Name: Entwicklung Methode Regie in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion und das Screening von Mutantenbibliotheken in Saccharomyces cerevisiae für gerichtete Evolution. Diese Methode nutzt computergestützte Algorithmen zur Auswahl von Zielregionen und ermöglicht effiziente Proteinoptimierung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549 der Europäischen Kommission, ein Cost-Action CM1303-Systems Biokatalyse und die nationalen Projekte Dewry [BIO201343407-R] und Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Library Construction <ol><li> Wählen Sie die Regionen unterworfen werden mit Hilfe von Computer - Algorithmen auf MORPHING basierend auf den verfügbaren Kristallstruktur oder Homologie - Modelle 18. <ol><li> Dabei zielen zwei Regionen AAO aus Pleurotus für zufällige Mutagenese und Rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), während Amplifizieren der Rest des Gens (844 bp) von High-Fidelity - PCR (Abbildung 1). Hinweis: Mehrere Segmente können durch MORPHING in einem unabhängigen oder kombinierten Weise 16 untersucht werden. </li></ol></li><li> Amplify die Zielgebiete durch mutagene PCR. Erstellen Sie überlappende Bereiche zwischen den Segmenten (~ 50 bp jeweils) durch Überlagerung PCR-Reaktionen der definierten Regionen. <ol><li> Vorbereitung mutagene PCR gezielte Segmente in einem Endvolumen von 50 ul, enthaltend DNA-Templat (0,92 ng / ul), 90 nM Oligo Sinn (RMLn für Segment MI und AAO-BP für das Segment M-II), 90 nM antisense Primer (AAO-92C für Segment MI und RmlC für das Segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM each), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,5 mM MgCl 2, 0,05 mM MnCl 2 und 0,05 U / &amp; mgr; l Taq DNA - Polymerase. Primer - Sequenzen sind in 1 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 2 Minuten (1 Zyklus); 95 ° C für 45 sec, 50 ° C für 45 sec, 74 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 74 ° C für 10 min (1 Zyklus). </li></ol></li><li> Amplify die nicht mutagen Regionen mit ultra-High-Fidelity-Polymerase und umfassen die entsprechenden Bereiche der mutagenen Segmente überlappende und / oder linearisierte Vektor Auskragungen. <ol><li> Bereiten Reaktionsgemische in einem Endvolumen von 50 &amp; mgr; l, enthaltend: DNA-Matrize (0,2 ng / &amp; mgr; l), 250 nM Oligo Sinne HFF, 250 nM Oligo Antisense- HFR, 0,8 mM dNTPs (jeweils 0,2 mM), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 0,02 U / &amp; mgr; l iProof DNA - Polymerase. Die Primer-Sequenzen sind in &lt;strong&gt; 1. </li><li> Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 98 ° C für 30 Sekunden (1 Zyklus); 98 ° C für 10 sec, 55 ° C für 25 sec, 72 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 72 ° C für 10 min (1 Zyklus). Hinweis: Bei Bedingungen , die in 1.2 und 1.3 Überlappungen von 43 bp (Plasmid-M1 - Region); 46 bp (M1-Region-HF-Bereich); 47 bp (HF-Bereich M2 region) und 61 bp (M2 regions Plasmid) sind so ausgelegt , (1) in vivo Spleißen in Hefe zu begünstigen. </li><li> Man reinige das alle PCR-Fragmente (mutagene und nicht-mutagene) mit einem handelsüblichen Kit Gel Extraction dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li></ol></li><li> Linearisieren des Vektors, so daß Bereiche von etwa 50 bp flankiert werden erstellt, die zu den 5&#39;- und 3&#39;-Enden des Zielgens homolog sind. <ol><li> Bereiten Sie eine Linearisierungsreaktionsmischung , die 2 ug DNA, 7,5 U Bam HALLO, 7,5 U XhoI, 20 &amp; mgr; g BSA und 2 ul Puffer Bam HALLO 10x in einem Endvolumen von 20 ul. