Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Bakterien und sich entwickelnde isogene Mikrokolonien mit voller räumlicher und zeitlicher Auflösung unter konstanten Umweltbedingungen mit Hilfe eines mikrofluidischen Kultivierungsgeräts zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidisches Kultivierungssystem mit Hilfe einer CAD-Software entworfen wird. Als nächstes werden mikrofluidische Einweg-Kultivierungsgeräte aus Polydimethylsiloxan hergestellt, die Pikoliter-Bioreaktoren mit einer Höhe von einem Mikrometer und einer Höhe enthalten, um das Wachstum von Bakterien auf Monolayer-Wachstum zu beschränken.

Die mikrobielle Kultur wird dann in das mikrofluidische Gerät infundiert, um einzelne Mutterzellen in den Bioreaktoren zu beimpfen. Diese Zellen werden durch kontinuierliche Infusion von Wachstumsmedium durch das System expandiert. Die Ergebnisse stammen aus der automatisierten Zeitraffermikroskopie, die die Kultivierung eines industriell relevanten Stammes von Corynebacterium glutamicum, Wachstumsdaten und die Zell-Zell-Heterogenität zeigt.

In der konventionellen Biotechnologie basieren die meisten Analysen auf durchschnittlichen Daten. Unsere Mikrofluidikgeräte ermöglichen die Einzelzellanalyse einzelner Bakterien mit räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es ist ein nützliches Werkzeug, um die Heterogenität von Zelle zu Zelle von isogenen Mikrokolonien genau zu betrachten.

Wir verwenden gängige SU-8-Photolithographie und Polydimethylsiloxan-Chipformung, um mikrofluidische Einweggeräte mit einer Auflösung von Submikromedien herzustellen. Wir haben unsere Technologie erfolgreich mit mehreren biotechnischen Mikroorganismen wie Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum demonstriert. Entwerfen Sie zunächst das mikrofluidische Gerät mit Hilfe einer CAD-Software.

Das in diesem Protokoll vorgestellte Design besteht aus zwei Seeding-Einlässen, einem Gradientengenerator zum Mischen von zwei verschiedenen Substraten, einem Auslass und sechs Arrays, die aus jeweils fünf Bioreaktoren bestehen. Bereiten Sie in einem Reinraum einen 4-Zoll-Siliziumwafer vor und drehen Sie einen Mikrometer SU-8 2000,5-Fotolack auf den Wafer, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie den beschichteten Wafer auf eine heiße Platte bei 95 Grad Celsius, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen, und setzen Sie dann die erste Schicht-Fotomaske ein, die aus den Einfangbereichen der Pikoliterreaktoren und dem beschichteten Wafer besteht, in den Masken-Aligner.

Anschließend setzen Sie den Wafer im Vakuumkontaktmodus drei Sekunden lang 350 bis 400 Nanometern Licht mit einer Intensität von sieben Milliwatt pro Quadratzentimeter aus. Führen Sie nach der Belichtung ein Backen auf einer ebenen Heizplatte bei 95 Grad Celsius durch, um die Polymerisation von SU-8 zu initiieren. Legen Sie den Wafer anschließend für eine Minute in ein SU-8-Entwicklerbad und überführen Sie den Wafer dann für einige Sekunden in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler.

Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol, um den SU-8-Entwickler zu entfernen und den Wafer mit Stickstofffluss oder einem Wafer-Spinner zu trocknen. Dann die Waffel 10 Minuten bei 150 Grad Celsius hart backen. Stellen Sie als Nächstes die zweite Schicht her, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben, um die Masterform zu vervollständigen.

Beginnen Sie mit der Herstellung des PDMS-Chips, indem Sie die Basis und das Trägermittel im Verhältnis 10 zu eins mischen. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch ca. 30 Minuten lang in einem Vakuumexsikkator, bis alle Blasen verschwunden sind. Legen Sie als Nächstes den SU-8-Wafer in eine Formvorrichtung und gießen Sie eine drei Millimeter dicke Schicht PDMS-Mischung auf den Wafer.

Anschließend das PDMS drei Stunden bei 80 Grad Celsius im Ofen backen. Nach dem Abkühlen die PDMS-Platte vorsichtig vom Wafer abziehen und mit einem sauberen und scharfen Skalpell in einzelne Chips schneiden. Waschen Sie die Chips 90 Minuten lang in einem n-Pentanbad, gefolgt von zwei Aceton-Waschbädern für jeweils 90 Minuten.

Trocknen Sie die Späne über Nacht, um Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Stanzen Sie kurz vor dem Experiment die Einlass- und Auslasslöcher mit einer Nadel oder einem Locher in den PDMS-Chip, dessen Durchmesser etwas kleiner ist als bei den Anschlüssen, die zum Verbinden von Schläuchen mit dem PDMS-Chip verwendet werden. Reinigen Sie anschließend den mikrofluidischen PDMS-Chip vorsichtig mit Isopropanol und verwenden Sie Klebeband, um anhaftende Staubpartikel zu entfernen.

