In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität
25. März 2020
Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.
Unser Protokoll ermöglicht die Schaffung von Restriktionsenzymen mit veränderten, strengeren Sequenzspezifitäten durch In-vitro-Kompartimentisierung und eine einzigartige Selektionsstrategie in der gerichteten Evolution. Potenziell ist es ziemlich universell, da es auf jede Einschränkung Endonuklease anwendbar sein sollte und Auswahl kann auf jede strengere Version einer ursprünglichen Cognate-Sequenz gerichtet werden. Werden neu erstellte Varianten durch In-vitro-Transkription-Übersetzung ausgedrückt, eignet sich das Protokoll nicht nur zur Eingrenzung der Spezifität, sondern auch zur Änderung der Spezifität.
Um Standorte für die Subsättigungsmutagenese zu bestimmen, wählen Sie Mutagenese-Frequenzen entsprechend der hypothetischen Bedeutung der Standorte, wobei die Grenzen der Gesamtkomplexität der Bibliothek im Auge behalten werden. Um mit der Synthese zu beginnen, legen Sie Spalten, die mit neuem Harz verpackt wurden, in den Synthesizer ein. Synthetisieren Sie Oligonukleotide in allen Spalten bis zum Triplet, unmittelbar vor der zweiten Subsättigung mutagenese Stelle Zählen aus dem Drei-Prim-Ende.
Synthesize, so dass eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe am Ende. Die Schutzgruppe wird zu Beginn des nächsten Synthesezyklus entfernt. Öffnen Sie die Synthesesäulen und zentrieren Sie kurz in trockene 1,5-Milliliter-Rohre, um das Harz zu sammeln.
Ziehen Sie die CPG-Synthese-Unterstützung und mischen Sie durch Wirbel. Das gemischte CPG-Harz in neue Synthesesäulen umteilen. Vermeiden Sie die Einführung von Feuchtigkeit, da es den Gesamtertrag verringert.
Setzen Sie die Synthese fort, beginnend mit dem Subsättigungs-Mutagenese-Standort-Triplet. Weisen Sie randomisierten NNS-Triples oder Wildtyp-Triples entsprechend der gewünschten Mutagenesehäufigkeit Spalten zu. Wenn zusätzliche Subsättigungsstellen vorhanden sind, fahren Sie nur mit dem Triplet vor dem nächsten Subsättigungsmutagenese-Standort fort.
Wenn keine Subsättigungsstellen mehr nachgelagert vorhanden sind, schließen Sie die Synthese ab, sodass am Ende eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe übrig bleibt. Verwenden Sie breitbohrungspipettenspitzen, um ein Öltensidgemisch zu zuzubereiten, indem Sie 225 Mikroliter Span 80 und 25 Mikroliter Tween 80 bis fünf Milliliter Mineralöl in einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Inversion 15 Mal.
Die Mischung bei diesem Schritt sollte durchscheinend sein. Übertragen Sie für jede Bibliothek 950 Mikroliter des Öltensidgemisches in eine zwei Milliliter runde untere kryogene Durchstechflasche. Etikett mit einem Bibliotheksnamen und Übertragung auf Eis.
Legen Sie einen kleinen zylindrischen Rührstab in jede Durchstechflasche. Bereiten Sie ein In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktionsgemisch nach den Vorschlägen des Herstellers vor. Die Mischung mit Magnesiumchlorid auf eine Endkonzentration von 1,5 Millimolar ergänzen.
50 Mikroliter Aliquots des Reaktionsgemisches in 1,5 Milliliter-Röhren auf Eis geben. 1,7 Femtomolen der Bibliothek in das Reaktionsgemisch auf Eis geben. Bereiten Sie die Wasser-in-Öl-Emulsion nacheinander für jede Bibliothek vor, indem Sie zunächst einen kleinen Becher, der mit Eis gefüllt ist, auf einen magnetischen Rührer stellen, wobei die Rührgeschwindigkeit auf 1150 RPM eingestellt ist.
Dann eine kryogene Durchstechflasche mit 950 MikroliterÖltensidmischung und einem kleinen Rührstab in ein eiskaltes Becherglas am Magnetrührer geben. Überprüfen Sie, ob sich der Rührstab dreht. Fügen Sie fünf 10-Mikroliter-Aliquots der In-vitro-Bibliotheks-Transkriptions-Übersetzungsmischung über einen Zeitraum von zwei Minuten in 30 Sekunden hinzu und rühren Sie für eine weitere Minute weiter.
