Entwicklung Methode Regie in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie Mutantenbibliotheken in Saccharomyces Cerevisiae für gerichtete Evolutionsexperimente konstruiert und gescreent werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Laborerstellung zu beantworten, die für fokussierte gerichtete Evolutionsexperimente verwendet werden, wie z. B. die Zuweisung von überlappenden Bereichen für die Assemblierung und Klonierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit und Robustheit, da in nur einem Transformationsschritt Ebenen mit guter Qualität zugewiesen werden können.

Dieses Protokoll zur Erstellung und zum Screening von Mutantenbibliotheken wird für eine pilzliche Arylalkoholoxidase (AAO) demonstriert. Die Regionen für die fokussierte gerichtete Evolution werden zunächst mit Hilfe von Rechenalgorithmen ausgewählt, die auf den verfügbaren Kristallstruktur- oder Homologiemodellen des Enzyms basieren. Zwei Regionen der AAO werden für die zufällige Mutagenese und Rekombination ins Visier genommen: die M1-Region und die M2-Region.

Zur Amplifikation der Zielbereiche wird eine mutagene PCR durchgeführt. Um das in vivo Spleißen in Hefe zu fördern, werden überlappende Bereiche zwischen den Segmenten von jeweils etwa 50 Basenpaaren durch Überlagerung von PCR-Reaktionen der definierten Regionen erzeugt. Bereiten Sie mutagene PCRs mit einem Volumen von 50 Mikrolitern vor, die jeweils 46 Nanogramm DNA-Template, je 90 Nanomolare Sense- und Antisense-Primer, 0,3 Millimolare DNTPs, 3 % DMSO, 1,5 Millimolar Magnesiumchlorid, 05 Millimolar Manganchlorid und 05 Einheiten pro Mikroliter Tack-DNA-Polymerase enthalten.

Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 95 Grad Celsius für zwei Minuten, 95 Grad Celsius für 45 Sekunden, 50 Grad Celsius für 45 Sekunden und 74 Grad Celsius für 45 Sekunden für 28 Zyklen und 74 Grad Celsius für 10 Minuten. Der Rest des AAO-Gens, die HF-Region, wird durch High-Fidelity-PCR amplifiziert, wobei die entsprechenden Bereiche die mutagenen Segmente überlappen, und/oder linearisierte Vektorüberhänge eingeschlossen werden.

Bereiten Sie die High-Fidelity-PCR in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern vor, das 10 Nanogramm DNA-Template, je 250 Nanomolar Sense- und Antisense-Primer, 0,8 Millimolar DNTPs, 3 % DMSO und 02 Einheiten pro Mikroliter iProof Ultra-High-Fidelity-DNA-Polymerase enthält. Verwenden Sie das folgende PCR-Programm. 98 Grad Celsius für 30 Sekunden, 98 Grad Celsius für 10 Sekunden, 55 Grad Celsius für 25 Sekunden und 72 Grad Celsius für 45 Sekunden für 28 Zyklen und 72 Grad Celsius für 10 Minuten.

Alle PCR-Fragmente werden dann mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Der nächste Schritt besteht darin, den Vektor zu linearisieren, um flankierende Regionen von etwa 50 Basenpaaren zu erzeugen, die homolog zu den fünf Primzahlen und drei Primzahlen des Zielgens sind. Bereiten Sie ein 20-Mikroliter-Linearisierungsreaktionsgemisch vor, das 2 Mikrogramm DNA, 7,5 Einheiten BamH-on, 7,5 Einheiten XHO-one, 20 Mikrogramm BSA und zwei Mikroliter 10x Puffer BamH-one enthält.

Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden und 40 Minuten. Danach inaktivieren Sie die Reaktion bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten. Um den linearisierten Vektor zu reinigen und eine Kontamination mit dem verbleibenden zirkulären Plasmid zu vermeiden, laden Sie das Aufschlussreaktionsgemisch in den Mega-Well eines semi-präparativen Agarose-Gels mit niedrigem Schmelzpunkt.

Laden Sie fünf Mikroliter des Reaktionsgemisches in die benachbarte Vertiefung als Reporter. Führen Sie die DNA-Elektrophorese bei vier Grad Celsius und fünf Volt pro Zentimeter zwischen den Elektroden durch. Trennen Sie dann das Agarose-Gel entsprechend der Mega-Vertiefung und lagern Sie es bei vier Grad Celsius in einem XTAE.

Beflecken Sie die Spur mit der Molekulargewichtsleiter und dem Reporter. Visualisieren Sie die Bänder unter UV-Licht, und markieren Sie die Position, an der sich der linearisierte Vektor befindet. In Abwesenheit von UV-Licht und unter Verwendung der Kerben in der gefärbten Reporterspur wird der linearisierte Vektor im Mega-Well-Fragment identifiziert und exzidiert.

