Name: Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Picoliter-Bioreaktors zur Einzelzellanalyse von Bakterien wie Corynebacterium glutamicum. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Wachstumsraten und zelluläre Heterogenität.

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Die Autoren danken der Technikerin Agnes Müller-Schröer für ihren wertvollen Beitrag. Diese Arbeit wurde teilweise an der Helmholtz Nanoelectronic Facility (HNF) der Forschungszentrum Jülich GmbH durchgeführt. Die Autoren danken für die großzügige Hilfe und Unterstützung.

1. Herstellung von Wafern
<ol>
	<li>Entwerfen Sie das mikrofluidische Gerät mit Einlässen, Ausgängen, Hauptkanälen und den PLBRs (Abbildung 1A) mit CAD-Software.</li>
	<li>Das in diesem Protokoll vorgestellte Design (Abbildung 2) besteht aus zwei Seeding-Einlässen, einem Gradientengenerator zum Mischen von zwei verschiedenen Substraten, einem Auslass und sechs Arrays von PLBRs. Jedes Array enthält 5 PLBRs, was zu 30 parallelen PLBRs in einem mikrofluidischen Gerät führt.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Lithografie-Fotomaske mit den gewünschten Chip-Layouts (Abbildung 1B). Die Fotomaske wurde im eigenen Haus durch Elektronenstrahlschreiben mit einer Auflösung im Submikrometerbereich hergestellt. Die verwendete Maske bestand aus einer Chromschicht auf einer 5 in2 Glasplatte. 
	Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte unter Reinraumbedingungen der Klasse 100 oder besser durch (ein Prozessablaufdiagramm ist in den Abbildungen 3A und 3B dargestellt).</li>
	<li>Reinigen Sie einen 4-Zoll-Siliziumwafer einige Minuten lang mit Piranha (10:1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) und Flusssäure (Achtung: gefährliche Chemikalien). Mit entionisiertem (DI) Wasser ca. 10 Sekunden lang spülen.</li>
	<li>Wafer 20 min bei 200 °C dehydrieren.</li>
	<li>Spin Coat 1 μm SU-8 2000.5 Fotolack auf den Wafer (1. Schicht) (4 ml Resist, 10 sec Spin mit, v = 500 U/min und a = 100 U/min, Spin 30 sec mit v = 1.000 U/min und a = 300 U/min).</li>
	<li>Legen Sie den beschichteten Wafer auf eine heiße Platte bei 95 °C, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen (1,5 min bei 65 °C, 1,5 min bei 95 °C und 1 min bei 65 °C; idealerweise verwenden Sie zwei Heizplatten).</li>
	<li>Legen Sie die 1. Schicht Fotomaske (hier die Einfangbereiche der Pikoliterreaktoren) und den Wafer in den Masken-Aligner ein und belichten Sie den Wafer auf 350-400 nm (Vakuumkontakt, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).</li>
	<li>Nach der Belichtung auf einer heißen Platte bei 95 °C backen, um die Polymerisation von SU-8 zu initiieren (1 min bei 65 °C, 1 min bei 95 °C und 1 min bei 65 °C). Hinweis: Nach diesem Schritt sind die Strukturen in der SU-8-Schicht zu sehen.</li>
	<li>Legen Sie den Wafer für 1 Minute in ein SU-8-Entwicklerbad und überführen Sie den Wafer für einige Sekunden in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler.</li>
	<li>Spülen Sie den Wafer in Isopropanol, um den SU-8-Entwickler zu entfernen, und trocknen Sie den Wafer mit dem Stickstofffluss des Wafer-Spinners.</li>
	<li>Den Wafer 10 min bei 150 °C hart backen.</li>
	<li>Spin Coat 9 μm SU-8 2010 Fotolack auf den Wafer (2.Schicht) (4 ml Resist dispensieren, 10 sec mit v = 500 U/min, a = 100 rpm/sec und 30 s mit v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/sec drehen).</li>
	<li>Legen Sie den Wafer mit SU-8 auf eine Heizplatte bei 95 °C, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen (15 min bei 65 °C, 45-60 min bei 95 °C und 10 min bei 65 °C). Hinweis: Auf Falten und Blasen ist zu achten. Wenn der Wafer auf 95 °C erhitzt wird, kann verdampftes Lösungsmittel in winzigen Gasblasen eingekapselt werden.</li>
	<li>Photomaske mit dem gewünschten Layout (hier Hauptkanäle für die Nährstoffversorgung) und den Wafer in den Masken-Aligner einlegen und auf 350-400 nm belichten (harter Kontakt, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)</li>
	<li>Nach der Belichtung auf einer heißen Platte bei 95 °C backen, um die Polymerisation von SU-8 abzuschließen (5 min bei 65 °C, 3:30 min bei 95 °C, 3 min bei 65 °C). Hinweis: Nach diesem Schritt sind die Strukturen in der SU-8-Schicht zu sehen.</li>
	<li>Legen Sie den Wafer für 45 Sekunden in ein SU-8-Entwicklerbad, überführen Sie den Wafer in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler und entwickeln Sie ihn 60 Sekunden lang.</li>
	<li>Spülen Sie den Wafer 20 Sekunden lang mit Isopropanol, um alle SU-8-Entwicklerrückstände zu entfernen, und trocknen Sie den Wafer mit Druckstickstoff.</li>
	<li>Zum Schluss die Waffel bei 150 °C hart backen. Als Ergebnis erhält man den finalen Wafer (Abbildung 1C), der als Master-Mold für das PDMS-Molding verwendet wird.</li>
	<li>Führen Sie Profilometermessungen durch (Abbildung 3C), um die Höhe der SU-8-Struktur zu validieren. Hinweis: Ungenauigkeiten in der Strukturhöhe können zu einer ineffizienten Zellfalle oder zum Verlust von Zellen während der Kultivierung führen.</li>
</ol>
2. Herstellung von Polydimethylsiloxan-Chips
Hinweis: Alle folgenden Schritte sollten idealerweise unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt werden, um zu verhindern, dass Staubpartikel den Herstellungsprozess beeinträchtigen (Ein Prozessablaufdiagramm ist in Abbildung 4 dargestellt).