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 2 h und 40 min. Danach fahren Sie für 20 min bei 80 ° C mit Inaktivierung. </li></ol></li><li> Reinige den linearisierten Vektor durch Agarose - Gel Extraction Kontamination mit dem Rest zirkuläre Plasmid (Figur 2) zu vermeiden. <ol><li> Laden die Verdauung Reaktionsmischung in den Mega-Well einer semi-präparativen niedrigem Schmelzpunkt Agarosegel (0,75%, w: v) sowie ein Aliquot (5 ul) der Reaktionsmischung in dem benachbarten auch als Reporter. </li><li> Run DNA-Elektrophorese (5 V / cm zwischen den Elektroden, 4 ᵒC) und trennen Sie die Agarose-Gel auf die Mega-gut entspricht, und speichern Sie sie bei 4 ᵒC in 1x TAE. </li><li> Stain die Spur mit dem Molekulargewicht Leiter und dem Reporter. Visualisieren Sie die Bänder unter UV-Licht. Nick die Position, wo die linearisierte Vektor Plätze. Hinweis: Da die Qualität des gereinigten linearisierten Vektor a Criti istcal Faktor für eine erfolgreiche Rekombination und Montage in Hefe, Gel-Färbung für semi-präparative DNA-Elektrophorese zu vermeiden. Die Verwendung von Farbstoffen und UV - Belichtung für Gel Extraktion kann die Stabilität des DNA - Vektors beeinflussen, Beeinträchtigung der in vivo - Rekombination Effizienz. Als Alternative zu toxischen EtBr Farbstoffe, Gel Red und SYBR-Farbstoffe werden für Gel-Färbung verwendet. </li><li> In Abwesenheit von UV-Licht, identifizieren die linearisierte Vektor im Fragment mega-gut die Führung der Kerben in der gefärbten Reporter Spur mit, so dass es isoliert werden kann. </li><li> Extrahieren der linearisierte Vektor aus Agarose und reinige sie mit einem handelsüblichen Gel Extraction-Kit nach Herstellerprotokoll. Hinweis: Verwenden Sie High-Kopie episomalen Shuttle - Vektoren mit Antibiotika und Auxotrophie - Marker: In diesem Beispiel wird die Uracil unabhängig und Ampicillinresistenz pJRoC30 Vektor unter der Kontrolle des Hefe - GAL1 - Promotor eingesetzt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine äquimolare mixture der PCR-Fragmente und mit dem linearisierten Vektor mischen zu einem 2: 1-Verhältnis, mit nicht weniger als 100 ng linearisierter Plasmid (Test unterschiedliche Verhältnisse von äquimolaren Bibliothek / offener Vektor gute Transformation Ausbeuten zu erzielen). <ol><li> Messen der Extinktion der PCR-Fragmente und linearisierten Vektor bei 260 nm und 280 nm, ihre Konzentration und Reinheit zu bestimmen. </li></ol></li><li> Trans Hefe kompetente Zellen mit dem DNA - Gemisch eine kommerzielle Hefe Transformation Kit (siehe Tabelle für die Versorgung) gemäß den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Hier verwenden eine Protease - defizienten und URA3 - abhängig S. cerevisiae - Stamm, BJ5465. Transformation der Zellen mit dem parentalen Vektor zirkularisierten als interner Standard bei Screening (siehe unten). Darüber hinaus überprüfen Sie den Hintergrund durch das linearisierte Vektor in Abwesenheit von PCR-Fragmenten verwandeln. Hinweis: Bei der anfänglichen niedrigen Sekretionsmengen Erkennung verwenden S.cerevisiae - Protease - defiziente Stämme wie BJ5465 die Anhäufung von aktiven Protein in den Kulturüberständen zu fördern. Wenn das Zielenzym Hyperglykosylierung läuft, die Verwendung von Glykosylierungs-defizienten Stämmen (beispielsweise die Δ kre2 nur des Anbringens kleineren Mannose Oligomeren kann) kann eine geeignete Wahl sein. </li></ol></li><li> Platte die transformierten Zellen auf SC Drop-out-Platten und sie für drei Tage bei 30 ° C inkubiert. Teller (auf SC Drop-out - Platten , ergänzt mit Uracil) URA3 - S. cerevisiae - Zellen , die das Plasmid als negative Kontrolle für das Screening fehlt (siehe unten). </li></ol> 2. Hochdurchsatz-Screening-Assay (Abbildung 3) <ol><li> Füllen eine geeignete Anzahl von sterilen 96-Well-Platten (23 Platten mit einer Bibliothek von 2.000 Klonen zu analysieren) mit 50 &amp; mgr; l Minimalmedium pro Vertiefung mit Hilfe eines Pipettierroboters. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem SC-Drop-out-Platten und sie auf den 96-Well-Platten. <ol><li> In jeder Platte Spaltennummer 6 mit dem Elterntyp als interner Standard inokulieren und gut mit URA3 H1 - S. cerevisiae - Zellen (in SC - Medium mit Uracil ergänzt) ohne Plasmid als negative Kontrolle. Hinweis: Nun H1 gefüllt ist speziell mit Drop-out mit Uracil Medien. Eine leere gut haltigen Medien ohne Zellen können auch als zusätzliche Sterilitätskontrolle hergestellt werden. </li></ol></li><li> Decken Sie die Platten mit ihren Deckeln und wickeln Sie sie in Parafilm. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 30 ° C, 225 rpm und 80% relativer Luftfeuchtigkeit in einem feuchten shaker. </li><li> Entfernen Sie die Parafilm, fügen Sie 160 ul Expressionsmedium zu jeder Vertiefung mit Hilfe des Pipettierroboter, wieder verschließen die Platten und inkubieren sie für weitere 24 Stunden. Hinweis: Minimal Medium und Expressionsmedium hergestellt werden , wie an anderer Stelle 19 berichtet. Sekretionsniveaus variieren kann auf dem Gen untersucht und dementsprechend abhängig, ter Inkubationszeiten jeweils optimiert werden müssen das Zellwachstum in allen Vertiefungen zu synchronisieren. </li><li> Zentrifuge die Platten (Masterplatten) bei 2.800 x g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 20 ul des Überstandes aus den Vertiefungen in der Master-Platte an der Replik Platte ein Liquid-Handling Roboter-Multistation verwendet wird. Hinweis: Um begünstigen Enzym - Sekretion ist es ratsam, das native Signalpeptid des Zielproteins durch Signalpeptide häufig für die heterologe Expression in Hefe verwendet zu ersetzen (zB die α - Faktor Präpro-Führer, der Führer der K 1 Killer - Toxin von S. cerevisiae oder auch chimäre Versionen der beiden Peptide 13). Alternativ kann das native Signalpeptid ausschließlich für die Sekretion in Hefe entwickelt werden. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.0 mit Hilfe der Pipettierroboter. Rühren Sie die Platten kurz mit einem 96-wirll Tellermischer und brüten sie für 30 min bei RT. </li><li> Mit dem Pipettierroboter, fügen Sie 160 ul des FOX - Reagens zu jeder Replik Platte und rühren Sie kurz mit dem Mischer (Endkonzentration von FOX Mischung in den Brunnen: 100 &amp; mgr; M Xylenolorangelösung, 250 &amp; mgr; M Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 und 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Fügen mehrere Zusatzstoffe der Reagenz Empfindlichkeit zu erhöhen, wie organische Cosolventien (DMSO, Ethanol, Methanol) oder Sorbitol 17. Hier verstärken die Reaktion von Sorbitol zu einer Endkonzentration von 100 mM Zugabe (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Lesen Sie die Platten (End-Point - Modus, t 0) bei 560 nm auf einem Plattenleser. </li><li> Die Inkubation bei RT , bis die Farbe wieder die Absorption entwickelt und messen (t 1). <ol><li> Berechnen Sie die relative Aktivität aus der Differenz zwischen dem ABS-Wert nach der Inkubation und der anfänglichen Messung normiert auf die parental Typ für jede Platte (At 1 - t 0). </li></ol></li><li> Betreff die besten Mutante Treffer zu zwei aufeinander folgenden Wieder Screenings Fehlalarme auszuschließen. Hinweis: In der Regel wieder Screenings Plasmidisolation von Hefe, Amplifikation und Reinigung in Escherichia coli umfassen, gefolgt von Transformation frische Hefe - Zellen mit dem Plasmid 19. Jeder ausgewählte Klon wird in pentaplicate erneut kontrolliert. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Artikel haben wir die meisten der Tipps und Tricks beschäftigt in unserem Labor zu konstruieren Enzyme durch gerichtete Evolution in S. zusammengefasst cerevisiae (unter Verwendung AAO als Beispiel) , so dass sie für die Verwendung mit vielen anderen eukaryotischen Enzymsysteme durch einfaches Folgenden werden die allgemeinen hier beschriebenen Ansatz angepasst werden kann. In Bezug auf die Bibliothek Schöpfung ist MORPHING eine schnelle Ein-Topf - Verfahren einzu...

Regie molekulare Evolution ist eine robuste, schnelle und zuverlässige Methode zu entwerfen Enzyme 1, 2. Durch iterative Runden zufällige Mutation, Rekombination und Screening, verbesserte Versionen von Enzymen erzeugt werden können , die auf neue Substrate wirken, in neuartigen Reaktionen, in nicht-natürliche Umgebungen oder sogar um die Zelle zu unterstützen neue metabolische Ziele 3-5 zu erreichen. Unter den Wirten in der gerichteten Evolution verwendet, um die Hefe Saccharomyces cerevisiae Brau bietet ein Repertoire an Lösungen für die funktionelle Expression von komplexen eukaryotischen Proteine ​​, die 6,7 in den prokaryotischen sonst nicht verfügbar sind. Verwendet erschöpfend in der Biologie Studien Zelle dieses kleine eukaryotischen Modell hat viele Vorteile in Bezug auf die post-translationale Modifikationen, die einfache Handhabung und Transformationseffizienz, von denen alle wichtigen Merkmale sind Enzyme zu konstruieren , durch gerichtete Evolution 8. Darüber hinaus ist die Hochfrequenzvon homologen DNA - Rekombination in S. cerevisiae gekoppelt seiner effizienten proof-Lesevorrichtung eröffnet eine breite Palette von Möglichkeiten für die Bibliothekserstellung und Genanordnung in vivo, um die Entwicklung der verschiedenen Systeme von einzelnen Enzymen zur komplexen künstlichen Wege 9-12 fördern. Unser Labor hat die letzten zehn Jahre verbrachte Tools und Strategien für die molekulare Evolution verschiedener Ligninasen in Hefe (Oxidoreduktasen beteiligt in den Abbau von Lignin während der natürlichen Holzzersetzung) 13-14 entwerfen. In dieser Mitteilung stellen wir ein detailliertes Protokoll und Bildschirm Mutantenbibliotheken in S. vorzubereiten cerevisiae für ein Modell flavooxidase, Aryl-Alkohol - Oxidase (AAO 15) -, die leicht auf viele andere Enzyme , übersetzt werden können. Das Protokoll beinhaltet eine fokussierte gerichtete Evolution - Methode (MORPHING: mutagene Organized Rekombinationsprozeß durch homologe in vivo - Gruppierung) von der Hefezelle Gerät 16 unterstützt wird , einda sehr empfindlich Screening - Test auf der Grundlage der Fenton - Reaktion , um AAO - Aktivität nachzuweisen in der Kulturbrühe sezerniert 17.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Nährmedien</stark></td>Ampicillin-Natriumsalz <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Hefe Stickstoff Base ohne Aminosäuren</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Hefe Synthetisches Drop-out Medium Supplements ohne Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</strong</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>2. PCR-Reaktionen</td>dNTP Mix Agilent Genomik 200415-51 je 25 mM iProof High-Fidelity DNA-Polymerase Bio-rad 172-5301 Mangan(II)-<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorid-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197,91</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Taq DNA-Polymerase Sigma-Aldrich D4545 Für Fehler <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> prone PCR</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>3. Plasmid-Linearisierung</td>BamHI-Restriktionsenzym New England Biolabs R0136S Rinderserumalbumin New England Biolabs B9001S XhoI-Restriktionsenzym <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I Restriktionsenzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Gel Rot <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Zum Färben von DNA</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. FOX assays</td>Ammoniumeisen(II)-<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulfathexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard</td></tr><tr><td>curve