Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Hochdurchsatz-Bioreporterscreens kleine Moleküle zu identifizieren, die die intrazellulären Konzentrationen des sekundären Botenstoffs cyclisch-di-GMP im opportunistischen Pathogen Pseudomonas aeruginosa modulieren. Diese Methode kann dazu beitragen, kleine Moleküle aufzudecken, die durch Modulation von cyclisch-di-GMP die Biofilmbildung von Pseudomonas aeruginosa und anderer Partikel beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer hohen Robustheit und Vielseitigkeit, wodurch innerhalb von 48 Stunden die Untersuchung von mehr als 3.500 Verbindungen möglich ist.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Entwicklung neuartiger Therapien, die Pseudomonas aeruginosa möglicherweise gegenüber dem Immunsystem oder bestehenden Antibiotika empfindlicher machen, während sie einen geringeren, selektiven Druck auf die Bakterien ausüben. Inokulieren Sie fünf Milliliter Lysogenie-Brühe oder LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie von P. aeruginosa bei sieben Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min. Überführen Sie anschließend zwei Milliliter der Übernachtkultur in 200 Milliliter frisches LB-Medium in einer Ein-Liter-Flasche und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min.

Überwachen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 alle 30 Minuten, indem Sie eine 1-Milliliter-Probe aus dem Kolben entnehmen und mit einem Spektrophotometer untersuchen. Wenn die OD 600 zwischen 0,3 und 0,5 erreicht, geben Sie 40 Milliliter der Kultur in ein 50-Milliliter-Konischglas für die Zentrifuge. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 40 Milliliter eiskalter steriler 300 Millimolar Saccharoselösung. Nachdem die Zellen ein zweites Mal zentrifugiert wurden, resuspendieren Sie sie in 20 Milliliter eiskalter steriler 300 Millimolar Saccharoselösung. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie sie in 400 Mikroliter der 300 Millimolar Saccharoselösung. Kühlen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis ab; danach sind sie bereit für die Elektroporation.

Fügen Sie anschließend ein Mikroliter einer 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter Lösung des Plasmids, das den CdrA-Promotor kodiert, zusammen mit dem Gen, das das grün fluoreszierende Protein kodiert, zu 40 Mikrolitern der vorbereiteten elektrokompententen P. Aeruginosa-Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das zuvor auf Eis vorgekühlt wurde. Mischen Sie die Suspension und überführen Sie sie in eine vorab gekühlte Elektroporationsküvette mit einem Elektrodenabstand von 2 Millimetern. Entfernen Sie Feuchtigkeit an der Außenseite der Küvette mit einem Papiertuch und stellen Sie die Küvette in die Probenkammer des Elektroporators.

Pulsen Sie die Lösung mit einer Spannung von 2,5 Kilovolt, Kapazitäten von 25 Mikrofarad und einem Widerstand von 200 Ohm. Entfernen Sie die Küvette und geben Sie ein Milliliter LB-Medium hinzu. Überführen Sie anschließend die Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min.

Nach der Inkubation 10 Mikroliter, 50 Mikroliter und 100 Mikroliter Aliquots der Kultur auf sterilem LB-Agarplatten, die mit Ampicillin ergänzt wurden, ausplattieren und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren. Die GFP-Expression durch Untersuchung der Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-GFP-Kanal bestätigen. Eine einzelne Kolonie auswählen und in fünf Milliliter LB ansäen. Nach der Übernacht-Inkubation 0,5 Milliliter der Übernachtkultur mit 0,5 Milliliter 50 % Glycerin in einem 2-Milliliter-Schraubglas mischen und bei minus 80 °C lagern.

Zwei Tage vor dem Screening impfen Sie den vorbereiteten P.aeruginosa-Stamm aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf eine LB-Agarplatte auf, indem Sie die Bakterien mit einer sterilen Inokulationsöse gleichmäßig auf der Platte verteilen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am Abend vor dem Screening impfen Sie eine einzelne Kolonie von P.aeruginosa von der Platte in 10 Milliliter LB-Medium in einem Reagenzglas an.

Inkubieren Sie die Vorkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min. Bereiten Sie am Tag des Screenings eine Unter-Kultur aus der über Nacht gezüchteten Vorkultur vor, indem Sie diese zuerst mit frischem LB-Medium auf einen OD600 von 1,0 verdünnen und anschließend weiter mit 5 % LB auf einen OD600 von 0,4 verdünnen. Geben Sie einen sterilen Magnetrührer in den Behälter und rühren Sie die Kultur 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit minimaler Geschwindigkeit auf einem Magnetrührer um.

Dadurch können sich die Bakterien an das Medium anpassen, bevor sie in 384-Well-Platten abgefüllt werden. Zum Herstellen der positiven Kontrolle 20 µL Tobramycin Sulfate zu 10 mL der vorbereiteten Subkultur geben und vorsichtig mischen. 40 µL der Kultur der positiven Kontrolle mittels Pipette in die Wells A23 bis P23 übertragen.

