Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die funktionelle Bewertung umfassender Sättigungsmutagenese-Bibliotheken von Proteinen an einem einzigen Ort unter Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biochemie und molekulare Evolution zu beantworten. Zum Beispiel, was sind die biochemischen, strukturellen und evolutionären Einschränkungen für Proteine?

Und wie können wir Proteine mit neuartigen Funktionen entwickeln? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Reihe nützlicher Sequenzierungs-Reads in einer Studie zur Sättigungsmutagenese des gesamten Proteins maximiert, indem sie den Aufbau und die Sequenzierung von Bibliotheken multiplexiert. Nachdem Sie eine Platte PCR Master Mix gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter von den 96-Well-Platten, die die zuvor verdünnten Primer für die Sinnesmutagenese enthalten, in die verwandten Vertiefungen in den PCR-Platten.

Verwenden Sie eine Plattendichtung, um jede PCR-Platte abzudecken, und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 200 g. Übertragen Sie dann die PCR-Platten in einen Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus. Nach Durchführung einer zusätzlichen PCR und Verdünnung der Reaktionen von eins auf 100 wird ein Mikroliter aus den gemischten und verdünnten mutagenen PCR-Produkten der ersten Runde in die entsprechenden Vertiefungen der neuen PCR-Platten mit Master Mix überführt.

Verwenden Sie ein Plattensiegel, um jede PCR-Platte abzudecken. Die Platten werden zwei Minuten lang bei ca. 200 g zentrifugiert. Übertragen Sie dann die Platten in den Thermocycler und führen Sie das gleiche Programm aus, das weiter oben im Video aufgeführt ist.

Nach Überprüfung der PCR-Produktgrößen und Messung der Konzentrationen gemäß dem Textprotokoll mischen Sie 100 Nanogramm jedes PCR-Produkts der NNS-Unterbibliothek in fünf NNS-Unterbibliotheksgruppen. Nach dem Ausführen von PCR-Reaktionen in der Unterbibliothek und dem Verdauen von Klonierungsvektoren in den PCR-Reaktionen gemäß dem Textprotokoll richten Sie Ligationsreaktionen gemäß diesen Richtlinien für jede verdaute NNS-Subbibliotheksgruppe mit ihrem verwandten verdauten Restriktionsvektor ein. Dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Sobald die elektrokompetenten E.coli-Zellen aufgetaut sind, fügen Sie jeder gereinigten Ligationsreaktion zehn Mikroliter Zellen hinzu und geben Sie sie in eine Elektroprorationsküvette. Elektroprolieren Sie die Zellen bei 1,8 Kilovolt, fügen Sie dann einen Milliliter SOB-Medium hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Suspendieren Sie dann 10 Mikroliter jeder Erholungskultur in 990 Mikrolitern LB. Und verteilen Sie 100 Mikroliter auf LB-Schneckenplatten mit 12 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin.

Für jede Wiedergewinnungskultur ist ein 250-Milliliter-Kulturkolben mit 50 Millilitern LB und 50 Mikrolitern Tet-Stock herzustellen. Der verbleibende etwa ein Milliliter der Rückgewinnungskultur wird in einen Kolben überführt. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 200 U/min über Nacht.

Nachdem Sie die Anzahl der erfolgreichen Transformanten auf den Platten gezählt und die Plasma-DNA aus den Übernachtkulturen isoliert haben, mischen Sie 100 Nanogramm jedes Plasmids zusammen. Nachdem Sie die DNA-Bibliothek gemäß dem Textprotokoll transformiert haben, verdünnen Sie die Bibliothekskultur über Nacht auf einen OD-600-Wert von 0,1. Und geben Sie einen Milliliter in einen Kolben.

Inkubieren Sie die Vorauswahlkultur bei 37 Grad Celsius und 200 U/min. Überwachen Sie das Wachstum regelmäßig, indem Sie den OD-600 messen, bis er 0,1 beträgt. 100 Milliliter der Vorauswahlkultur werden in zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt und sechs Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Entfernen Sie den größten Teil des Überstands und kombinieren Sie die Pellets in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie dann nach Wiederholung der Zentrifugation den gesamten Überstand. Zu den beiden anderen Kolben wird Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 12 Mikrogramm pro Milliliter gegeben.

Und ein Volumen der Vorauswahlkultur, so dass der endgültige OD-600 0,001 beträgt. In einen Kolben wird ein Milliliter Ampicillin mit 50 Milligramm pro Milliliter in einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter gegeben. Das ist die Auswahlkultur.

Während Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius bei 200 U/min inkubieren, überwachen Sie das Wachstum der Kultur, die kein Ampicillin enthält, bis sie einen OD-600 von 0,1 erreicht. Messen Sie auch den OD-600 der Selektionskultur. Nachdem Sie den OD-600 der Selektionskultur in 0,1 dividiert und mit 100 multipliziert haben, übertragen Sie dieses Volumen in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sechs Minuten lang bei 4.000 g und vier Grad Celsius.

Nachdem Sie den größten Teil des Überstands entfernt haben, mischen Sie die Pellets in einem einzigen Röhrchen, bevor Sie sie erneut drehen und den gesamten Überstand entfernen. Um eine Hochdurchsatz-Sequenzierung durchzuführen, bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor und geben Sie 23 Mikroliter in 10 PCR-Röhrchen. Geben Sie einen Mikroliter 0,5 Nanogramm pro Mikroliter gereinigter Plasmid-DNA aus der Vorauswahlkultur in die Röhrchen eins bis fünf.

