Entwicklung Methode Regie in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie Mutantenbibliotheken in Saccharomyces Cerevisiae für gerichtete Evolutionsexperimente konstruiert und gescreent werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Laborerstellung zu beantworten, die für fokussierte gerichtete Evolutionsexperimente verwendet werden, wie z. B. die Zuweisung von überlappenden Bereichen für die Assemblierung und Klonierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit und Robustheit, da in nur einem Transformationsschritt Ebenen mit guter Qualität zugewiesen werden können.

Dieses Protokoll zur Erstellung und zum Screening von Mutantenbibliotheken wird für eine pilzliche Arylalkoholoxidase (AAO) demonstriert. Die Regionen für die fokussierte gerichtete Evolution werden zunächst mit Hilfe von Rechenalgorithmen ausgewählt, die auf den verfügbaren Kristallstruktur- oder Homologiemodellen des Enzyms basieren. Zwei Regionen der AAO werden für die zufällige Mutagenese und Rekombination ins Visier genommen: die M1-Region und die M2-Region.