Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, das Bakterienwachstum präzise und mit hohem Durchsatz zu analysieren. Mit diesem Verfahren können entweder mehrere Medien oder unterschiedliche Stämme gleichzeitig getestet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Systembiologie und der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. welche Bestimmungsfaktoren für das Zellwachstum sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, globale Parameter der maximalen Wachstumsrate und der maximalen Populationsdichte in den Wachstumskurven von Bakterienzellen genau zu bewerten. Obwohl diese Methode einen Einblick in e. Coli-Wachstum, es kann auch auf andere Mikroorganismen angewendet werden, wie z. B. den Wachstumsassay und das Screening von Umweltbakterien.

Legen Sie zunächst fünf sterilisierte Glasröhrchen mit Silikonkautschukstopfen, Pipetten und den Zielstämmen auf eine saubere Bank. Setzen Sie die Öffnung des Glasrohrs einem Bunsenbrenner aus, bevor Sie den Silikonkautschukstopfen öffnen. Setzen Sie den Silikonkautschukstopfen nach dem Öffnen des Rohrs der Flamme aus und setzen Sie die Kappe dann leicht wieder auf das Glasrohr.

Geben Sie anschließend mit der elektronischen Pipette und der serologischen Einwegpipette fünf Milliliter M63 in eines der Glasröhrchen und 4,5 Milliliter M63 in die anderen vier Röhrchen. Mit der p200-Spitze eine Kolonie auswählen und in das Glasröhrchen mit fünf Millilitern M63 impfen. Wirbeln Sie das Rohr vor, um eine Suspension herzustellen.

Verdünnen Sie dann die Lösung um das 10-fache, indem Sie 0,5 Milliliter dieser Lösung in eines der vier Röhrchen mit 4,5 Millilitern M63 überführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Röhrchen. Nachdem Sie die Mündungen der Glasröhrchen und die Verschlüsse aus Silikonkautschuk sterilisiert haben, verschließen Sie die Röhrchen mit den Stopfen.

Legen Sie dann die fünf Röhrchen in einen vorgewärmten Schüttelbrutator bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie ihn mit 200 U/min. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht oder für 10 bis 30 Stunden. Nach der Inkubation 1.000 Mikroliter M63 in eine Einwegküvette mit dem p1000 geben.

Legen Sie die Einwegküvette in ein Spektralphotometer. Starten Sie das Programm bei einer festen Wellenlänge von 600 Nanometern und messen Sie den Rohling. Bewegen Sie die fünf Glasröhrchen aus dem Schüttelbrutschrank auf die Reinbank.

Entsorgen Sie M63 aus der Einwegküvette und geben Sie 1.000 Mikroliter Kultur in dieselbe Einwegküvette mit der p1000. Messen Sie dann die optische Trübung der Zellkultur. Geben Sie anschließend 250 Mikroliter sterilisierte 60%ige Glycerinlösung und 750 Mikroliter der ausgewählten Zellkultur in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und mischen Sie es durch Pipettieren.

Legen Sie die restlichen neun Mikroröhrchen in den Mikroröhrchenständer und geben Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mischung in jedes Röhrchen. Lagern Sie die Vorräte im Tiefkühlschrank bei 80 Grad Celsius. Um den Mikroplatten-Reader einzurichten, öffnen Sie zunächst die Software, öffnen Sie Protokolle im Task-Manager und wählen Sie Neu erstellen.

Wählen Sie dann das Standardprotokoll aus. Öffnen Sie den Vorgang und passen Sie die Einstellungen an. Öffnen Sie die eingestellte Temperatur und wählen Sie den Inkubator ein.

Stellen Sie dann die Temperatur auf 37 Grad Celsius und den Gradienten auf null Grad Celsius ein. Überprüfen Sie das Vorheizen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Öffnen Sie den kinetischen Start, und stellen Sie die Laufzeit auf 24 oder 48 Minuten ein, dann stellen Sie das Intervall auf 30 Minuten oder eine Stunde ein.

Öffnen Sie Shake und stellen Sie den Shake-Modus auf linear ein. Überprüfen Sie den kontinuierlichen Shake und stellen Sie die Frequenz auf 567 cpm ein. Öffnen Sie anschließend den Read, überprüfen Sie die Absorption, den Endpunkt/die Kinetik und die Monochromatoren.

Stellen Sie die Wellenlänge auf 600 ein. Klicken Sie abschließend auf Validieren, um zu bestätigen, dass das Verfahren korrekt ist. Klicken Sie auf Speichern, um es als neues Programm für die zukünftige Verwendung zu speichern.

Für eine Echtzeitaufzeichnung des Wachstums geben Sie ca. 25 Milliliter M63 in ein sterilisiertes Reagenzreservoir. Geben Sie dann 900 Mikroliter M63 in die Mikroröhrchen, um die seriellen Verdünnungen vorzubereiten. Fügen Sie als nächstes 900 Mikroliter M63 zum aufgetauten Glycerinvorrat hinzu und wirbeln Sie ihn ein.

100 Mikroliter der 10-fachen Verdünnung werden in ein anderes Mikroröhrchen mit 900 Mikrolitern M63 überführt und vortexen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen erreicht ist. Füllen Sie nun die Vertiefungen am Rand einer sterilisierten 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden mit 200 Mikrolitern M63 mit einer Achtkanalpipette.

Laden Sie 200 Mikroliter jeder verdünnten Probe gemäß der Referenztabelle in die Mikrotiterplatten-Wells. Um Zuordnungsschichten aufgrund der Erwärmung und der Aussaateffizienz zu vermeiden, verwenden Sie niemals die Vertiefungen am Rand der Mikroplatte für Ihre Proben und laden Sie dieselbe Probe in mehrere Vertiefungen an verschiedenen Stellen auf der Mikroplatte. Setzen Sie die 96-Well-Mikroplatte auf den Plattenleser ein.

Öffnen Sie den "Jetzt lesen"- und Task-Manager und wählen Sie das Programm aus. Klicken Sie auf OK, um mit der Messung zu beginnen. Speichern Sie abschließend die Aufzeichnung als neue experimentelle Datei für die Datenanalyse.

Hier sehen Sie ein Beispiel für eine Referenztabelle, die vor dem Durchführen des Experiments erstellt wurde. Ein Piktogramm der 96-Well-Platte wurde als acht x 12 große Tabelle gezeichnet, um die Positionen der inokulierten Kulturproben auf der 96-Well-Platte anzuzeigen. Die Wachstumsrate wird berechnet, indem die Gleichung für alle Paare aufeinanderfolgender Werte von OD600 angewendet wird.

Der Mittelwert und die Standardabweichung von fünf aufeinanderfolgenden Wachstumsraten wurden berechnet, um die maximale Wachstumsrate zu schätzen. Die Wachstumsraten von insgesamt 60 Zellkulturen werden als angezeigte Heatmap angezeigt. Die Degradation von Weiß nach Rot gibt die Wachstumsraten von niedrig nach hoch an.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb weniger Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig und in der richtigen Reihenfolge ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben vorbereiten und auf die Mikroplatte laden, um hochpräzise Messungen des Bakterienwachstums mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vor der Durchführung des Experiments eine Referenztabelle zu erstellen, um Zellkulturen mit geringer Dichte zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Zellen innerhalb von 24 Stunden zu wachsen beginnen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Automatisierung der experimentellen Manipulation und die computergestützte Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Bestimmungsfaktoren für die Ausbreitung der Population und die Dynamik vorliegen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Systembiologie und Mikrobiologie. Erforschung der grundlegenden Prinzipien des Zellwachstums und Optimierung der Zusammensetzung von Kulturmedien.