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine Mischung aus Polydimethylsiloxan (PDMS)-Base und Härter im Verhältnis 10:1 vor. Vorsichtig mischen, bis eine homogene Lösung entsteht, die undurchsichtig aussieht. Bereiten Sie so viel vor, wie für die gewünschte Schichthöhe (hier 3 mm) benötigt wird.</li>
	<li>Entgasen Sie das PDMS-Gemisch ca. 30 min lang unter leichtem Vakuum, bis alle Blasen verschwunden sind.</li>
	<li>Bereiten Sie die Formvorrichtung (oder Petrischale) mit dem entsprechenden SU-8-Wafer vor und gießen Sie die PDMS-Mischung hinein (Abbildung 1D).</li>
	<li>Das PDMS 3 Std. bei 80 °C im Ofen backen.</li>
	<li>Ziehen Sie die PDMS-Platte vorsichtig vom Wafer ab. Schneiden Sie die Platte mit einem sauberen und scharfen Skalpell in einzelne Späne.</li>
	<li>Waschen Sie die Chips 90 min lang in einem n-Pentanbad, gefolgt von zwei Aceton-Waschbädern (je 90 min). Trocknen Sie die Späne über Nacht, um Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Achtung: Führen Sie die PDMS-Reinigung unter einem Abzug durch. Hinweis: Während der n-Pentan-Wäsche werden Monomere und Dimere aus dem ausgehärteten PDMS entfernt und die Chipgröße kann sich während des Waschvorgangs vorübergehend verdoppeln.</li>
	<li>Lagern Sie die mikrofluidischen PDMS-Chips bis zum endgültigen Experiment in geschlossenen Behältern.</li>
	<li>Stanzen Sie kurz vor dem Experiment die Einlass- und Auslasslöcher mit einer Nadel (oder einem Locher) in den PDMS-Chip, deren Durchmesser etwas kleiner ist als bei den Anschlüssen, die zum Verbinden von Schläuchen mit dem PDMS-Chip verwendet werden.</li>
	<li>Reinigen Sie den mikrofluidischen PDMS-Chip vorsichtig mit Isopropanol und verwenden Sie Klebeband, um Staubpartikel zu entfernen, die auf der strukturierten PDMS-Seite haften bleiben könnten. Verwenden Sie das Klebeband mehrmals, bis keine Partikel mehr auf dem Chip zu sehen sind.</li>
	<li>Reinigen Sie einen 170 μm dünnen Objektträger nacheinander mit Aceton und Isopropanol. Zum Schluss mit entionisiertem Wasser reinigen und mit Druckstickstoff trocknen.</li>
	<li>Vor der Plasmaaktivierung den Plasmareiniger erwärmen und das Plasma ca. 300 Sekunden lang laufen lassen. Glasobjektträger und PDMS-Chip plasmaoxidieren (Leistung 50 W, Zeit = 25 sec, Sauerstoffdurchfluss = 20 sccm).</li>
	<li>Richten Sie das PDMS und den Glaschip vor dem Verkleben aus. Platzieren Sie abschließend den PDMS-Chip vorsichtig auf dem Objektträger (Abbildung 1E). PDMS und Glas verbinden sich innerhalb von Sekunden. Hinweis: Drücken Sie während des Klebevorgangs nicht mit einer Pinzette auf die Oberseite des PDMS-Chips. Dies kann zum sogenannten Einsturz der Dächer der Kanäle und kleiner Strukturen führen.</li>
	<li>Um die Verbindung zu verstärken, wird der fertige PDMS-Glaschip 10 Sekunden lang bei 80 °C gebacken.</li>
</ol>
3. Vorbereitung der Bakterienkultur
Hinweis: Alle Kultivierungen sollten in sterilem, gefiltertem Medium zubereitet werden, um die Ansammlung unerwünschter Partikel zu verhindern, die während der Kultivierung stören könnten.
<ol>
	<li>Verwenden Sie eine Agarplatte mit den gewünschten Organismen (hier C. glutamicum ATCC 13032) und inokulieren Sie eine Kolonie in 20 ml frisches BHI-Medium, inkubieren Sie über Nacht (≈ 8-14 Uhr) bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (120 U/min).</li>
	<li>Überführen Sie 10 μl der Vorkultur in das gewünschte Medium (hier CGXII21), das bei der mikrofluidischen Kultivierung verwendet wird, und lassen Sie die Zelle über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (120 U/min) wachsen.</li>
	<li>Übertragen Sie die gewünschte Menge der Zellsuspension (zwischen 10-500 μl, je nach Versuchsstart) in das gewünschte Medium (hier CGXII21), das bei der mikrofluidischen Zellkultivierung verwendet wird. Hinweis: Am besten verwenden Sie Zellen aus der frühen logarithmischen Phase für die Aussaat. Für die C. glutamicum-Kultur lag die beste optische Dichte (OD600) für die Aussaat zwischen 0,5 und 2.</li>
	<li>1 ml der Bakterienkultur in ein steriles 2-ml-Röhrchen umfüllen. Hinweis: Dies sollte direkt nach dem Zusammenbau des mikrofluidischen PDMS-Chips erfolgen, um die Übertragungszeit zwischen dem Schüttelkolben und der mikrofluidischen Kultivierung zu minimieren. In der Regel beträgt die Transferzeit etwa 15 Minuten und sollte so kurz wie möglich gehalten werden, um Auswirkungen auf den Stoffwechsel durch Sauerstofflimitierung und Temperaturänderungen zu vermeiden.</li>
</ol>
4. Versuchsaufbau
Hinweis: Alle Schritte werden mit einem inversen Mikroskop durchgeführt.
<ol>
	<li>Starten Sie den Mikroskop-Inkubator 2 Stunden vor dem Experiment, um das System aufzuwärmen. Hinweis: Die Mikroskopie sollte mit einem Inkubator in voller Größe ausgestattet sein, um die Temperatur und gegebenenfalls den Gasfluss zu steuern. Eine zusätzliche Feuchtigkeitsregelung ist nicht erforderlich, da das Chipsystem kontinuierlich mit Medien infundiert wird.</li>
	<li>Öffnen Sie das Inkubatorsystem, wählen Sie das gewünschte Objektiv aus und geben Sie bei Bedarf Immersionsöl auf das Objektiv.</li>
	<li>Montieren Sie den Chip im Chiphalter. Bei Bedarf die Glasplatte mit Klebeband fixieren, um eine Bewegung des Splitters während des Bühnenbetriebs zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Probe auf dem Mikroskop und fokussieren Sie sie auf die PLBR-Arrays.</li>
	<li>Verbinden Sie die Ein- und Auslässe mit den entsprechenden Schläuchen (Abbildung 1F). Schließen Sie den Schlauch an einen Abfallbehälter an. Ein repräsentativer Chip ist in Abbildung 4D zu sehen.</li>
	<li>Setzen Sie die Spritzen in die Pumpen ein und starten Sie den Medienfluss. Verwenden Sie Medium, Puffer oder ggf. Beschichtungslösung und spülen Sie die mikrofluidischen Kanäle ca. 1 Stunde lang. Hinweis: Zur Beschichtung der Kanalwände wird eine Beschichtungslösung verwendet, um eine unspezifische Zelladhäsion zu verhindern.</li>
	<li>Für E. coli wird eine 0,1%ige BSA-Lösung verwendet, um die Kanalwände zu beschichten. Für C. glutamicum ist keine Beschichtung notwendig. Nach dem Beschichtungsvorgang wird der Chip vor dem Cell Seeding mit Medium gespült.</li>
	<li>Prüfen Sie vor der Aussaat und Kultivierung der Zellen, ob keine Leckage auftritt und die Temperatur konstant ist.</li>
</ol>
5. Aussaat von Bakterienzellen in das mikrofluidische Gerät
<ol>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Bakterienlösungen in geeigneten Spritzen verfügbar sind, die mit dem Schlauch verbunden sind.</li>
	<li>Trennen Sie den Puffer oder die Beschichtungslösung und verbinden Sie die Zellsuspension mit dem Chip. Um das Todesvolumen und unerwünschte Luftblasen zu minimieren und die Versuchszeit zu verkürzen, sollten sowohl die komplette Nadel als auch der Schlauch und nicht nur die Spritzen gewechselt werden.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird mit einem Volumenstrom von 200 nl/min in die Kanäle infundiert, bis die meisten PLBRs mit der gewünschten Menge an Zellen gefüllt sind (Abbildung 5A). Hinweis: Das optimale Aussaatergebnis hängt vom Bakterienstamm OD600 und dem Wachstumsmedium der Vorkultur ab. Diese Parameter müssen angepasst werden, um die Einfangeffizienz und die Zeit bis zu einer ausreichenden Anzahl von Zellen in den Reaktorstrukturen zu erhöhen. Für C. glutamicum wurde typischerweise eine Zellsuspension von OD600 0,5-2 verwendet; für E. coli lag der OD600 zwischen 0,5-1.</li>
	<li>Wenn nur eine kleine Anzahl von PLBRs gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussmenge auf 800-1.200 nl/min.</li>
	<li>Trennen Sie die Zellsuspension und verbinden Sie das Wachstumsmedium mit dem Chip (Abbildung 5B). Achten Sie darauf, dass während des Mediumwechsels keine Luftblase entsteht. Perfusion mit frischen Wachstumsmedien bei 100 nl/min.</li>
</ol>
6. Zeitraffer-Bildgebung
<ol>
	<li>Wählen Sie bestimmte PLBRs für die Zeitraffer-Bildgebung aus. Typischerweise werden PLBRs gewählt, die zu Beginn eines Experiments eine einzelne Mutterzelle enthalten. Die Anzahl der interessierenden Regionen, die in einem Experiment untersucht werden können, hängt von der gewünschten Bildrate und dem mikroskopischen Aufbau ab.</li>
	<li>Wählen Sie eine geeignete Bildrate in Abhängigkeit von der Anzahl der PLBRs. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop die gewünschte Menge an ROIs im Zeitrafferintervall verarbeiten kann.</li>
	<li>Wählen Sie passende Filtersets (hier YFP). Schließen Sie den Verschluss automatisch während der Tischbewegung und nach jeder Zeitraffermessung, um ein Ausbleichen der Chromophore zu verhindern.</li>
	<li>Konfigurieren Sie die Zeitraffer-Mikroskopiesequenz und starten Sie das Experiment.</li>
	<li>Nachdem alle PLBRs überwuchert sind, kann das Experiment gestoppt, der mikrofluidische PDMS-Chip verworfen und das Experiment ausgewertet werden.</li>
</ol>
7. Analyse
Hinweis: Die folgenden Schritte oder Teile des Verfahrens können manuell oder durch Bildanalyseprogramme wie ImageJ usw. durchgeführt werden.
