Name: Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Bewertung von Protein-Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Methode maximiert Sequenzierungslesevorgänge durch Multiplexing und liefert wertvolle Einblicke in biochemische und evolutionäre Proteinbeschränkungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.R. dankt der Unterstützung durch die National Institutes of Health (RO1EY018720-05), die Robert A. Welch Foundation (I-1366) und das Green Center for Systems Biology.

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu haben

Hier ist ein Protokoll zum Durchführen der funktionellen Bewertung des gesamten protein Sättigungsmutagenese Bibliotheken beschriebenen Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie. Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens ist die Verwendung von orthogonalen Primern während des Klonens. Kurz gesagt, wird jede Aminosäureposition durch mutagene PCR randomisiert, und zusammen in Gruppen von Positionen, deren kombinierte Sequenzlänge von Hochdurchsatz-Sequenzierung untergebracht ist gemischt. Diese Gruppen kloniert in Plasmid-Vektore...

Mutagenese wurde lange im Labor verwendet worden, um die Eigenschaften von biologischen Systemen und ihre Entwicklung zu studieren, und mutierte Proteine ​​oder Organismen mit verbesserten oder neuen Funktionen zu erzeugen. Während die ersten Ansätze auf Methoden verlassen , die in Organismen zufällige Mutationen erzeugen, Forscher das Aufkommen der rekombinanten DNA - Technologie ermöglicht die Einführung wählen Änderungen an DNA in einer ortsspezifisch, dh., Ortsgerichtete Mutagenese 1,2. Mit den derzeitigen Techniken, typischerweise unter Verwendung von mutagenen Oligonukleotide in einer Polymerase - Kettenreaktion (PCR) ist es relativ leicht zu erzeugen und zu bewerten , eine kleine Anzahl von Mutationen (z. B. Punktmutationen) in einem gegebenen Gen 3,4. Es ist viel schwieriger, aber wenn das Ziel Ansätze, zum Beispiel die Erstellung und Bewertung aller möglichen Single-Site (oder höherer Ordnung) Mutationen. Während ein Großteil wurde von frühen Studien gelernt Versuch, eine große Zahl von m zu beurteilenutations in Genen, die verwendeten Techniken waren oft mühsam, zum Beispiel die Bewertung der einzelnen Mutation erfordern eine unabhängige Verwendung von Nonsense - Suppressor - Stämmen 5-7, oder sie wurden in ihrer quantitativen Fähigkeit aufgrund der geringen Sequenzierungstiefe von Sanger - Sequenzierung 8 begrenzt. Die Techniken , die in diesen Studien verwendet wurden weitgehend durch Verfahren ersetzt worden 9-12 High-Throughput - Sequenzierung Technologie. Diese konzeptionell einfache Ansätze zur Folge Erstellen einer Bibliothek , die eine große Anzahl von Mutationen umfasst, Unterwerfen der Bibliothek an einen Bildschirm oder eine Auswahl für die Funktion und dann tief Sequenzierung (dh. In der Größenordnung von&gt; 10 6 Sequenzierung liest) die Bibliothek erhalten vor und nach der Auswahl. Auf diese Weise können die phänotypische oder Eignung Wirkungen einer großen Anzahl von Mutationen, wie die Änderung in Bevölkerungsfrequenz jedes mutanten dargestellt, bewertet werden, um gleichzeitig und quantitativ. Wir führten zuvor eine einfa(. dh Ganz Protein Sättigungsmutagenese - Bibliotheken) le Ansatz für Bibliotheken aller möglichen einzelnen Aminosäure - Mutationen in Proteinen Beurteilung für Gene mit einer Länge länger als die Sequenzierung lesen Länge 11,13: Zuerst wird jede Position Aminosäure randomisierten durch ortsgerichtete mutagene PCR. Während dieses Prozesses wird das Gen in Gruppen aufgeteilt, bestehend aus zusammenhängenden Positionen mit einer Gesamtlänge von der Sequenzierungs Plattform untergebracht sind. Die mutagene PCR-Produkte für jede Gruppe werden dann kombiniert, und jede Gruppe unabhängig voneinander zur Auswahl und Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Durch die Aufrechterhaltung hat eine Entsprechung zwischen der Position von Mutationen in der Sequenz und die Sequenzierung Leselänge dieser Ansatz den Vorteil der Maximierung Sequenzierungstiefe: während man einfach könnte sequenzieren solche Bibliotheken in kurzen Fenstern ohne Aufteilung in Gruppen (beispielsweise durch eine Standard - Schrotflinte. Sequenzierung Ansatz), die meisten liest wäre erhaltenen Wildtyp und damit die majority von Sequenzierungsdurchsatz verschwendet (beispielsweise für ein ganzes Protein Sättigungsmutagenese Bibliothek eines Proteins 500 Aminosäure in 100 Aminosäure sequenziert (300 bp) Fenster, bei mindestens 80% der liest , wird die Wildtyp - Sequenz ist). Hier wird ein Protokoll vorgestellt , das Hochdurchsatz - Sequenzierung für die funktionelle Beurteilung des gesamten Protein - Sättigungsmutagenese - Bibliotheken verwendet, die obige Ansatz (skizziert in Abbildung 1). Wichtig ist, stellen wir die Verwendung von orthogonalen Primern in der Bibliothek Klonierungsverfahren jede Sequenzgruppe zu Barcode, der sie in einer Bibliothek gemultiplext werden können, gleichzeitig Screening oder Selektion unterzogen und dann für tiefe Sequenzierung demultiplexiert. Da die Sequenzgruppen nicht unabhängig Selektion unterzogen werden, verringert sich die Arbeitsbelastung und stellt sicher, dass jede Mutation, das gleiche Niveau der Auswahl erfährt. TEM-1-β-Lactamase, ein Enzym, das auf hohem Niveau Resistenz verleihtβ-Lactam - Antibiotika (z. B. Ampicillin) in Bakterien wird als Modellsystem 14-16 verwendet. Ein Protokoll wird für die Beurteilung der Gesamtprotein Sättigungsmutagenese Bibliothek von TEM-1 in E. beschrieben coli unter Selektion bei einer ungefähren Serumspiegel für eine klinische Dosis von Ampicillin (50 ug / ml) 17,18.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Petriplatten</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td> http://www.mathworks.com/products/matlab/ Oligonukleotid-Primer Integrierte <td>DNA-Technologien</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>25-nmol-Skala, Standard-Entsalzung</td></tr><tr><td>pBR322_AvrII</td><td>auf Anfrage</td><td></td> erhältlich <td>pBR322-Plasmid, modifiziert, um eine AvrII-Restriktionsstelle stromabwärts des TEM-1-Gens zu enthalten</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash; pBR322_OP5</td><td>auf Anfrage</td><td></td><td>erhältlich, fünf modifizierte pBR322-Plasmide, die jeweils ein Paar orthogonale Priming-Stellen enthalten</td></tr>, <tr><td>Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>, enthält 5x PCR-Puffer und PCR-Additiv (GC-Enhancer)</td></tr><tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipetten (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-Platte, 96-Well-Fisher</td><td>Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Plattendichtung</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well-Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x Gelladefarbstoff</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>UV-Transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>EB-Puffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Assay-Platten mit schwarzer Wand, klarer Boden</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda-Phagen-DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen dsDNA-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>dsDNA-Quantifizierungsreagenz, verwendet im Protokollschritt 2.2.4</td></tr><tr><td>Victor 3 V Mikroplatten-Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Langwelliger UV-Strahler</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Gel-DNA-Extraktionspuffer</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 elektrokompetent E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>konische Gefäße 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Aufreinigungskit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-PCR-Streifenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA Quantifizierungsreagenz</td></tr><tr><td>Qubit Analyseröhrchen</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2 (500 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop-Sequenzierer</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternativ könnte man auf der Illumina HiSeq-Plattform</td></tr><tr><td>FLASh-Software</td> der <td>John Hopkins University sequenzieren - Open-Source-http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td><td></td> <td>Software zum Zusammenführen von Paired-End-Reads aus Next-Generation-Sequencing-Daten</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTATGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACATAGAGGCA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

ein protokoll für functional assessment of whole-protein sättigungsmutagenese-bibliotheken mit hilfe von high-throughput sequencing