Und von der Selektionskultur bis zu den Röhren sechs bis 10. Mischen Sie 50 Mikroliter 50 mikromolare vorwärtsorthogonale Primer, OP1F bis OP5F, mit den entsprechenden umgekehrten orthogonalen Primern, OP1R bis OP5R. Übertragen Sie in der gleichen Reihenfolge einen Mikroliter in die PCR-Röhrchen eins bis fünf und sechs bis 10.

Übertragen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus. Verdünnen Sie dann die PCR-Reaktionen um das 100-fache, indem Sie einen Mikroliter aus jedem Röhrchen auf 99 Mikroliter Wasser umfüllen. Gut mischen, dann 99 Mikroliter aus den Röhrchen pipettieren und verwerfen.

Mischen Sie 50 Mikroliter der vorderen und jeweils hinteren Zündhütchen. Übertragen Sie dann einen Mikroliter in die PCR-Röhrchen eins bis fünf und sechs bis 10. Nachdem Sie einen PCR-Mastermix vorbereitet haben, geben Sie 23 Mikroliter in jedes PCR-Röhrchen und führen Sie das folgende Programm durch.

Um die abschließenden PCRs zum Hinzufügen von Indexierungssequenzen durchzuführen, fügen Sie nach 100-facher Verdünnung der PCR-Reaktionen wie zuvor und unter Beibehaltung eines Mikroliters 23 Mikroliter des PCR-Mastermixes hinzu. Für Röhrchen mit Template, die aus den NNS-Subbibliotheksgruppen eins bis fünf stammen, fügen Sie 0,5 Mikroliter der Forward-Primer 501F bzw. 505F hinzu. Bei Röhrchen mit Template, die aus der Vorselektion und den Selektionskulturen resultieren, fügen Sie 0,5 Mikroliter Reverse Primer 701R und 702R hinzu.

Führen Sie das gleiche PCR-Programm wie gerade angegeben aus. Nachdem Sie die Konzentrationen jeder Reaktion gemäß dem Textprotokoll gemessen haben, mischen Sie 100 Nanogramm jedes PCR-Produkts in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen. Nach Zugabe von 6X Gel-Ladefarbstoff laden Sie die gesamte, kombinierte PCR-Probe auf ein zweiprozentiges Agarosegel.

Und lassen Sie das Gel 50 Minuten lang bei 100 Volt laufen. Visualisieren Sie mit einem langwelligen UV-Strahler die Scheibe mit dem PCR-Produkt von ca. 360 Basenpaaren und schneiden Sie sie dann heraus. Reinigen, sequenzieren und analysieren Sie die Probe gemäß dem Textprotokoll.

Die Plasmidkarte für die fünf modifizierten pBR322-Plasmide, die orthogonale Priming-Stellen enthalten, ist hier dargestellt. Die Prüfung der Spezifität der orthogonalen Primer mittels PCR zeigte, dass das richtige PCR-Produkt erst erhalten wurde, wenn das passende Plasmid in die Reaktion einbezogen wurde. Und ohne sie wurde kein Produkt irgendeiner Größe erhalten.

Nach der Verarbeitung eines Experiments wurden 6,2 mal 10 bis zum sechsten Reads aus der Vorselektionsbedingung und 6,3 mal 10 bis zum sechsten Reads aus der Ampicillinbedingung erhalten. Die Zählungen für jede Aminosäuremutation aus der Vorauswahlbedingung zeigen eine logarithmisch-normale Verteilung an. Diese Abbildung zeigt den relativen Fitnesseffekt (FIA) für jede Mutation an jeder Position von TEM-one.

Und seine Verteilung ist hier zu sehen. Bei einer Selektion von 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin haben die meisten Mutationen einen neutralen oder nahezu neutralen Fitnesseffekt. Entsprechend den weißen Pixeln hier, und der großen Spitze hier.

Ein kleiner Teil der Mutationen bei dieser Antibiotikakonzentration hat erhebliche Auswirkungen auf die Fitness. Erwartungsgemäß gehören dazu auch Mutationen innerhalb der hochkonservierten Reste des aktiven Zentrums. Im Gegensatz dazu erscheinen nur wenige Pixel so deutlich rot.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche durchgeführt werden. Wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird und alle Reagenzien verfügbar sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, während der Klonierung organisiert zu bleiben, um die mutagenen PCR-Produkte in die richtigen Gruppen zu kombinieren und in die richtigen Vektoren zu klonen.

Und bei der Vorbereitung der Sequenzierung die richtigen Primer zu verwenden. Ausgehend von diesem Verfahren könnten die Hauptschritte des Protokolls modifiziert werden, um Mutationskombinationen, verschiedene Selektionsumgebungen und andere Proteinsysteme zu untersuchen, um zusätzliche Fragen zur genetischen und umweltbedingten Kontextabhängigkeit von Mutationen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Arbeit haben, die erforderlich ist, um eine Bibliothek für die Sättigungsmutagenese des gesamten Proteins zu erstellen und die funktionellen Auswirkungen jeder Mutation gleichzeitig mit Hilfe der Hochdurchsatzsequenzierung zu bewerten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid und ultraviolettem Licht gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel und UV-Schutz immer getroffen werden sollten, wenn Sie Teile dieses Protokolls durchführen.