Xylenol Orange Dinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. Agarose Gel stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Rot</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA-Analysefarbstoff</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. Standard</td></tr><tr><td>Ladefarbstoff 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Niedrigschmelztemperatur Agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</strong<></td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>6. Kits und Zellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae Stamm BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease-defizienter Stamm mit Genotyp: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue kompetente Zellen</td><td>Agilent Genomics</td><td>200150</td><td>Für die Plasmidaufreinigung und -amplifikation</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA-Gel-Extraktion</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Säule Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Hefe Transformation</td><td>Kit Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Inklusive DNA-Träger (Lachshoden)</td></tr><tr><td>Zymoprep Hefe Plasmid Miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmidextraktion aus Hefe</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. Platten</stark>96-Well-Platten</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Klar, unsteril, Polystyrol (für Aktivitätsmessungen)</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Klar, steril, Polystyrol (für Mikrofermentationen)</td></tr><tr><td>96-Well-Plattendeckel</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Klar, steril, Polystyrol (für Mikrofermentationen)</td></tr></tbody></table>

entwicklung methode regie in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant bibliothek schöpfung und screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae bietet viele attraktive Vorteile , wenn Enzyme für biotechnologische Anwendungen entwerfen, ein Prozess, der Konstruktion, Klonierung und Expression von mutanten Bibliotheken, die mit Hochfrequenz - homologe DNA - Rekombination in vivo beinhaltet. Hier stellen wir ein Protokoll zu erstellen und Bildschirmmutantenbibliotheken in Hefe am Beispiel eines Pilz Aryl-Alkohol-Oxidase (AAO) seine Gesamtaktivität zu verbessern. Zwei Proteinsegmente wurden einer fokussierten gerichteten Evolution durch zufällige Mutagenese und in - vivo - DNA - Rekombination. Auskragungen von ~ 50 bp jedes Segment flankieren, erlaubt die korrekte Zusammenbau der AAO-Fusionsgens in linearisierter Vektor zu einem vollen autonom replizierenden Plasmid führt. Mutant Bibliotheken angereichert mit funktionellen AAO - Varianten wurden in S. gescreent cerevisiae Überstand mit einem empfindlichen Assay mit hohem Durchsatz auf die Fenton - Reaktion basiert. Der allgemeine Prozess derBibliothekskonstruktion in S. cerevisiae beschrieben hier leicht zu entwickeln viele andere eukaryotischen Genen angewandt werden, die Vermeidung zusätzliche PCR - Reaktionen, in vitro - DNA - Rekombination und Ligatur Schritte.

AAO von P. eryngii ist eine extrazelluläre flavooxidase die Pilz-Peroxidasen mit H 2 O 2 liefert Lignin zu starten angreifen. Zwei Segmente der AAO wurden fokussierte gerichtete Evolution unterworfen , indem MORPHING, um ihre Aktivität und ihre Expression zu verstärken in S. cerevisiae 19. Unabhängig von den ausländischen von S. beherbergte Enzyme cerevisiae, die kritischste Problem , wenn Mutantenbibliotheken in Hefe K...

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Konstruktion und zum Screening von Mutantenbibliotheken für gerichtete Evolutionskampagnen in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, zu zeigen, wie Mutantenbibliotheken in Saccharomyces cerevisiae für Experimente zur gerichteten Evolution konstruiert und analysiert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der laborbasierten Erzeugung für fokussierte Experimente zur gerichteten Evolution zu beantworten, beispielsweise wie überlappende Bereiche bei der Assemblierung und dem Klonen zugewiesen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit und Robustheit, da bereits nach einem einzigen Transformationschritt etwas auf einem qualitativ hochwertigen Niveau erreicht werden kann.Dieses Protokoll zur Erstellung und Durchmusterung von Mutantenbibliotheken wird am Beispiel einer pilzlichen Arylalkohol-Oxidase oder AAO demonstriert. Die Bereiche für die gezielte gerichtete Evolution werden zunächst mithilfe computergestützter Algorithmen ausgewählt, die auf der verfügbaren Kristallstruktur oder Homologiemodellen des Enzyms basieren. Zwei Bereiche der AAO werden für die zufällige Mutagenese und Rekombination gezielt angegriffen: der M1-Bereich und der M2-Bereich.Mit der mutagenen PCR sollen die gezielten Bereiche amplifiziert werden. Um das In-vivo-Spleißen in Hefe zu fördern, werden überlappende Bereiche zwischen Segmenten von jeweils etwa 50 Basenpaaren erzeugt, indem PCR-Reaktionen der definierten Regionen überlagert werden. Bereiten Sie mutagene PCR-Ansätze mit einem Volumen von 50&nbsp;Mikroliter vor, die jeweils 46 Nanogramm DNA-Template, 90 Nanomolar jeweils der Sinnes- und Antisinnprimer, 0,3 Millimolar dNTPs, 3&nbsp;% DMSO, 1,5 Millimolar Magnesiumchlorid, 0,5 Millimolar Manganchlorid und 0,5 Einheiten pro Mikroliter Tak-DNA-Polymerase enthalten.Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 95 Grad Celsius für zwei Minuten, 95 Grad Celsius für 45 Sekunden, 50 Grad Celsius für 45 Sekunden und 74 Grad Celsius für 45 Sekunden über 28 Zyklen sowie 74 Grad Celsius für 10 Minuten. Der verbleibende Teil des AAO-Gens, der HF-Bereich, wird mittels hochpräziser PCR amplifiziert, wobei die entsprechenden Bereiche, die die mutagene Abschnitte und/oder die Überhänge des linearisierten Vektors überlappen, mit einbezogen werden.Stellen Sie die hochfidelige PCR in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern her, das 10 Nanogramm DNA-Vorlage, jeweils 250 Nanomolar der Sinus- und Antisinnprimer, 0,8 Millimolar dNTPs, 3 % DMSO und 0,2 Einheiten pro Mikroliter iProof-Ultra-Hochfidelitäts-DNA-Polymerase enthält. Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 98 Grad Celsius für 30 Sekunden, 98 Grad Celsius für 10 Sekunden, 55 Grad Celsius für 25 Sekunden und 72 Grad Celsius für 45 Sekunden über 28 Zyklen sowie 72 Grad Celsius für 10 Minuten.Alle PCR-Fragmente werden anschließend mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit gemäß Herstellerprotokoll gereinigt. Im nächsten Schritt wird der Vektor linearisiert, um flankierende Bereiche von etwa 50 Basenpaaren zu erzeugen, die homolog zu den 5'- und 3'-Enden des Zielgens sind. Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Linearisierungsreaktionsmischung vor, die 2 Mikrogramm DNA, 7,5 Einheiten BamH1, 7,5 Einheiten Xho1, 20 Mikrogramm BSA und zwei Mikroliter 10x-Puffer für BamH1 enthält.Die Reaktionsmischung 2 Stunden und 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Reaktion durch Erhitzen auf 80 Grad Celsius für 20 Minuten inaktivieren. Um den linearisierten Vektor zu reinigen und eine Kontamination mit dem verbleibenden zirkulären Plasmid zu vermeiden, die Verdauungsreaktionsmischung in die Mega-Vertiefung eines semipräparativen Agarose-Gels mit niedrigem Schmelzpunkt geben.Geben Sie fünf Mikroliter der Reaktionsmischung in die benachbarte Vertiefung als Reporter. Führen Sie die DNA-Elektrophorese bei vier Grad Celsius und fünf Volt pro Zentimeter zwischen den Elektroden durch. Trennen Sie dann das Agarosegel, das der Mega-Vertiefung entspricht, und lagern Sie es bei vier Grad Celsius in 1×TAE.Färben Sie die