Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in Pseudomonas aeruginosa

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung kleiner Moleküle, die die intrazellulären Spiegel des zweiten Botenstoffs cyclic-di-GMP im opportunistischen Erreger Pseudomonas aeruginosa mit Hilfe eines Hochdurchsatz-Bioreporter-Screenings modulieren. Diese Methode kann helfen, kleine Moleküle aufzudecken, die die Bioinformation von Pseudomonas aeruginosa und andere Partikel durch zyklische di-GMP-Modulation stören. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr robust und vielseitig ist und das Screening von mehr als 3.500 Verbindungen innerhalb von 48 Stunden ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung neuartiger Therapien, die möglicherweise gegen Pseudomonas aeruginosa, das Immunsystem oder bestehende Antibiotika sensibilisieren, während sie einen geringeren, selektiven Druck auf die Bakterien ausüben. Innokulieren Sie fünf Millileter Lysogeniebrühe oder LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von P.aeruginosa, sieben Grad Celsius, unter Schütteln bei 200 U/min. Dann werden zwei Milliliter der Nachtkultur in 200 Milliliter frisches LB-Medium in einen Ein-Liter-Kolben überführt und bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert.

Die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 wird alle 30 Minuten überwacht, indem eine 1-Milliliter-Probe aus dem Kolben entnommen und mit einem Spektralphotometer untersucht wird. Wenn der OD 600 einen Wert zwischen 0,3 und 0,5 erreicht, geben Sie 40 Millileter der Kultur in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 8000 U/min bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 40 Millilitern eiskalter, steriler 300-Millimola-Saccharoselösung resuspendiert. Nachdem Sie die Zellen ein zweites Mal zentrifugiert haben, resuspendieren Sie die Zellen in 20 Millilitern eiskalter steriler 300 Millimolar Saccharoselösung. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie in 400 Mikrolitern der 300 Millimolaren Saccharoselösung. Kühlen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis, danach sind sie bereit für die Elektroporation.

Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter einer 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter Plasmidlösung, die für den CdrA-Promotor kodiert, zu dem Gen, das für das grün fluoreszierende Protein kodiert, zu 40 Mikrolitern der vorbereiteten elektrokompetenten P.Aeruginosa-Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das auf Eis vorgekühlt wurde. Mischen Sie die Suspension und geben Sie sie in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit Elektrodenspalt von 2 Millimetern. Entfernen Sie die Feuchtigkeit von der Außenseite der Küvette mit Seidenpapier und legen Sie die Küvette in die Probenkammer des Elektroporators.

Die Lösung wird mit einer Spannung von 2,5 Kilovolt, Kapazitäten von 25 Mikrofarad und einem Widerstand von 200 Ohm gepulst. Entfernen Sie die Küvette und fügen Sie einen Milliliter LB-Medium hinzu. Dann werden die Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und Schütteln bei 200 U/min inkubiert.

Nach der Inkubation verteilen Sie 10 Mikroliter, 50 Mikroliter und 100 Mikroliter Aliquots der Kultur auf sterile LB-Agarplatten, die mit Ampicillin angereichert sind, und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie die GFP-Expression, indem Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-GFP-Kanal untersuchen. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie in fünf Milliliter LB. Nach der Inkubation über Nacht 0,5 Milliliter der Nachtkultur mit 0,5 Millilitern 50%igem Glycerin in einem 2-Milliliter-Schraubröhrchen mischen und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Zwei Tage vor dem Screening wird der vorbereitete P.aeruginosa-Stamm aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Stamm auf eine LB-Agarplatte aufgefüllt, indem die Bakterien mit einer sterilen Impfschlaufe vorsichtig auf der Platte verteilt werden. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am Abend vor dem Screening inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von P.aeruginosa aus der Platte in 10 Milliliter LB-Medium in einem Röhrchen.

Inkubieren Sie die Vorkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Bereiten Sie am Tag der Siebung eine Subkultur aus der Nacht-Vorkultur vor, indem Sie sie zuerst mit frischem LB-Medium auf einen OD 600 von 1,0 verdünnen und dann weiter mit 5 %LB auf einen OD 600 von 04 verdünnen. Geben Sie einen sterilen Magnetrührstab in den Behälter und rühren Sie die Kultur bei minimaler Geschwindigkeit auf einem Magnetrührer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur um.

Auf diese Weise können sich die Bakterien an das Medium gewöhnen, bevor sie in 384-Well-Platten abgegeben werden. Zur Vorbereitung der Positivkontrolle werden 20 Mikroliter Tobramycinsulfat zu 10 Millilitern der vorbereiteten Subkultur gegeben und vorsichtig gemischt. Pipettieren Sie 40 Mikroliter der Positivkontrollkultur in die Vertiefungen A23 bis P23.