<ol>
	<li>Bestimmen Sie PLBRs of Interest, bei denen die Kultivierung alle gewünschten Kriterien erfüllt, z.B. Anzahl der Mutterzellen, Position der Mutterzellen, etc.</li>
	<li>Um die Wachstumsrate einer Mikrokolonie zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der Zellen in jedem Zeitrahmen.</li>
	<li>Berechnen Sie die maximale Wachstumsrate, indem Sie die Zeit in Abhängigkeit von ln (Zellenzahl) darstellen. Die Steigung des Diagramms stellt die Wachstumsrate in [1/h] dar (siehe Abbildung 6).</li>
	<li>Die Analyse von Fluoreszenzdaten hängt stark vom durchgeführten Experiment ab. In diesem Bericht wurde ein Beispiel gewählt, um die Heterogenität zwischen Kolonie und Zelle zu Zelle zwischen verschiedenen isogenen Mikrokolonien zu veranschaulichen (siehe Abbildung 7).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben die Herstellung, den Versuchsaufbau und die damit verbundenen Betriebsverfahren eines mikrofluidischen PDMS-Geräts, das mehrere (PLBRs) enthält, für die Einzelzellanalyse von Bakterien beschrieben.
Die Mikrofabrikation mit weichen Lithographietechniken ermöglicht eine schnelle Anpassung der Geräteabmessungen für verschiedene Größen und Bakterienmorphologien. Derzeit optimieren wir den Pikoliter-Bioreaktor im Hinblick auf die Kultivierung verschiedener mikrobieller Organismen und den Kultivierungsdurchsatz. Um die Einfangeffizienz zu erhöhen, wird auch die Reaktorgeometrie optimiert. Abbildung 8 zeigt vier neue PLBR-Geräte, die derzeit validiert sind. In allen Abbildungen wurde der Säkanal hinsichtlich Breite und Form neu gestaltet. In der Praxis scheint sich dies auf die Anzahl der gefangenen Zellen auszuwirken, bedarf aber weiterer Untersuchungen. Signifikante Verbesserungen hinsichtlich der Einfangeffizienz wurden auch durch den Einbau zusätzlicher Überlaufkanäle erreicht, die zu einer höheren konvektiven Strömung durch den Reaktor führten und mehr Zellen eingefangen wurden. Gleichzeitig erhöht man jedoch das Risiko, Zellen während der Kultivierung auszuwaschen.
Das Gerät ist eine interessante Alternative zu makroskaligen Kultivierungen, die seit Jahrzehnten zur Untersuchung von Wachstums- und Produktionsprozessen auf Einzelzellebene eingesetzt werden. Er stellt jedoch einige wichtige Anforderungen: Für die parallele Überwachung mehrerer Pikoliter-Bioreaktoren ist ein hochauflösender und vollmotorisierter mikroskopischer Aufbau mit Fokusdriftkompensation zwingend erforderlich. Zusätzlich wird ein Inkubationssystem benötigt, um die gewünschte Kultivierungstemperatur während der Messungen konstant zu halten.
Wir erreichen eine Erfolgsquote von 95 % bei der Herstellung von Geräten. Die Hauptprobleme hängen mit ineffizienten PDMS-Glasverklebungen, PDMS-Dacheinstürzen oder Flüssigkeitsleckagen zusammen (siehe Tabelle 1 zur Fehlerbehebung der am häufigsten auftretenden Probleme). Obwohl die experimentelle Arbeit teilweise unter unsterilen Bedingungen durchgeführt wird, sehen wir bei den Experimenten aufgrund des geschlossenen fluidischen Systems nur selten eine Kontamination. PDMS-Mikrofluidikgeräte sind optisch transparent und können daher für hochauflösende In-vivo-Bildgebung verwendet werden. Obwohl PDMS perfekt für die Anwendung geeignet zu sein scheint, hat es eine hohe Affinität zu hydrophoben Molekülen, was die Verwendung von Lösungsmitteln, die in biokatalytischen Ganzzellprozessen weit verbreitet sind, einschränkt. Es stehen jedoch geeignete Beschichtungen zur Verfügung, um das Protokoll an diese Art von Anwendungen anzupassen.
Das vorgeschlagene PLBR eignet sich gut für die räumlich-zeitliche Analyse zellulärer und sogar subzellulärer Ereignisse verschiedener Bakterienarten. Ein großer Vorteil des vorliegenden Ansatzes liegt in der Möglichkeit, das Wachstum von Mikrokolonien im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden direkt zu quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht der PLBR den Anbau unter definierten und konstanten Bedingungen. Da das System die Verwendung kleiner Mengen an Reagenzien oder Materialien ermöglicht, bietet es die Vorteile, dass es kostengünstig, anpassbar und für einen hohen Durchsatz geeignet ist. Bei traditionellen Methoden werden bei der Analyse der mikrobiellen Kultivierung Durchschnittswerte der Gesamtpopulation berücksichtigt. Darüber hinaus ist bei bestehenden Methoden eine manuelle Probenahme erforderlich, was zu einer Degradation der Proben und damit zu Fehlern in der Messung führen kann. Das PLBR bietet neue Perspektiven für die Bioprozessentwicklung und die Analyse der Populationsheterogenität in der Mikrobiologie. Das PLBR ist ein vielversprechendes Werkzeug für verschiedene Anwendungen in der Bioprozessentwicklung und könnte in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, z.B. bei der Analyse der Zell-zu-Zell-Heterogenität, der Analyse spezifischer Zellcluster innerhalb von Zelllinien, dem Screening von mikrobiellen Produktionsstämmen und der Echtzeituntersuchung von Zellphänotypen.

Zeitraffermikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung lebender Zellen in vivo1. In der Zwischenzeit werden kommerziell erhältliche vollautomatische Mikroskopie-Plattformen einschließlich thermisch induzierter Fokusdrift-Kompensation häufig in der biologischen Forschung eingesetzt, um zeitabhängige Phänomene zu untersuchen, die von der Krebs- und Neuronenzellforschung über das Tissue Engineering bis hin zu dynamischen Studien mit einzelnen Hefe- oder Bakterienzellenreichen 2-6.
Typischerweise werden transparente Well-Platten, Agar-Pads oder einfach Mikroskopie-Objektträger verwendet, um Zellkulturumgebungen während der Zeitraffer-Bildgebung bereitzustellen7. Obwohl diese einfachen Systeme für bestimmte Forschungsarbeiten geeignet sind, haben sie nur eine sehr begrenzte Kontrolle über die Umgebungsbedingungen und erlauben keine komplexeren Störungen oder klar definierte und schnelle Medienwechsel. Mikrofluidische Einweg-Chips, die in Massenproduktion hergestellt werden, wurden kürzlich auf den Markt gebracht, sind aber meist auf größere eukaryotische Zelltypen zugeschnitten4. Obwohl das Wachstum verfolgt werden kann, sind gut definierte Wachstumsuntersuchungen, z.B. hinsichtlich präziser Zelleinfalle, Koloniegröße, Wachstumsrichtung und der Fähigkeit zur Zellentfernung, begrenzt. Mikrofluidische Habitate und Reaktoren, in denen Bakterienzellen in 3D-Umgebungen kultiviert werden8-10, haben Nachteile, wenn es sich um quantitative Studien auf Einzelzellebene handelt. Während die Heterogenität der Gesamtpopulation analysiert werden kann, können viele Zellparameter nicht mit Einzelzellauflösung genau bestimmt werden, da das Wachstum nicht auf Monoschichten beschränkt ist.
Diese Einschränkung löste die Entwicklung von Mikrosystemen aus, die die Kultivierung von Zellen in genau definierten Kanälen und Habitaten ermöglichen, wobei Zellen in flachen Monoschichten mit Einzelzellauflösung und besonders strenger Kontrolle über die Medienversorgung und die Umweltbedingungen wachsen6,11,12. Einige Beispiele für mikrofluidische Systeme zur Kultivierung von Bakterienzellen wurden demonstriert12-14. Bakterien weisen in der Regel sehr schnelle Wachstumsraten auf und benötigen mikrofluidische Strukturen im Bereich von wenigen Mikrometern und darunter, insbesondere wenn Zellmonoschichten für die Mikroskopie gewünscht werden. Keymer et al. demonstrierte das Wachstum und die Ausbreitung von E. coli-Stämmen in mikrofabrizierten Landschaften15,16. Da sie sich für die Dynamik von Populationen interessierten, untersuchten sie nicht mit Einzelzellauflösung.
Wir haben den Pikoliter-Bioreaktor (PLBR)13 entwickelt, der derzeit zur Untersuchung verschiedener biotechnologischer Leistungsindikatoren wie Wachstum17 und fluoreszenzgekoppelte Produktivitätsanalyse auf Einzelzellebene18,19 eingesetzt wird. Die vorliegende mikrofluidische Vorrichtung ermöglicht die Steuerung des Umweltreaktors bei einem definierten Kulturvolumen von etwa einem Pikoliter und die gleichzeitige kontinuierliche Einzelzellbeobachtung. Im Vergleich zu offenen Monolayer-Box-Systemen11, 14, bei denen eine oder zwei Seiten zum Medienzufuhrkanal hin offen sind, ermöglicht das PLBR ein kontrolliertes Einfangen und Kultivieren. Das Design ermöglicht eine langfristige Kultivierung von Bakterien, ohne das Risiko, dass mehrere benachbarte Kolonien eine große Population bilden. Darüber hinaus integriert das System Kultivierungsbereiche von 1 μm Höhe (in der Größenordnung des Zelldurchmessers), um das Bakterienwachstum auf Zellmonoschichten zu beschränken. Im Gegensatz dazu sind die Zuführkanäle 10-fach tiefer, um den hydraulischen Widerstand zu minimieren.
Im Vergleich zu miniaturisierten Batch-Kultivierungssystemen20 ermöglicht das vorliegende System den Anbau mit konstanten Umgebungsparametern aufgrund des kontinuierlichen Medienflusses. Darüber hinaus können Umgebungsparameter wie Medienzusammensetzung, Temperatur, Durchflussmengen und Gasaustausch einfach gesteuert und innerhalb von Sekunden geändert werden. Dies ermöglicht es, die zelluläre Reaktion auf Umweltveränderungen wie z.B. Nährstoffverfügbarkeit oder Stressreize gezielt zu untersuchen. Die Nachfrage nach reduzierten Medienvolumina, d. h. im Bereich von nur wenigen Mikrolitern, ermöglicht es den Forschern, neuartige Studien durchzuführen, z. B. die Störung von Zellen während der Zeitrafferbildgebung mit Überstand von Großexperimenten, die die Zellantwort unter diesen spezifischen Umweltbedingungen entschlüsseln17. Der Pikoliter-Bioreaktor bietet den Forschern ein robustes System, das die biophysikalischen Bedingungen streng kontrolliert und mit hochpräzisen Spritzenpumpen und automatisierter Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie für die Zeitrafferbildgebung betrieben wird. Hier berichten wir über ein vollständiges Protokoll, das das Gerätedesign, die Herstellung und beispielhafte Anwendungen umfasst.

