Quantifizierung der bakteriellen Gewebebelastung in einem Mausmodell chronischer Darminfektion

Beginnen Sie mit einer eingeschläferten Maus, die mit einem antibiotikaresistenten Bakterienstamm infiziert ist und chronische Darminfektionen modelliert.

Legen Sie die Bauchhöhle frei, um Zugang zum Dekum und zur Milz zu bekommen.

Entnehmen Sie das Mürsen- und Milzgewebe, die intestinale und systemische Stellen der bakteriellen Besiedlung darstellen.

Jedes Gewebe wird in ein separates Rohr gelegt, das einen Puffer und eine Stahlperle enthält.

Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhren schnell bewegen, wodurch die Stahlperlen mit dem Gewebe kollidieren, es abbauen und Bakterien in die Suspension freisetzen.

Führen Sie serielle Verdünnungen der Homogenate im Puffer durch, um die bakterielle Konzentration zu reduzieren.

Plattenaliquoten aus jeder Verdünnung auf Nährstoffagar mit einem Antibiotikum ergänzt, um antibiotikaresistente Bakterien selektiv zu gewinnen.

Inkubieren Sie die Platten, damit lebensfähige Bakterien in Kolonien wachsen können.

Zählen Sie die Kolonien, um die Anzahl lebensfähiger Bakterien pro Gramm Gewebe zu schätzen, und vergleichen Sie die Bakterienbelastung im Äkum und in der Milz.

Zuerst setzen Sie 2 Milliliter-Safe-Lock-Mikroröhren mit rundem Boden aus, fügen Sie jedem Tuben 1 Milliliter steriles PBS und eine autoklavierte Edelstahlperle hinzu. Wiegen Sie die Eileiter vor der Gewebeentnahme vor.

Nach der Euthanation der Mäuse resezieren Sie deren Fähres- und Milzgewebe und achten Sie darauf, Gewebe einzelner Tiere in separate Röhren zu sammeln. Wiegen Sie jeden Schlauch, um das Gewebegewicht zu bestimmen.

Verwenden Sie eine Mischmühle, um das Gewebe 15 Minuten lang bei 30 Hertz zu homogenisieren. Anschließend werden 900 Mikroliter PBS in jeden Brunnen eines 96-Bohrlochs 2-Milliliter-Megablocks übertragen. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Gewebe in das erste Bohrloch und mischen Sie es gut.

Führen Sie serielle Verdünnungen durch, indem Sie 100 Mikroliter zu nachfolgenden Bohrungen hinzufügen, bis eine Verdünnung von 10 bis zum negativen Sechsten erreicht wird. Plattieren Sie 10 Mikroliter jeder Verdünnung in Dreifachen auf LB-Agar, das Streptomycin enthält. Dann zählen Sie die durchschnittlichen koloniebildenden Einheiten und bestimmen Sie die koloniebildenden Einheiten pro Gramm Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben.