In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Unser Protokoll ermöglicht die Schaffung von Restriktionsenzymen mit veränderten, strengeren Sequenzspezifitäten durch In-vitro-Kompartimentisierung und eine einzigartige Selektionsstrategie in der gerichteten Evolution. Potenziell ist es ziemlich universell, da es auf jede Einschränkung Endonuklease anwendbar sein sollte und Auswahl kann auf jede strengere Version einer ursprünglichen Cognate-Sequenz gerichtet werden. Werden neu erstellte Varianten durch In-vitro-Transkription-Übersetzung ausgedrückt, eignet sich das Protokoll nicht nur zur Eingrenzung der Spezifität, sondern auch zur Änderung der Spezifität.

Um Standorte für die Subsättigungsmutagenese zu bestimmen, wählen Sie Mutagenese-Frequenzen entsprechend der hypothetischen Bedeutung der Standorte, wobei die Grenzen der Gesamtkomplexität der Bibliothek im Auge behalten werden. Um mit der Synthese zu beginnen, legen Sie Spalten, die mit neuem Harz verpackt wurden, in den Synthesizer ein. Synthetisieren Sie Oligonukleotide in allen Spalten bis zum Triplet, unmittelbar vor der zweiten Subsättigung mutagenese Stelle Zählen aus dem Drei-Prim-Ende.

Synthesize, so dass eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe am Ende. Die Schutzgruppe wird zu Beginn des nächsten Synthesezyklus entfernt. Öffnen Sie die Synthesesäulen und zentrieren Sie kurz in trockene 1,5-Milliliter-Rohre, um das Harz zu sammeln.

Ziehen Sie die CPG-Synthese-Unterstützung und mischen Sie durch Wirbel. Das gemischte CPG-Harz in neue Synthesesäulen umteilen. Vermeiden Sie die Einführung von Feuchtigkeit, da es den Gesamtertrag verringert.

Setzen Sie die Synthese fort, beginnend mit dem Subsättigungs-Mutagenese-Standort-Triplet. Weisen Sie randomisierten NNS-Triples oder Wildtyp-Triples entsprechend der gewünschten Mutagenesehäufigkeit Spalten zu. Wenn zusätzliche Subsättigungsstellen vorhanden sind, fahren Sie nur mit dem Triplet vor dem nächsten Subsättigungsmutagenese-Standort fort.

Wenn keine Subsättigungsstellen mehr nachgelagert vorhanden sind, schließen Sie die Synthese ab, sodass am Ende eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe übrig bleibt. Verwenden Sie breitbohrungspipettenspitzen, um ein Öltensidgemisch zu zuzubereiten, indem Sie 225 Mikroliter Span 80 und 25 Mikroliter Tween 80 bis fünf Milliliter Mineralöl in einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Inversion 15 Mal.

Die Mischung bei diesem Schritt sollte durchscheinend sein. Übertragen Sie für jede Bibliothek 950 Mikroliter des Öltensidgemisches in eine zwei Milliliter runde untere kryogene Durchstechflasche. Etikett mit einem Bibliotheksnamen und Übertragung auf Eis.

Legen Sie einen kleinen zylindrischen Rührstab in jede Durchstechflasche. Bereiten Sie ein In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktionsgemisch nach den Vorschlägen des Herstellers vor. Die Mischung mit Magnesiumchlorid auf eine Endkonzentration von 1,5 Millimolar ergänzen.

50 Mikroliter Aliquots des Reaktionsgemisches in 1,5 Milliliter-Röhren auf Eis geben. 1,7 Femtomolen der Bibliothek in das Reaktionsgemisch auf Eis geben. Bereiten Sie die Wasser-in-Öl-Emulsion nacheinander für jede Bibliothek vor, indem Sie zunächst einen kleinen Becher, der mit Eis gefüllt ist, auf einen magnetischen Rührer stellen, wobei die Rührgeschwindigkeit auf 1150 RPM eingestellt ist.

Dann eine kryogene Durchstechflasche mit 950 MikroliterÖltensidmischung und einem kleinen Rührstab in ein eiskaltes Becherglas am Magnetrührer geben. Überprüfen Sie, ob sich der Rührstab dreht. Fügen Sie fünf 10-Mikroliter-Aliquots der In-vitro-Bibliotheks-Transkriptions-Übersetzungsmischung über einen Zeitraum von zwei Minuten in 30 Sekunden hinzu und rühren Sie für eine weitere Minute weiter.