<table><tbody><tr><td>Siliziumwafer 100 mm Durchmesser, P/BOR < 100></td><td>Si-MAT, Silikonmaterialien, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler mr DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning; Farnell GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dosiernadeln Präzisionsspitzen&nbsp; 27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasplatten D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm</td><td>Schott AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Locher AKA 5130-B-90</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm</td><td>Saint Gobain; VWR International GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegspritzen &ndash; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Deutschland</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen, 1 ml sterile Glasspritzen</td><td>INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemikalien</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&bull; 6H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procatechuinsäure</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose-Monohydrat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>Corynebacterium glutamicum ATTC 13032</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG 1655</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Wafer Cleaner SSEC 3300</td><td>Solid State Equipment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask Aligner MA-6</td><td>Karl Suess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte HP30A - 2</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laborofen Memmert UN 200</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger FEMTO</td><td>Diener Electronics, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>neMESYS Spritzenpumpen</td><td>Cetoni GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Inkubator</td><td>Pecon GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge minispin plus " schwarze Linie"</td><td>Eppendorf</td><td>9776501</td><td></td></tr><tr><td>Photometer BioPhotometer plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelschüttler/Inkubator 3031</td><td>GFL - Gesellschaft f&uuml; r Labortechnik mbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometer, Dektak 150 Stylus Profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidischer picoliter-bioreaktor für die mikrobielle einzelzellanalyse: herstellung, systemaufbau und betrieb

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In diesem Protokoll werden die Herstellung, der Versuchsaufbau und der grundlegende Betrieb des kürzlich eingeführten mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) detailliert beschrieben. Das PLBR kann für die Analyse einzelner Bakterien und Mikrokolonien eingesetzt werden, um biotechnologische und mikrobiologische Fragestellungen zu untersuchen, z.B. in Bezug auf Zellwachstum, Morphologie, Stressantwort und Metaboliten- oder Proteinproduktion auf Einzelzellebene. Das Gerät verfügt über einen kontinuierlichen Medienfluss, der konstante Umgebungsbedingungen für Störungsstudien ermöglicht, aber auch schnelle Medienwechsel sowie oszillierende Bedingungen ermöglicht, um jede gewünschte Umgebungssituation nachzuahmen. Für die Herstellung der Einweggeräte diente ein Siliziumwafer mit submikrometergroßen SU-8-Strukturen als Replikationsform für den schnellen Polydimethylsiloxan-Guss. Die Chips wurden geschnitten, zusammengesetzt, verbunden und auf ein hochauflösendes und vollautomatisches Mikroskop gesetzt, das für die Zeitrafferbildgebung geeignet ist und ein leistungsstarkes Werkzeug für die räumlich-zeitliche Zellanalyse ist. Hier wurde der biotechnologische Plattformorganismus Corynebacterium glutamicum in das PLBR eingepflanzt und das Zellwachstum und die intrazelluläre Fluoreszenz über mehrere Stunden verfolgt, um die zeitabhängige Heterogenität der Population auf Einzelzellebene zu entschlüsseln, was mit herkömmlichen Analysemethoden wie der Durchflusszytometrie nicht möglich ist. Neben Einblicken in die Geräteherstellung werden auch die Vorbereitung der Vorkultur, das Verladen, das Einfangen von Bakterien und die PLBR-Kultivierung von Einzelzellen und Kolonien demonstriert. Diese Geräte werden eine neue Dimension in der mikrobiologischen Forschung hinzufügen, um zeitabhängige Phänomene einzelner Bakterien unter strenger Umweltkontrolle zu analysieren. Aufgrund des einfachen und relativ kurzen Herstellungsprozesses kann die Technologie in jedem Mikrofluidiklabor leicht angepasst und einfach auf die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden.

Geräteherstellung
Das mikrofluidische PLBR-System wird aus einer Schicht PDMS hergestellt, die auf einem dünnen Glaschip befestigt ist, der für die hochauflösende Mikroskopie geeignet ist. Die Herstellung umfasst zwei Hauptschritte: zunächst die Herstellung der Replikationsform (Abbildungen 1A, 1B und 1C) und anschließend die Chip-Herstellung (Abbildungen 1D, 1E und 1F). Gemäß dem Protokoll werden Standard-Methoden der photolithographischen Mikrofertigung verwendet, um die Urform zu erzeugen. Labore ohne Reinraum-Ausstattung können kommerziell erhältliche, kundenspezifische SU-8-Urformen beziehen. Mithilfe wiederholter PDMS-Abformung (Abbildungen 1A, 1B und 1C) lassen sich Hunderte von Einweg-Chips herstellen. Die PDMS-Abformung und die Chip-Assemblierung können in jedem Labor durchgeführt werden und erfordern keine Reinraum-Einrichtungen, wobei Arbeitsplätze mit laminarer Luftströmung vorteilhaft sind.
Der Prozess beginnt mit der Konstruktion des mikrofluidischen Chipsystems. Üblicherweise wird CAD-Software verwendet, um den mikrofluidischen Chip zu entwerfen (Abbildung 1A). Nach der CAD-Konstruktion wird mittels Elektronenstrahlschreiber eine Maske mit submikronarer Auflösung erzeugt (Abbildung 1B). In der vorliegenden Studie wurde eine 5-Zoll-Chrommaske angefertigt, die für die SU-8-Wafer-Lithographie verwendet wurde. Der fertige Silizium-SU-8-Wafer dient anschließend als Form für das Abformen von PDMS (Abbildung 1D). Nach einem Aushärteschritt wird die PDMS-Platte in Chips geschnitten, die irreversibel auf Objektträgern fixiert werden (Abbildung 1E). Abschließend werden die Schläuche angeschlossen (Abbildung 1F).
Abbildung 2 zeigt das Design des mikrofluidischen Systems im Detail. Es besteht aus zwei Zellinokulationsöffnungen, einem Gradientengenerator zur Mischung verschiedener Substrate oder Medien und einer Auslassöffnung. Die Hauptkanäle haben eine Abmessung von 50 µm x 10 µm (B x H). Jedes Gerät besteht aus sechs Arrays mit PLBRs, wobei jedes Array 5 PLBRs enthält. Dies führt zu 30 parallelisierten Reaktoren innerhalb eines mikrofluidischen Geräts.
Abbildung 3 veranschaulicht die Herstellung der Replikationsmasterform. Wie im Protokoll detailliert beschrieben, wird eine erste SU-8-Schicht mittels SU-8-Lithographie gefertigt (Abbildung 3A). Ein ähnliches Verfahren wird für die zweite Schicht angewandt (Abbildung 3B). Um die Kanalgeometrie zu überprüfen, untersuchten wir die Höhe der PLBRs und Hauptkanäle mithilfe eines Profilometers. In dem in Abbildung 3C gezeigten Beispiel wurde die erste Schicht (die Kultivierungsschicht) vermessen. Hier weist die Schicht eine gleichmäßige Höhe von 1,200 nm auf, was für die Kultivierung von C. glutamicum in BHI-Medium geeignet ist.
Abbildung 4 veranschaulicht das PDMS-Abformverfahren, beginnend mit dem Mischen von PDMS (Abbildung 4A), gefolgt vom Abformprozess (Abbildung 4B) und schließlich dem Bonding-Schritt (Abbildung 4C). Abbildung 4D zeigt den fertigen mikrofluidischen Chip, der die 170 µm dicke Glasplatte, den PDMS-Chip (3 mm Höhe) mit Zulauf- und Ablauföffnungen sowie Stahlnadeln, die an Schläuche angeschlossen sind, enthält. Nach dem Experiment kann der Chip entsorgt werden, wobei keine aufwändige Reinigung erforderlich ist. Außerdem ist er einfach zu montieren und zu handhaben. Es ist kein komplexes und schwieriges Befüllverfahren notwendig.
Funktionsprinzip des Geräts
Abbildung 5 zeigt das Funktionsprinzip des Reaktorsystems. Zellen werden in die mikrofluidische Vorrichtung eingeleitet und einzelne Zellen verbleiben allein durch Zellwand-Wechselwirkungen in der PLBR eingefangen. Aufgrund des Unterschieds im hydrodynamischen Widerstand von Kanal und PLBR tritt innerhalb der PLBR nur ein minimaler Durchfluss auf. Nach der Besiedlung der PLBR (Abbildung 5A) wird die Wachstums- und Beobachtungsphase durch den Wechsel von Bakterienlösung auf Wachstumsmedium eingeleitet (Abbildung 5B). Nachdem die PLBR überwachsen sind (Abbildung 5C), wird das Experiment typischerweise beendet und die Zeitrafferaufnahmen können analysiert werden. Für Details zu den Einfangmechanismen und dem Strömungsprofil innerhalb der PLBR wird der Leser auf Grünberger et al.13 verwiesen.
