Glycerol-Stock und Wirbel.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der 10-fachen Verdünnung auf ein anderes Mikrorohr mit 900 Mikrolitern M63 und Vortex. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die gewünschte Anzahl an Verdünnungen erreicht ist. Füllen Sie nun die Mulden am Rand einer sterilisierten 96-Bohrloch-Mikroplatte mit flachem Boden mit 200 Mikrolitern M63 und verwenden Sie eine Achtkanalpipette.
Laden Sie gemäß der Referenztabelle 200 Mikroliter jeder verdünnten Probe in die Mikroplattenbohrungen ein. Um Allokationsschichten durch Erhitzung und Aussaatseffizienz zu vermeiden, verwenden Sie niemals die Brunnen am Rand der Mikroplatte für Ihre Proben und laden Sie dieselbe Probe in mehrere Brunnen an verschiedenen Stellen der Mikroplatte. Setzen Sie die 96-Well-Mikroplatte auf den Plattenleser.
Öffnen Sie jetzt lesen im Task-Manager und wählen Sie das Programm aus. Klicken Sie auf Okay, um mit dem Messen zu beginnen. Speichern Sie schließlich die Aufzeichnung als neue experimentelle Datei zur Datenanalyse.