Zur Vorbereitung der Negativkontrolle werden 30 Mikroliter Dimethylsulfoxid zu 10 Millilitern der vorbereiteten Subkultur gegeben und vorsichtig gemischt. Pipettieren Sie 40 Mikroliter der negativen Kontrollkultur in die Vertiefungen A24 bis P24. Für jede der mit den kleinen Molekülen befeuchteten Platten wird ein Volumen von 40 Mikrolitern der verdünnten Übernachtkulturen in die Vertiefungen A1 bis P22 inokuliert.

Verschließen Sie die Platten mit einem luftdurchlässigen Deckel und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung wird das Plattenlesegerät auf 37 Grad Celsius vorgewärmt, um Kondensation zu vermeiden. Entfernen Sie vor dem Lesen vorsichtig die luftdurchlässige Deckeldichtung von der Platte.

Messen Sie dann die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden. Nehmen Sie vor der Messung der Fluoreszenz eine automatische Verstärkungs- und Fokusanpassung auf der Grundlage der negativen Kontrollvertiefung A24 vor und stellen Sie den Verstärkungszielwert auf 75 % ein. Wählen Sie die Fokuseinstellung und den Kanal A auf der rechten Seite des Fensters. Messen Sie die Fluoreszenz des GFP-Reporters bei einem Anregungsmaximum von 485 Nanometern und einem Emissionsmaximum von 520 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden.

Sammeln Sie Daten von allen untersuchten Platten. Die Messwerte werden von der Steuerungssoftware des Plattenlesers automatisch als Standard gespeichert. Um die Daten zu analysieren, sehen Sie sich die Messwerte an, indem Sie auf das Mars-Symbol in der Steuerungssoftware klicken, um das statistische Analysepaket zu öffnen.

Rufen Sie die Daten ab, indem Sie auf die gewünschte Plattennummer doppelklicken, um auf die Daten für die Analyse zuzugreifen. Bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays mit einer robusten Z-Prime-Analyse. Berechnen Sie dann die prozentuale Hemmung des Wachstums und bewerten Sie die prozentuale Hemmung des intrazellulären Spiegels von c-di-GMP, wie im Textprotokoll beschrieben.

Diese Abbildung beschreibt repräsentative Rohdaten für OD 600 und GFP aus dem Hochdurchsatz-Screening. Auf die Well-Werte wurde eine Farbverlaufs-Heatmap mit heißen bis kühlen Farben angewendet, die niedrige bis hohe Werte anzeigen. Die generierten Daten werden auf prozentuale Hemmung analysiert und sind hier sowohl für die OD 600- als auch für die GFP-Messwerte dargestellt.

Kleine Moleküle, die möglicherweise das Wachstum hemmen, und intrazelluläre c-di-GMP-Spiegel werden tendenziell grün angezeigt, während kleine Moleküle, die möglicherweise das Wachstum und die intrazellulären c-di-GMP-Spiegel fördern, tendenziell rot sind. Streudiagramme werden verwendet, um die prozentuale Hemmung zu vergleichen, die von jedem getesteten kleinen Molekül erhalten wurde. Jedes kleine Molekül wird durch einen kleinen Punkt dargestellt und die prozentuale Hemmverteilung für jeden der OD 600- und GFP-Messwerte wird angezeigt.

Für die Trefferidentifikation wird ein Cutoff von plus oder minus 50 % gewählt. Mögliche Treffer werden rot hervorgehoben. Dosis-Wirkungs-Assays werden für jede interessante Verbindung durchgeführt.

Hier werden zwei identifizierte Verbindungen in einem 10-Punkt-Dosis-Wirkungs-Assay mit einer Spitzenkonzentration von zwei Millimolaren und einer zweifachen Verdünnungsreihe getestet. Die Anpassung einer logistischen Funktion mit vier Parametern an die Daten ergab halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte für jede Verbindung von 158 Mikromolaren und 193 Mikromolaren. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um innerhalb von 48 Stunden mehr als 3.500 Verbindungen zu screenen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Pseudomonas aeruginosa robust auf Verbindungen untersuchen können, die die zyklische di-GMP-Signalgebung stören. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Screening-Bedingungen bei einem Screening über mehrere Tage vergleichbar zu halten. Nach einem Einzelpunkt-Screen, der mit einem Dirsk-Antwort-Screen unter Verwendung desselben Protokolls ausgeführt wird, können die Treffer validiert werden.

Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, potenzielle kleine Moleküle zu identifizieren, die die bi fiful Information und die Antibiotikaresistenz von Pseudomonas aeruginosa beeinträchtigen. Wichtig ist, dass diese Technik so angepasst werden kann, dass sie für alle Bakterien von Interesse verwendet werden kann, und modifiziert werden kann, um andere Outputs oder Inputs zu untersuchen, wie z. B. einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Bakterien. Vergessen Sie schließlich nicht, dass die Arbeit mit Pseudomonas aeruginosa gefährlich sein kann.

Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.