Wachstumsratenanalyse
Das vorliegende System kann zur Untersuchung verschiedener Bakterienarten hinsichtlich unterschiedlicher biologischer Parameter wie Wachstum, Morphologie oder eines fluoreszierenden Signals angewendet werden. Im ersten Beispiel wurde C. glutamicum, ein industriell relevanter Produktionsstamm, unter Standardkultivierungsbedingungen (T=30 °C, CGXII-Medium21) kultiviert. Abbildung 6A zeigt die Wachstumskurven, die aus drei isogenen Mikrokolonien abgeleitet wurden. Das exponentielle Wachstum bleibt so lange erhalten, bis die PLBRs vollständig befüllt sind, was darauf hinweist, dass keine Nährstofflimitierung auftritt. Abbildung 6B zeigt vier DIC-Zeitraffer-Mikroskopieaufnahmen einer wachsenden C. glutamicum-Kolonie.
Fluoreszenzanalyse
Für die Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie nutzen Forscher häufig spezifische fluoreszierende Proteine wie GFP oder dessen Derivate, um ein bestimmtes Phänotypmerkmal mit einem messbaren Ausgangssignal (einem fluoreszierenden Signal) zu verknüpfen. Um die Anwendbarkeit des PBLR für zeitraffende, fluoreszenzbasierte Studien zu demonstrieren, untersuchten wir die Fluoreszenzemission eines C. glutamicum-Stamms, der unter Kontrolle des Ptac-Promotors ein plasmidkodiertes YFP-TetR-Fusionsprotein produziert (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. Bei niedrigen Konzentrationen des Induktors IPTG ist bekannt, dass die Expression aus dem Ptac-Promotor zu erheblichen zellübergreifenden Unterschieden in isogenen Bakterienpopulationen führt. Ausgehend von einer Vorstufe wurde das Wachstum und die Einzelzell-Fluoreszenz mehrerer isogener Mikrokolonien verfolgt. Wie in Abbildung 7 zu sehen ist, beobachteten wir phänotypische Heterogenität zwischen verschiedenen Mikrokolonien sowie Heterogenität auf Einzelzellebene innerhalb von Kolonien, die von einer Mutterzelle abstammen. Eine Kolonie (Abbildung 7B, PLBR 1) zeigte nahezu keine Fluoreszenzemission, während die Zellen von PLBR 2 eine geringe Fluoreszenzemission aufwiesen, bedingt durch die basale Expression von yfp-tetR aus dem Ptac-Promotor. Bei PLBR 3 war die Fluoreszenzemission im Vergleich zu den anderen Kolonien deutlich stärker, und es wurde eine breite Verteilung der Population beobachtet. Dieses Beispiel zeigt die Eignung des PBLR für zeitraffende Fluoreszenzmikroskopie-Studien. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie, bei der die Fluoreszenz einzelner Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt werden kann, ermöglicht das vorgestellte System die Verfolgung von Zellen und die Untersuchung der Einzelzell-Fluoreszenz in Echtzeit über mehrere Generationen hinweg.
<img alt="Diagramm des Mikrochip-Herstellungsprozesses mit den Schritten Design, Maske, Wafer, Formgebung, Bonden und Montage." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Übersicht über den PLBR-Chip-Herstellungsprozess. Herstellung der Urform: beginnend mit (A) Design, (B) Herstellung der Lithographiemaske und (C) Wafer-Produktion. PDMS-Glas-Chip-Herstellung: beginnend mit (D) der PDMS-Formgebung, gefolgt von (E) dem Bonden von Glas und PDMS sowie (F) der endgültigen Chip-Montage.
<img alt="Mikrofluidik-Chip-Diagramme mit beschrifteten Strömungskanälen für die Zellseparation und Analyseforschung." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Konstruktion des PLBR-Chips. (A) CAD-Zeichnung des gesamten mikrofluidischen Chips; (B) Vergrößerung ausgewählter Layoutpositionen: Das Layout enthält zwei Mediumzuführungen (a1), einen Gradientengenerator mit Mischkanälen (a2) und 6 parallele PLBR-Anordnungen (b1). b2 zeigt einen einzelnen PLBR, der in einem Fluidkanal mit einer Breite von 100 µm eingebettet ist. Der PLBR hat einen Innendurchmesser von 40 µm und Nährstoffkanäle mit einer Breite von 2 µm. Der Einsaatzulauf hat eine Länge von 40 µm. Die rosa Farbe kennzeichnet die erste Schicht (Einfang- und Kultivierungsregion), die blaue Farbe die zweite Schicht (Fluidtransport).
<img alt="Mikrofertigungsdiagramm mit SU-8-Photolithographieschritten und Ergebnissen der Höhenmessung." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Veranschaulichung des Herstellungsverfahrens für zweilagige Wafer. (A) Herstellung der ersten Schicht mit Fangstrukturen; (B) Herstellung der zweiten Schicht mit Fluidkanälen, Zulauf- und Ablauflöchern; (C) Repräsentative Oberflächenprofile der ersten Schicht. In diesem Fall betrug die Höhe der ersten Schicht 1.200 nm und wird für die Kultivierung von C. glutamicum in komplexem Medium verwendet.
<img alt="Schema des PDMS-Abformprozesses; Mikrofluidik-Chip-Architektur mit SU8-, PDMS- und Glas-Schichten; Einlass-/Auslassöffnungen" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Herstellung des Geräts und repräsentativer Chip. Darstellung des PDMS-Abformprozesses: (A) Mischen und Entgasen des PDMS; (B) Abformen des PDMS; (C) Entformung, Schneiden und Verbindung des Chips. Fertiger Chip (mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry13 reproduziert): (D) Foto des PDMS-Chips mit zwei Einlässen und einem Auslass; (E) CAD-Bild von sechs parallelen Anordnungen mit jeweils 5 PLBRs; (F) REM-Aufnahme eines einzelnen PLBR.
<img alt="Bakterielles Wachstum in mikrofluidischem Gerät; laminare Fließkanäle; PDMS-Aufbau; Überlauf- und Zuführkanäle." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5. Funktionsprinzip des PLBR-Systems. (A) Aussaatphase; (B) Wachstumsphase der bakteriellen Mikrokolonien; (C) Überlaufphase. Nachgedruckt mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>.
<img alt="Wachstumsdiagramm von Zellen mit mikroskopischen Aufnahmen von Mikroorganismen; Gleichungen zur Wachstumsratenanalyse und Ergebnisse" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 6"> 
Abbildung 6. Bestimmung der Wachstumsrate von C. glutamicum-WT-Mikrokolonien. (A) Wachstumsdiagramm dreier PLBR-Kultivierungen und resultierende exponentielle Kurven (Teile mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry übernommen)13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>. (B) Zeitrafferaufnahmen einer wachsenden C. glutamicum-Kolonie.
<img alt="Diagramm des mikrobiellen Kulturverlaufs mit Fluoreszenzdaten; Experiment zeigt Zellwachstum und Analyse." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 7"> 
Abbildung 7. PBLR-basierte Analyse der Populationsheterogenität. Dargestellt ist C. glutamicum, das eine yfp-tetR-Fusion unter Kontrolle des Ptac-Promotors (pEKEx2-yfp-tetR) in Abwesenheit des Induktors IPTG exprimiert. (A) Experimenteller Arbeitsablauf; (B) Drei isogene Mikrokolonien, die Heterogenität von Kolonie zu Kolonie sowie von Zelle zu Zelle zeigen; (C) Verteilung der Einzelzell-Fluoreszenz innerhalb der jeweiligen Mikrokolonien.