Zur Herstellung der Negativkontrolle 30 Mikroliter Dimethylsulfoxid zu 10 Millilitern der vorbereiteten Subkultur geben und vorsichtig mischen. 40 Mikroliter der Negativkontrollkultur in die Vertiefungen A24 bis P24 pipettieren. Für jede der mit kleinen Molekülen behandelten Platten je 40 Mikroliter der verdünnten Übernachtkulturen in die Vertiefungen A1 bis P22 impfieren.

Versiegeln Sie die Platten mit einem luftdurchlässigen Abdeckverschluss und inkubieren Sie sie sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung erwärmen Sie das Plattenlesegerät auf 37 Grad Celsius, um Kondensation zu vermeiden. Entfernen Sie den luftdurchlässigen Abdeckverschluss vorsichtig von der Platte, bevor Sie messen.

Danach die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Beruhigungszeit von 0,2 Sekunden messen. Vor der Fluoreszenzmessung eine automatische Verstärkungs- und Fokuseinstellung basierend auf der Negativkontrollvertiefung A24 durchführen und den Zielwert der Verstärkung auf 75 % festlegen. Fokuseinstellung und Kanal A auf der rechten Seite des Fensters auswählen. Die Fluoreszenz des GFP-Reporters bei einem Anregungsmaximum von 485 Nanometern und einem Emissionsmaximum von 520 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Beruhigungszeit von 0,2 Sekunden messen.

Sammeln Sie Daten von allen untersuchten Platten. Die Datenaufzeichnungen werden standardmäßig automatisch von der Steuersoftware des Plattenlesegeräts gespeichert. Um die Daten zu analysieren, rufen Sie die Messwerte auf, indem Sie im Steuerprogramm auf das Mars-Symbol klicken, um das statistische Analysemodul zu öffnen.

Rufen Sie die Daten durch Doppelklick auf die gewünschte Plattennummer ab, um die Daten für die Analyse zu erhalten. Bewerten Sie die Uniformität und Reproduzierbarkeit des Assays mithilfe einer robusten Z-Prime-Analyse. Anschließend berechnen Sie die prozentuale Hemmung des Wachstums und bewerten die prozentuale Hemmung des intrazellulären c-di-GMP-Spiegels, wie im Textprotokoll beschrieben.

Diese Abbildung zeigt repräsentative Rohdaten für OD 600 und GFP aus dem Hochdurchsatzscreen. Auf die Wells-Werte wurde eine Farbverlauf-Heatmap angewendet, bei der warme bis kalte Farben niedrige bis hohe Werte anzeigen. Die generierten Daten wurden auf prozentuale Hemmung analysiert und hier für beide Messgrößen, OD 600 und GFP, dargestellt.

Kleine Moleküle, die das Wachstum und den intrazellulären c-di-GMP-Spiegel möglicherweise hemmen, werden in der Regel grün dargestellt, während kleine Moleküle, die das Wachstum und den intrazellulären c-di-GMP-Spiegel möglicherweise fördern, in der Regel rot dargestellt werden. Streudiagramme werden verwendet, um die prozentuale Hemmung zu vergleichen, die von jedem getesteten kleinen Molekül erzielt wurde. Jedes kleine Molekül wird durch einen kleinen Punkt repräsentiert, und die Verteilung der prozentualen Hemmung für die Messungen bei OD 600 und GFP ist jeweils dargestellt.

Ein Plus-Minus-50%-Cutoff wird für die Identifizierung von Treffern ausgewählt. Mögliche Treffer sind rot hervorgehoben. Dosis-Wirkungs-Assays werden für jede interessante Verbindung durchgeführt.

Hier werden zwei identifizierte Verbindungen in einem Dosis-Wirkungs-Assay mit zehn Konzentrationsstufen getestet, wobei die höchste Konzentration zwei Millimolar beträgt und eine Verdünnungsreihe mit Verdünnungsfaktor zwei verwendet wird. Durch Anpassung einer vierparametrigen logistischen Funktion an die Daten ergaben sich halbmaximale Hemmkonzentrationswerte (IC50) für jede Verbindung von 158 Mikromolar und 193 Mikromolar. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um innerhalb von 48 Stunden mehr als 3.500 Verbindungen zu testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pseudomonas aeruginosa robust auf Verbindungen screenen kann, die in die zyklische-di-GMP-Signalübertragung eingreifen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Screening-Bedingungen über mehrere Tage hinweg vergleichbar bleiben. Nach einem Einzelpunkt-Screening kann eine Bestätigung der Hits durchgeführt werden, indem ein Dose-Response-Screening unter Verwendung desselben Protokolls durchgeführt wird.

Diese Technik eröffnet Forschern die Möglichkeit, potenzielle kleine Moleküle zu identifizieren, die die Biofilmbildung und Antibiotikaresistenz von Pseudomonas aeruginosa beeinflussen. Bedeutsamerweise kann diese Technik an jedes gewünschte Bakterium angepasst und modifiziert werden, um andere Einfluss- oder Wirkparameter zu untersuchen, beispielsweise die Auswirkung auf die bakterielle Vitalität. Abschließend sollte nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit Pseudomonas aeruginosa gefährlich sein kann.

Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.