Extrahieren Sie den linearisierten Vektor aus der Agarose und reinigen Sie ihn mit einem handelsüblichen Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Anschließend wird der gereinigte linearisierte Vektor mit den PCR-Fragmenten gemischt und diese DNA-Mischung wird verwendet, um kompetente Hefezellen mit einem kommerziellen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu transformieren. Plattieren Sie die transformierten Zellen auf SC-Dropout-Platten und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Um sich auf diesen Assay vorzubereiten, entnehmen Sie einzelne Kolonien aus den SC-Dropout-Platten und übertragen Sie sie auf 96-Well-Platten mit 50 Mikrolitern minimalem Medium pro Well. In jeder Platte ist Spalte Nummer sechs mit dem Elterntyp als internem Standard zu impfen. Als Negativkontrolle wird H-one, gefüllt mit SC-Medien, die mit Uracil supplementiert sind, gut mit URA3-negativen ESI-Viszeralzellen ohne Plasmid inokuliert.

Decken Sie die Platten mit dem Deckel ab, wickeln Sie sie in Parafolie ein und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius in einem feuchten Shaker. Geben Sie nach 48 Stunden 160 Mikroliter Expressionsmedium in jede Vertiefung und verschließen Sie die Platten wieder. Weitere 24 Stunden inkubieren.

Nach dem Zentrifugieren werden die Platten mit einer Multistation für die Flüssigkeitshandhabung mit einem Liquid-Handling-Roboter verwendet, um 20 Mikroliter des Überstands aus den Vertiefungen in jeder Platte auf eine Nachbildung der Platte zu übertragen. Geben Sie 20 Mikroliter von zwei Millimolaren P-Methoxybenzylalkohol und 100 Millimolaren Natriumphosphatpuffer ph 6,0 in jede Vertiefung. Rühren Sie die Platten mit einem 96-Well-Plattenmischer kurz um und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend gibst du 160 Mikroliter des FOX Reagants auf jede Replikplatte und rührst kurz mit dem Mixer um. Lesen Sie die Platten bei 560 Nanometern mit einem Plattenlesegerät ab. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur, bis sich die Farbe entwickelt.

Messen Sie die Absorption erneut. Die relative Aktivität wird aus der Differenz zwischen dem Absorptionswert nach der Inkubation und dem der ersten Messung berechnet, normiert auf den Elterntyp für jede Platte. Dieses repräsentative Gelbild zeigt den linearisierten Vektor auf Bahn zwei, das M1-PCR-Segment auf Bahn drei, das M2-PCR-Segment auf Bahn vier, das HF-PCR-Segment auf Bahn fünf und den in vivo reassemblierten Vektor, der mit NHE eins auf Bahn sechs linearisiert wurde.

Dieses nächste Gel zeigt die Plasmid-Mini-Vorbereitung des reassemblierten Vektors in Bahn zwei, das mit NHE linearisierte Plasmid in Bahn drei, das Plasmid linearisiert mit BamH eins und XHO eins in Bahn vier, und das linearisierte Plasmid, das durch Gelextraktion und -reinigung in Bahn fünf erhalten wurde. Die Mutationslasten wurden angepasst, indem Mutantenbibliotheken mit unterschiedlichen Landschaften beprobt wurden, die Anzahl der Klone mit weniger als 10% der elterlichen Enzymaktivität berechnet und eine weitere Verifizierung durch Sequenzierung einer Zufallsstichprobe von aktiven und nicht-aktiven Varianten durchgeführt wurde. Eine Auswertung der Nachweisgrenze dieses Assays zeigte, dass der Assay in Gegenwart von Sorbitol, dargestellt durch schwarze Kreise, linear war.

In Abwesenheit von Sorbit, das durch die weißen Quadrate dargestellt wird, war die Linearität persistenter, aber die Reaktion war schwächer. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der AAO-Konzentration und der Absorption beobachtet. Eine Mutantenbibliothek von 2.000 Klonen wurde konstruiert und mit diesem Assay gescreent.

Das schattierte Quadrat zeigt die AAO-Mutanten mit deutlich verbesserter Sekretion und Aktivität gegen P-Methoxybenzylalkohol. Sobald sie gemeistert sind, können Mutantenbibliotheken in etwa vier Stunden erstellt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, jeder PCR-Familie und jedem linearisierten Vektor die richtigen überlappenden Bereiche für das in vivo Spleißen und Klonieren in einem einzigen Transformationsschritt zuzuweisen.

Einem ähnlichen Ansatz folgend können andere Methoden wie in vivo DNA-Probennahme, Sättigungsmutagenese-Bibliothek oder DNA-Assemblierung durchgeführt werden, um Mutantenbibliotheken und/oder Stoffwechselwege zu konstruieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Bioengineerings, um Aktivitäten und Stabilitäten zu erforschen oder sogar unendliche Arten der Interaktion zu erfinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Saccharomyces Cerevisiae-Gerät für den Aufbau und das Screening von Bibliotheken nutzen können