Reinigen Sie außerdem einen 170 Mikrometer dünnen Objektträger zuerst mit Aceton, dann mit Isopropanol, gefolgt von entionisiertem Wasser, und trocknen Sie den Objektträger mit einem Stickstoffstrahl. Nach der Reinigung und Trocknung oxidieren Sie den Objektträger und den PDMS-Chip 25 Sekunden lang mit einer Leistung von 50 Watt und einem Sauerstofffluss von 20 sccm. Richten Sie dann das PDMS und den Glaschip vorsichtig aus, bevor Sie das PDMS auf das Glas aufsetzen, wodurch es sich in Sekundenschnelle verbindet.

Sichern Sie die Verbindung, indem Sie das Setup 10 Sekunden lang bei 80 Grad Celsius backen. Um die Bakterien für ein Chip-Experiment vorzubereiten, inokulieren Sie eine einzelne Kolonie eines gewünschten Bakterienstamms, wie z. B. C.glutamicum, in 20 Milliliter frisches BHI-Medium und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einem Rotationsschüttler bei 120 U/min. Am nächsten Morgen werden 10 Mikroliter der Starterkultur in eine zweite Kultur mit 20 Millilitern des gewünschten Mediums überführt und die Zellen über Nacht unter den gleichen Bedingungen wachsen gelassen.

Am nächsten Tag heizen Sie den Inkubator eines inversen Mikroskops auf 30 Grad Celsius vor. Dies kann je nach individueller Einrichtung bis zu zwei Stunden dauern. Während sich der Aufbau erwärmt, öffnen Sie den Inkubator, wählen Sie das gewünschte Objektiv aus und bereiten Sie es mit dem erforderlichen Eindeckmedium vor.

Montieren Sie dann den Chip in den Chiphalter und befestigen Sie ihn. Zentrieren Sie die Probe auf dem Mikroskop und fokussieren Sie sie in die Pikoliter-Bioreaktorarrays. Verbinden Sie mit dem Chip im Fokus die Ein- und Auslässe mit den entsprechenden Schläuchen und legen Sie die Auslassschläuche dann in einen Abfallbehälter.

Füllen Sie anschließend eine Spritze mit frischem Medium, geben Sie sie in eine Spritzenpumpe und spülen Sie die mikrofluidischen Kanäle eine Stunde lang mit einer Durchflussrate von 200 Nanolitern pro Minute, um den Chip zu entleeren. Während sich die Zellen noch in der frühen exponentiellen Wachstumsphase befinden, überführen Sie einen Milliliter der Bakterienkultur in eine sterile Spritze und ersetzen Sie die Spritze und den Schlauch mit dem Medium durch die Zellsuspension und den frischen Schlauch. Die Zellsuspension wird mit einem Volumenstrom von 200 Nanolitern pro Minute in die Kanäle infundiert, bis die meisten Pikoliter-Bioreaktoren gefüllt sind.

Wenn nur eine kleine Anzahl von Bioreaktoren befüllt wird, erhöhen Sie die Durchflussrate auf 800 bis 1200 Nanoliter pro Minute. Wenn die gewünschte Menge an Zellen ausgesät wurde, trennen Sie die Zellsuspension, verbinden Sie das Wachstumsmedium wieder mit dem Chip und perfundieren Sie mit frischem Medium mit 100 Nanolitern pro Minute. Scannen Sie als Nächstes den Chip und wählen Sie bestimmte Bioreaktoren für die Zeitraffer-Bildgebung aus.

Konfigurieren Sie dann eine Zeitraffer-Mikroskopiesequenz, um die Bioreaktoren von Anfang bis Ende abzubilden und das Experiment zu beginnen. Sobald alle Pikoliter-Bioreaktoren überwachsen sind, stoppen Sie das Experiment und entsorgen Sie die Chips entsprechend. Um mit der Analyse zu beginnen, bestimmen Sie zunächst, welche Bioreaktoren alle gewünschten Kriterien für das Experiment wie Anzahl und Position der Mutterzellen erfüllen.

Bestimmen Sie mit einem Analyseprogramm, wie z. B. Bild J, die Wachstumsrate jeder Mikrokolonie, indem Sie die Anzahl der Zellen zu jedem Zeitpunkt zählen. Berechnen Sie die maximale Wachstumsrate, indem Sie die Zeit mit dem Logarithmus der Zellennummer vergleichen. Das hier vorgestellte System kann angewendet werden, um verschiedene Bakterienarten in Bezug auf unterschiedliche biologische Parameter wie Wachstum, Morphologie oder ein Fluoreszenzsignal zu untersuchen.

In diesem Beispiel wurde C.glutamicum unter Standard-Kultivierungsbedingungen kultiviert und die resultierenden Wachstumskurven, die von drei isogenen Mikrokolonien abgeleitet wurden, sind hier dargestellt. Die Pikoliter-Bioreaktoren haben sich auch als nützlich erwiesen, um durch den Einsatz von Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie Zugang zur Proteinproduktion zu erhalten, wie hier gezeigt. Indem die Zellen einer niedrigen Konzentration des Proteininduktors IPTG ausgesetzt werden, können die Zell-Zell-Variationen des Proteins auf Einzelzellebene innerhalb von Kolonien, ausgehend von einer einzelnen Mutterzelle, untersucht werden.

Die demonstrierte Technik kann zur Überwachung und Analyse einzelner Bakterienzellen mit perfekter Umgebungskontrolle angewendet werden. Dies ist mit herkömmlichen Anbausystemen im Labormaßstab kaum möglich. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mikrofluidische Kultivierungschips für die Durchführung vergleichbarer Einzelzellanalysen vorbereiten.