Die Durchstechflasche mit der Emulsion in einen Eisbehälter geben. An dieser Stelle sollte die Flüssigkeit undurchsichtig und nicht durchscheinend sein. Fahren Sie dann mit der nächsten Bibliothek fort.
Nachdem alle Bibliotheken verarbeitet sind, beginnen Sie die Inkubation aller Bibliotheken gemäß den Empfehlungen des Kitherstellers. Übertragen Sie die Fläschchen für weitere zwei Stunden auf die für die entwickelte Endonuklease optimale Temperatur, bevor Sie sie für mindestens 10 Minuten auf Eis legen. Übertragen Sie die Emulsionen aus den kryogenen Durchstechflaschen in 1,5 Milliliter-Röhren.
Fügen Sie einen Mikroliter von 5 Molaren EDTA. Und zentrifugieren Sie sie bei 13.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Sie nach dem Zentrieren die Wasser-Öl-Schnittstelle nicht klar sehen können, frieren Sie das Gemisch vor der Aspiration der oberen Ölphase ein.
Bewegen Sie die obere Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie. Führen Sie sofort die Extraktion durch, indem Sie 150 Mikroliter Phenolchloroform und 100 Mikroliter 10 Millimolar Tris-HCl in die wässrige Phase aufnehmen. Wirbel und führen Sie dann Phasentrennung über 30-Sekunden-Zentrifugation bei 13.000 mal g.
Sammeln Sie die obere wässrige Phase. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat, 2,5 bis fünf Mikrogramm Glykogen und 375 Mikroliter Ethanol hinzufügen. Nach der Inkubation der Proben bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde, Zentrifuge für 15 Minuten bei 13.000 mal g, vier Grad Celsius.
Den Überstand entsorgen und das Pellet kurz mit einem Milliliter kaltem 70%Ethanol waschen. Trocknen Sie das DNA-Glykogenpellet länger als fünf Minuten in einem Geschwindigkeitsvakuum oder Lufttrockner. Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter von 10 Millimolar Tris-HCl.
Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter Streptavidin magnetische Perlen, nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Eine Stunde bei Raumtemperatur mischen, vorzugsweise in einem Karussellmischer oder durch sanftes Wirbeln. Übertragen Sie die Rohre auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen zu trennen.
Dann sammeln Sie die in der DNA angereicherte Flüssigkeit ohne Biotin. Dieses Protokoll ist ein Werkzeug, um die Häufigkeit der gewünschten Varianten von technischen Restriktionsendonukleasen zu erhöhen, indem inaktive Enzyme und Endonukleasen mit unveränderter Wildtyp-Sequenzspezifität aufgebraucht werden. Erfolgreiches Screening kann bis zu 20% der vielversprechenden Varianten identifizieren.
Varianten werden als vielversprechende Varianten gekennzeichnet, wenn sie ein Spaltmuster erzeugen, das sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet. Varianten, die möglicherweise die Sequenzeinstellung geändert haben, werden ebenfalls beschriftet. Hier ist ein erfolgloses Screening mit der Mehrheit der Varianz inaktiv und eine Variante mit scheinbar unverändertem Spaltmuster zu sehen.
In diesem Fall werden die Bibliotheken höchstwahrscheinlich von inaktiven Varianten dominiert, die dem Streptavidin-Erfassungsschritt entgangen sind. Es ist wichtig, die ausgewählten und gegenausgewählten Sequenzen sorgfältig zu gestalten und die Bibliotheksvielfalt durch eine Mutagenese-Strategie zu begrenzen, die Substitutionen nur an wenigen ausgewählten Positionen erzeugt. Die besten ausgewählten Varianten sollten für die Bindungs- und Spaltungskinetik auf bevorzugten und nicht auf den Ergebnissen des ersten Screenings basierenden Sequenzen gründlich charakterisiert werden.
In unserem Testfall wurden Mutagenese-Sites nach einem Homologiemodell ausgewählt. Überraschenderweise zeigte eine Kristallstruktur später, dass einige veränderte Rückstände höchstwahrscheinlich nicht in direktem Kontakt mit der DNA stehen.
Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Entwicklung von Restriktionsendonucleasen mit veränderter Sequenzspezifität unter Verwendung von in vitro Kompartimentierung und gerichteter Evolution. Die Methode ist auf jedes Restriktionsenzym anwendbar und ermöglicht die Selektion von Varianten mit strengeren Spezifitäten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biotechnologie
- Molekulare Biologie
- Gentechnik
Hintergrund
- Restriktionsendonucleasen sind wesentliche Werkzeuge in der Molekularbiologie.
- Die Veränderung ihrer Spezifität kann ihren Nutzen in verschiedenen Anwendungen verbessern.
- In vitro Kompartimentierung ermöglicht eine effiziente Selektion von Enzymvarianten.
- Gerichtete Evolution ist eine leistungsstarke Methode zur Herstellung von Proteinen.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll zur Erstellung von Restriktionsenzymen mit neuen Sequenzspezifitäten zu entwickeln.
- Die Anwendbarkeit der Methode auf verschiedene Restriktionsendonucleasen zu demonstrieren.
- Einen detaillierten Leitfaden für Forscher bereitzustellen, die sich für Enzymengineering interessieren.
Verwendete Methoden
- In-vitro-Transkriptions-Translations-Reaktionen.
- Kompartimentierung von Reaktionen zur Isolierung von Varianten.
- Subsatutationsmutagenese zur Einführung von Variabilität.
- Selektion vielversprechender Varianten basierend auf Spaltungsmustern.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Varianten mit veränderter Sequenzspezifität.
- Bis zu 20% der gescreenten Varianten zeigten vielversprechende Spaltungsmuster.
- Die Wirksamkeit der Selektionsstrategie wurde demonstriert.
- Herausforderungen beim Screening inaktiver Varianten wurden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug für die Herstellung von Restriktionsendonucleasen.
- Es kann für verschiedene Enzyme und Spezifitätsanforderungen angepasst werden.
- Zukünftige Anwendungen könnten molekularbiologische Techniken verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Engineering restriction endonucleases with more stringent specificity addresses a key bottleneck in molecular biology tool development, enabling precise DNA manipulation for therapeutic and diagnostic applications. This protocol enhances predictive confidence in enzyme variant selection by linking genotype to phenotype in a cell-free system, reducing false positives from inactive or wild-type enzymes. The approach supports early-stage target validation and assay development by generating characterized nucleases with defined cleavage profiles, facilitating downstream screening and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA-binding residues and functional validation of nuclease specificity through direct phenotype-genotype coupling.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating variants that cleave only desired sequences, supporting hypothesis-driven target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces enzyme variants with altered cleavage patterns suitable for developing quantitative nucleic acid detection assays.
- Operational Value: Emulsion-based compartmentalization ensures single-enzyme-per-droplet conditions, improving assay reproducibility and reducing false-positive rates.
- Strategic Value: Enables iterative selection cycles to enrich for functional variants, increasing hit rates in protein engineering campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generated variants can be overexpressed in bacterial cells with cognate methyltransferases, allowing characterization on methylated substrates relevant to epigenetic applications.
- Operational Value: The selection strategy depletes inactive enzymes and wild-type variants, increasing the frequency of promising candidates for further development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting lead identification through iterative variant enrichment and functional screening prior to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of DNA-binding determinants by enabling site-specific mutagenesis and activity-based selection.
- Screening: Generates quantitative cleavage readouts via biotin pulldown and PCR amplification, allowing discrimination between desired and undesired activities.
- Analytics: Enables measurement of variant enrichment through DNA recovery in supernatant after selection, informing hit progression decisions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by producing nucleases that can be expressed and tested in cellular contexts with cognate modification systems.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable to any restriction endonuclease, supporting platform-wide application across multiple target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct linkage of enzyme variant to cleavage specificity.
- Operational Value: Standardization via in vitro compartmentalization reduces well-to-well variability and increases reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by enriching for functional variants early, reducing investment in false leads.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of variants based on cleavage pattern distinct from wild-type, improving success rates in enzyme engineering campaigns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, in vitro transcription-translation, and emulsion handling.
- Dependent on access to microfluidic or manual emulsion generation equipment and magnetic separation tools.
- Necessitates standardization of oil-surfactant mixtures and incubation conditions across libraries.
- Adaptation to different restriction enzymes requires redesign of selection cassettes flanking desired and undesired sites.
- Library diversity must be limited to positions predicted to affect DNA binding to maintain screening efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Split-and-Mix Synthesis of Mutagenic Primers
2:34
Performing Compartmentalized In Vitro Transcription-translation Reaction
5:07
Continued Processing of Libraries and Selection
7:20
Results: Examples of Screening of NlaIV Variants for Sequence Specificity Alteration
8:16
Conclusion