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Ortsgerichtete Mutagenese wird seit langem als Methode zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Evolution von Proteinen verwendet. Jüngste Fortschritte in der massiv-parallelen Sequenzierungstechnologie haben die Möglichkeit eröffnet, die funktionellen oder Fitnesseffekte einer großen Anzahl von Mutationen gleichzeitig zu bewerten. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur experimentellen Bestimmung der Auswirkungen aller möglichen Einzelaminosäuremutationen in einem Protein von Interesse unter Verwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie vor, am Beispiel des 263-Aminosäure-Antibiotikaresistenzenzyms TEM-1 β-Lactamase. Bei diesem Ansatz wird eine Gesamtprotein-Sättigungsmutagenese-Bibliothek durch ortsgerichtete mutagene PCR konstruiert, wobei jede Position einzeln auf alle möglichen Aminosäuren randomisiert wird. Die Bibliothek wird dann in Bakterien umgewandelt und auf ihre Fähigkeit hin ausgewählt, Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika zu verleihen. Der Fitnesseffekt jeder Mutation wird dann durch Tiefensequenzierung der Bibliothek vor und nach der Selektion bestimmt. Wichtig ist, dass dieses Protokoll Verfahren einführt, die die Lesetiefe der Sequenzierung maximieren und die gleichzeitige Selektion der gesamten Mutationsbibliothek ermöglichen, indem benachbarte Positionen in Längengruppen gemischt werden, die durch die Leselänge der Hochdurchsatzsequenzierung untergebracht sind, und orthogonale Primer verwendet werden, um jede Gruppe zu codieren. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls werden durch die Bewertung der Fitnesseffekte aller einzelnen Aminosäuremutationen in TEM-1 bei einer klinisch relevanten Dosierung von Ampicillin erzielt. Die Methode sollte leicht auf andere Proteine erweiterbar sein, für die ein Hochdurchsatz-Selektionsassay vorhanden ist.

Die Plasmid - Karte für die fünf modifizierten pBR322 Plasmiden , die orthogonal Primingstellen (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) ist in 2A gezeigt. Um zu testen, ob die orthogonal Primer sind spezifisch, PCRs wurden durchgeführt, um jedes Paar von orthogonalen Primer einzeln, zusammen mit allen fünf pBR322_OP1-5 Plasmiden oder mit allen Plasmiden minus dem Plasmid, das das orthogonale Primerpaars entspricht. Die richtige Produkt wurde nur erhalten , wenn die passenden Plasmid e...

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die funktionelle Bewertung umfassender Sättigungsmutagenese-Bibliotheken von Proteinen an einem einzigen Ort unter Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biochemie und molekulare Evolution zu beantworten. Zum Beispiel, was sind die biochemischen, strukturellen und evolutionären Einschränkungen für Proteine?Und wie können wir Proteine mit neuartigen Funktionen entwickeln? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Reihe nützlicher Sequenzierungs-Reads in einer Studie zur Sättigungsmutagenese des gesamten Proteins maximiert, indem sie den Aufbau und die Sequenzierung von Bibliotheken multiplexiert. Nachdem Sie eine Platte PCR Master Mix gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter von den 96-Well-Platten, die die zuvor verdünnten Primer für die Sinnesmutagenese enthalten, in die verwandten Vertiefungen in den PCR-Platten.Verwenden Sie eine Plattendichtung, um jede PCR-Platte abzudecken, und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 200 g. Übertragen Sie dann die PCR-Platten in einen Ther

a-protocol-for-functional-assessment-whole-protein-saturation

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Hefeproteinopathie-Modelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Toxizität und Aggregation von Proteinen zu bewerten, die an Krankheiten beteiligt sind. In dieser Arbeit stellen wir Methoden zum Screening von Hsp104-Variantenbibliotheken auf Toxizitätssuppressoren vor. Dieses Protokoll könnte so angepasst werden, dass jede Proteinbibliothek auf Toxizitätssuppressoren von Proteinen untersucht wird, die in Hefe toxisch sind.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Konstruktion und zum Screening von Mutantenbibliotheken für gerichtete Evolutionskampagnen in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Erfahren Sie die funktionelle Bewertung von Protein-Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Methode maximiert Sequenzierungslesevorgänge durch Multiplexing und liefert wertvolle Einblicke in biochemische und evolutionäre Proteinbeschränkungen.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing (Video) | JoVE Journal

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Weitere Videos entdecken