<img alt="Mikroskopiebild, das Mikrostrukturen mit verschiedenen Einsaatöffnungen für die Materialanalyse vergleicht." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 8"> 
Abbildung 8. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener PLBRs. REM-Aufnahmen, die Einsaatöffnungen zur Optimierung der Fang-Effizienz zeigen. (A) Größere Einsaatöffnungen (B) Kleinere Einsaatöffnungen (C) Größere „offene“ Einsaatöffnungen (D) Zwei Einsaatöffnungen.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Schritt</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Mögliche Ursache</td>
			<td>Lösung</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer-Herstellung</td>
			<td>Eingeschlossene Luftblasen im SU-8 während des Vorbackens</td>
			<td>Temperaturerhöhung zu schnell</td>
			<td>Bei 95 °C und 65 °C mehrmals backen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer-Herstellung</td>
			<td>Verschwindende oder gebrochene SU-8-Strukturen</td>
			<td>Nicht optimales Herstellungsverfahren; mechanische Spannungen in den SU-8-Strukturen</td>
			<td>Parameter wie Backzeit und Belichtungszeit optimieren</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer-Herstellung</td>
			<td>SU-8-Schichten zu niedrig, zu hoch oder ungleichmäßige Schichtdicke</td>
			<td>Problem während des Spin-Coatings</td>
			<td>Spin-Coater-Parameter und Wafer-Chuck überprüfen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chip-Bonding und -Montage</td>
			<td>Zusammenfallende PLBRs</td>
			<td>PDMS-Bonding-Parameter nicht optimal</td>
			<td>Leistung, Plasmabehandlungszeit und Backzeit nach dem Bonding anpassen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chip-Bonding und -Montage</td>
			<td>Verschmutzte Strukturen und Partikel in den PLBRs</td>
			<td>Chip wurde nicht ordnungsgemäß gereinigt</td>
			<td>Klebeband zur Oberflächenreinigung verwenden</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chip-Bonding und -Montage</td>
			<td>Unzureichende PDMS-Glas-Verbindung</td>
			<td>Bonding-Parameter nicht optimal oder unzureichende Reinigung</td>
			<td>Einstellungen der Sauerstoff-Plasma-Behandlung überprüfen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment</td>
			<td>Flüssigkeitsaustritt</td>
			<td>Zulauf-/Ablaufbohrung nicht korrekt gestanzt</td>
			<td>Stanzprozess optimieren</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment</td>
			<td>Viele kleine PDMS-Partikel während des Befüllens</td>
			<td>Bohrung nicht korrekt gestanzt</td>
			<td>Stanzprozess optimieren</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt</td>
			<td>Kein Zellwachstum</td>
			<td>Lösungsmittelrückstände aus dem Reinigungsprozess</td>
			<td>Chip vor der Zellbeladung gründlicher spülen oder Lösungsmittel vor dem Bonding verdunsten lassen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt</td>
			<td>Wechselnde Wachstumsraten</td>
			<td>Verschiedene Ursachen</td>
			<td>Vorkultur und Temperatur überprüfen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt</td>
			<td>Veränderungen der Zellmorphologie während der Kultivierung</td>
			<td>Nährstofflimitierung oder Temperaturschwankungen</td>
			<td>Inkubator und Durchfluss überprüfen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment, technischer Aspekt</td>
			<td>Positionsdrift während der Zeitraffermikroskopie</td>
			<td>Temperaturschwankungen</td>
			<td>Temperaturprofil vor den Experimenten überprüfen, bis keine Oszillation mehr auftritt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment, technischer Aspekt</td>
			<td>Verlust von Zellen während der Kultivierung</td>
			<td>Etwas zu große Reaktorhöhe</td>
			<td>Reaktorhöhe optimieren</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikrofluidisches Experiment, technischer Aspekt</td>
			<td>Kein Einfangen von Zellen</td>
			<td>Reaktorhöhe zu gering</td>
			<td>Reaktorhöhe optimieren</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Fehlerbehebung. Diese Tabelle fasst kritische Aspekte, häufige Fehler und mögliche Lösungen während der experimentellen Arbeit zusammen.

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Bakterien und sich entwickelnde isogene Mikrokolonien mit vollständiger räumlicher und zeitlicher Auflösung unter konstanten Umweltbedingungen mithilfe einer mikrofluidischen Kultivierungsvorrichtung zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidisches Kultivierungssystem mit Hilfe von CAD-Software konstruiert wird. Anschließend werden einzelverwendbare mikrofluidische Kultivierungsvorrichtungen aus Polydimethylsiloxan hergestellt, die Picoliter-Bioreaktoren enthalten, die einen Mikrometer Höhe aufweisen, um das Bakterienwachstum auf eine einzige Zellschicht zu beschränken.Es erfolgt die Infusion einer mikrobiellen Kultur in die mikrofluidische Vorrichtung, um einzelne Mutterzellen innerhalb der Bioreaktoren zu beimpfen. Diese Zellen werden durch kontinuierliche Zufuhr von Nährmedium durch das System vermehrt. Die Ergebnisse stammen aus der automatisierten Zeitraffermikroskopie und zeigen die Kultivierung eines industriell relevanten Stammes von Corynebacterium glutamicum, Wachstumsdaten sowie die Heterogenität zwischen den Zellen.In der konventionellen Biotechnologie basieren die meisten Analysen auf Durchschnittsdaten. Unser Mikrofluidik-Gerät ermöglicht die Einzelzellanalyse individueller Bakterien mit räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es ist ein nützliches Werkzeug, um die Zelle-zu-Zelle-Heterogenität isogener Mikrokolonien genau zu untersuchen.Wir wenden gängige SU-8-Photolithographie und Polydimethylsiloxan-Chip-Formgebung an, um Einweg-Mikrofluidikgeräte mit submikroskopischer Medienauflösung herzustellen. Unsere Technologie haben wir bereits erfolgreich mit mehreren biotechnischen Mikroorganismen wie Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum demonstriert. Zunächst entwirft man das mikrofluidische Gerät mithilfe einer CAD-Software.Das in diesem Protokoll vorgestellte Design besteht aus zwei Ansatzöffnungen, einem Gradientengenerator zur Mischung zweier unterschiedlicher Substrate, einer Auslassöffnung und sechs Arrays, die jeweils aus fünf Bioreaktoren bestehen. Bereiten Sie in einem Reinraum einen vier Zoll großen Siliziumwafer vor und beschichten Sie diesen mit einer Mikrometer dicken Schicht des Photoresists SU-8 2000.5, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie den beschichteten Wafer auf eine Heizplatte bei 95 Grad Celsius, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen, und führen Sie anschließend die erste photolithografische Maske, die die Fangbereiche der Picoliterreaktoren enthält, zusammen mit dem beschichteten Wafer in den Maskenaligner ein.Als Nächstes setzen Sie die Wafer im Vakuum-Kontaktverfahren drei Sekunden lang Licht mit einer Wellenlänge von 350 bis 400 Nanometern und einer Intensität von sieben Milliwatt pro Quadratzentimeter aus. Führen Sie danach einen Nachbelichtungs-Trockengang auf einer ebenen Heizplatte bei 95 Grad Celsius durch, um die Polymerisation von SU-8 einzuleiten. Danach tauchen Sie den Wafer eine Minute lang in ein Entwicklerbad mit SU-8 ein und überführen ihn anschließend für einige Sekunden in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler.Spülen Sie das Wafer in Isopropanol, um den SU-8-Entwickler zu entfernen, und trocknen Sie das Wafer mit Stickstoffstrom oder einem Wafer-Spinner. Anschließend führen Sie eine Hartsinterung des Wafers für 10 Minuten bei 150 Grad Celsius durch. Danach stellen Sie die zweite Schicht wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben her, um die Urform abzuschließen.Beginnen Sie die Herstellung des PDMS-Chips, indem Sie die Basis und das Trägermedium im Verhältnis 10 zu 1 mischen. Entgasen Sie die PDMS-Mischung etwa 30 Minuten lang in einem Vakuum-Exsikkator, bis alle Blasen verschwunden sind. Danach wird der SU-8-Wafer in eine Gießform gegeben und eine dreimillimeterdicke Schicht der PDMS-Mischung auf den Wafer gegossen.Backen Sie dann das PDMS drei Stunden lang bei 80 Grad Celsius in einem Ofen. Nach dem Abkühlen entfernen Sie den PDMS-Block vorsichtig vom Wafer und schneiden ihn mit einem sauberen und scharfen Skalpell in einzelne Chips. Waschen Sie die Chips 90 Minuten lang in einem n-Pentan-Bad, gefolgt von zwei Aceton-Waschbädern à 90 Minuten.Trocknen Sie die Chips über Nacht, um eventuelle Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Unmittelbar vor dem Experiment stanzen Sie die Einlass- und Auslassöffnungen in den PDMS-Chip, indem Sie eine Nadel oder einen Locher mit einem leicht kleineren Durchmesser als die Anschlüsse verwenden, die zum Verbinden der Schläuche mit dem PDMS-Chip dienen. Reinigen Sie anschließend den mikrofluidischen PDMS-Chip vorsichtig mit Isopropanol und entfernen Sie mithilfe von Klebeband eventuell anhaftende Staubpartikel.Reinigen Sie außerdem einen 170 µm dünnen Glasobjektträger zunächst mit Aceton, danach mit Isopropanol und anschließend mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie den Objektträger mit einem Stickstoffstrom ab. Sobald der Träger sauber und trocken ist, oxidieren Sie den Glasobjektträger und den PDMS-Chip 25 Sekunden lang mittels Plasmabehandlung bei einer Leistung von 50 Watt und einer Sauerstoffströmungsrate von 20 sccm. Danach richten Sie den PDMS-Chip sorgfältig gegenüber dem Glas aus und legen ihn vorsichtig auf das Glas, wodurch innerhalb von Sekunden eine Bindung entsteht.Stabilisieren Sie die Bindung, indem Sie die Apparatur 10 Sekunden lang bei 80 Grad Celsius backen. Um die Bakterien für ein Chip-Experiment vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie eines gewünschten Bakterienstamms, beispielsweise C.glutamicum, in 20 Milliliter frisches BHI-Medium an und inkubieren die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem rotierenden Schüttler mit 120 U/min. Am nächsten Morgen übertragen Sie 10 Mikroliter der Startkultur in eine zweite Kultur, die 20 Milliliter des gewünschten Mediums enthält, und lassen die Zellen über Nacht unter denselben Bedingungen wachsen.Am nächsten Tag das Inkubatorgefäß eines umgekehrten Mikroskops auf 30 Grad Celsius vorwärmen. Dies kann je nach individueller Einrichtung bis zu zwei Stunden dauern. Während die Einrichtung erwärmt wird, öffnen Sie das Inkubatorgefäß, wählen Sie das gewünschte Objektiv aus und bereiten Sie es mit dem erforderlichen Montagemedium vor.Danach wird der Chip in der Chip-Halterung montiert und fixiert. Das Probenstück wird in der Mitte des Mikroskops zentriert, und es erfolgt die Fokussierung auf die Picoliter-Bioreaktor-Anordnungen. Wenn der Chip scharfgestellt ist, werden die Ein- und Ausgänge mit geeigneten Schläuchen verbunden, und das Auslassrohr wird in einen Abfallbehälter platziert.Füllen Sie als Nächstes eine Spritze mit frischem Kulturmedium, setzen Sie sie in eine Spritzenpumpe ein und spülen Sie die mikrofluidischen Kanäle eine Stunde lang bei einer Flussrate von 200 Nanolitern pro Minute durch, um den Chip vorzubefüllen. Solange sich die Zellen noch in der frühen exponentiellen Wachstumsphase befinden, überführen Sie ein Milliliter der Bakterienkultur in eine sterile Spritze und ersetzen Sie die Spritze und die Schläuche, die Kulturmedium enthalten, durch die Zellsuspension und frische Schläuche. Infundieren Sie die Zellsuspension in die Kanäle mit einer volumetrischen Flussrate von 200 Nanolitern pro Minute, bis die meisten Pikoliter-Bioreaktoren gefüllt sind.Wenn nur eine kleine Anzahl von Bioreaktoren befüllt ist, erhöhen Sie die Flussrate auf 800 bis 1200 Nanoliter pro Minute. Sobald die gewünschte Zellmenge eingeseedet wurde, trennen Sie die Zellsuspension ab, schließen das Wachstumsmedium wieder an den Chip an und perfundieren mit frischem Medium bei 100 Nanoliter pro Minute. Danach scannen Sie den Chip und wählen spezifische Bioreaktoren für die Zeitrafferaufnahme aus.Konfigurieren Sie anschließend eine Zeitrafferaufnahme, um die Bioreaktoren über den gesamten Zeitraum des Experiments hinweg abzubilden und das Experiment zu starten. Sobald alle Picoliter-Bioreaktoren überwachsen sind, beenden Sie das Experiment und entsorgen Sie die Chips gemäß den Vorschriften. Um mit der Analyse zu beginnen, ermitteln Sie zunächst, welche Bioreaktoren alle gewünschten Kriterien des Experiments erfüllen, beispielsweise die Anzahl und Position der Mutterzellen.Bestimmen Sie mithilfe eines Analyseprogramms, wie beispielsweise ImageJ, die Wachstumsrate jedes Mikrokolonie, indem Sie die Anzahl der Zellen zu jedem Zeitpunkt zählen. Berechnen Sie die maximale Wachstumsrate durch Auftragen der Zeit gegen den Logarithmus der Zellanzahl. Das hier vorgestellte System kann angewendet werden, um verschiedene bakterielle Spezies hinsichtlich unterschiedlicher biologischer Parameter wie Wachstum, Morphologie oder eines fluoreszierenden Signals zu untersuchen.In diesem Beispiel wurde C. glutamicum unter Standardkultivierungsbedingungen kultiviert, und die resultierenden Wachstumskurven, abgeleitet von drei isogenen Mikrokolonien, sind hier dargestellt. Die Piko-Liter-Bioreaktoren haben sich ebenfalls als nützlich erwiesen, um die Proteinsynthese mittels zeitraffender Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen, wie hier gezeigt. Durch die Exposition der Zellen gegenüber einer niedrigen Konzentration des Proteininduktors IPTG können zelluläre Unterschiede im Proteininhalt auf Einzelzellniveau innerhalb von Kolonien, beginnend mit einer einzigen Mutterzelle, untersucht werden.Die demonstrierte Technik kann angewendet werden, um einzelne Bakterienzellen unter perfekter Umweltkontrolle zu überwachen und zu analysieren. Dies ist mit herkömmlichen Labormaßstab-Kultivierungssystemen kaum möglich. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Kultivierungs-Chips vorbereitet, um vergleichbare Einzelzell-Analysen durchzuführen.

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Forschung

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Mikrofluidischer Pikolitere Bioreaktor für mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemeinrichtung und Betrieb

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Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

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Automatisierte mikrobielle monoklonale Kultivierung und Ernte mit hohem Durchsatz mit dem Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System

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Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

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