Die Durchstechflasche mit der Emulsion in einen Eisbehälter geben. An dieser Stelle sollte die Flüssigkeit undurchsichtig und nicht durchscheinend sein. Fahren Sie dann mit der nächsten Bibliothek fort.

Nachdem alle Bibliotheken verarbeitet sind, beginnen Sie die Inkubation aller Bibliotheken gemäß den Empfehlungen des Kitherstellers. Übertragen Sie die Fläschchen für weitere zwei Stunden auf die für die entwickelte Endonuklease optimale Temperatur, bevor Sie sie für mindestens 10 Minuten auf Eis legen. Übertragen Sie die Emulsionen aus den kryogenen Durchstechflaschen in 1,5 Milliliter-Röhren.

Fügen Sie einen Mikroliter von 5 Molaren EDTA. Und zentrifugieren Sie sie bei 13.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Sie nach dem Zentrieren die Wasser-Öl-Schnittstelle nicht klar sehen können, frieren Sie das Gemisch vor der Aspiration der oberen Ölphase ein.

Bewegen Sie die obere Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie. Führen Sie sofort die Extraktion durch, indem Sie 150 Mikroliter Phenolchloroform und 100 Mikroliter 10 Millimolar Tris-HCl in die wässrige Phase aufnehmen. Wirbel und führen Sie dann Phasentrennung über 30-Sekunden-Zentrifugation bei 13.000 mal g.

Sammeln Sie die obere wässrige Phase. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat, 2,5 bis fünf Mikrogramm Glykogen und 375 Mikroliter Ethanol hinzufügen. Nach der Inkubation der Proben bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde, Zentrifuge für 15 Minuten bei 13.000 mal g, vier Grad Celsius.

Den Überstand entsorgen und das Pellet kurz mit einem Milliliter kaltem 70%Ethanol waschen. Trocknen Sie das DNA-Glykogenpellet länger als fünf Minuten in einem Geschwindigkeitsvakuum oder Lufttrockner. Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter von 10 Millimolar Tris-HCl.

Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter Streptavidin magnetische Perlen, nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Eine Stunde bei Raumtemperatur mischen, vorzugsweise in einem Karussellmischer oder durch sanftes Wirbeln. Übertragen Sie die Rohre auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen zu trennen.

Dann sammeln Sie die in der DNA angereicherte Flüssigkeit ohne Biotin. Dieses Protokoll ist ein Werkzeug, um die Häufigkeit der gewünschten Varianten von technischen Restriktionsendonukleasen zu erhöhen, indem inaktive Enzyme und Endonukleasen mit unveränderter Wildtyp-Sequenzspezifität aufgebraucht werden. Erfolgreiches Screening kann bis zu 20% der vielversprechenden Varianten identifizieren.

Varianten werden als vielversprechende Varianten gekennzeichnet, wenn sie ein Spaltmuster erzeugen, das sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet. Varianten, die möglicherweise die Sequenzeinstellung geändert haben, werden ebenfalls beschriftet. Hier ist ein erfolgloses Screening mit der Mehrheit der Varianz inaktiv und eine Variante mit scheinbar unverändertem Spaltmuster zu sehen.

In diesem Fall werden die Bibliotheken höchstwahrscheinlich von inaktiven Varianten dominiert, die dem Streptavidin-Erfassungsschritt entgangen sind. Es ist wichtig, die ausgewählten und gegenausgewählten Sequenzen sorgfältig zu gestalten und die Bibliotheksvielfalt durch eine Mutagenese-Strategie zu begrenzen, die Substitutionen nur an wenigen ausgewählten Positionen erzeugt. Die besten ausgewählten Varianten sollten für die Bindungs- und Spaltungskinetik auf bevorzugten und nicht auf den Ergebnissen des ersten Screenings basierenden Sequenzen gründlich charakterisiert werden.

In unserem Testfall wurden Mutagenese-Sites nach einem Homologiemodell ausgewählt. Überraschenderweise zeigte eine Kristallstruktur später, dass einige veränderte Rückstände höchstwahrscheinlich nicht in direktem Kontakt mit der DNA stehen.