Spur mit der Molekulargewichtsleiter und dem Reporter. Sichtbaren Sie die Banden unter UV-Licht und ritzen Sie die Position ein, an der sich der linearisierte Vektor befindet. Ohne UV-Licht und unter Verwendung der Einschnitte in der gefärbten Reporter-Spur identifizieren Sie den linearisierten Vektor im Mega-Well-Fragment und schneiden Sie ihn aus.Extrahieren Sie den linearisierten Vektor aus dem Agarosegel und reinigen Sie ihn mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit gemäß der Herstellerprotokolle. Anschließend wird der gereinigte, linearisierte Vektor mit den PCR-Fragmenten gemischt, und dieses DNA-Gemisch wird verwendet, um kompetente Hefezellen mit einem kommerziellen Kit gemäß den Herstelleranweisungen zu transformieren. Impfen Sie die transformierten Zellen auf SC-Auswahlplatten aus und inkubieren Sie sie bei 30 Grad Celsius für drei Tage.Zur Vorbereitung dieses Assays einzelne Kolonien von den SC-Auswahlplatten entnehmen und in 96-Loch-Platten überführen, die je 50 Mikroliter Minimalmedium pro Loch enthalten. In jeder Platte die Spalte Nummer sechs mit dem Parentalstamm als interner Standard ansäen. Als negativen Kontrollversuch das Loch H1, das mit SC-Medium ergänzt durch Uracil gefüllt ist, mit URA3-negativen ESI-viszeralen Zellen ohne Plasmid ansäen.Die Platten mit ihren Deckeln abdecken, mit Parafilm umwickeln und 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius in einem befeuchteten Schüttelinkubator inkubieren. Nach 48 Stunden 160 Mikroliter Expressionsmedium zu jedem Well hinzufügen und die Platten erneut versiegeln. Weitere 24 Stunden inkubieren.Nach der Zentrifugation der Platten verwenden Sie ein robotisches Flüssigkeitsmanipulationssystem mit mehreren Stationen, um 20 µL des Überstandes aus den Vertiefungen jeder Platte in eine Replikatplatte zu überführen. Geben Sie 20 µL zweimillimolarer P-Methoxybenzylalkohol-Lösung und 100 Millimolar Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, zu jeder Vertiefung hinzu. Rühren Sie die Platten kurz mit einem 96-Loch-Platten-Mischer und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie anschließend 160 Mikroliter des FOX-Reagenz zu jeder Replikatplatte hinzu und rühren Sie kurz mit dem Mixer um. Messen Sie die Platten bei 560 Nanometern in einem Plattenreader. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur, bis sich die Farbe entwickelt hat.Messen Sie die Absorption erneut. Die relative Aktivität wird aus der Differenz zwischen dem Absorptionswert nach der Inkubation und dem des anfänglichen Messwerts berechnet, normiert auf den Parentalstamm für jede Platte. Dieses repräsentative Gelelektrophoresebild zeigt den linearisierten Vektor in Spur zwei, das M1-PCR-Fragment in Spur drei, das M2-PCR-Fragment in Spur vier, das HF-PCR-Fragment in Spur fünf und den in vivo reassemblierten Vektor, der mit NHE1 linearisiert wurde, in Spur sechs.Dieses nächste Gel zeigt die Plasmid-Minipräparation des reassemblierten Vektors in Spur zwei, das mit NHE ein linearisierte Plasmid in Spur drei, das mit BamH ein und XHO ein linearisierte Plasmid in Spur vier sowie das durch Gelextraktion und Aufreinigung erhaltene linearisierte Plasmid in Spur fünf. Die Mutationslasten wurden angepasst, indem Mutantenbibliotheken mit unterschiedlichen Landschaften untersucht wurden, wobei die Anzahl der Klone mit weniger als 10 % der elterlichen Enzymaktivität berechnet und anschließend durch Sequenzierung einer Zufallsstichprobe aktiver und inaktiver Varianten überprüft wurde. Eine Bewertung der Nachweisgrenze dieses Assays zeigte, dass der Assay in Gegenwart von Sorbit linear war, dargestellt durch schwarze Kreise.Bei Abwesenheit von Sorbitol, dargestellt durch die weißen Quadrate, war die Linearität ausgeprägter, jedoch war die Reaktion schwächer. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der AAO-Konzentration und der Absorption beobachtet. Mithilfe dieses Assays wurde eine Mutantenbibliothek aus 2.000 Klonen erstellt und untersucht.Das schattierte Quadrat zeigt die AAO-Mutanten mit signifikant verbesserter Sekretion und Aktivität gegen p-Methoxybenzylalkohol an. Sobald man die Methode beherrscht, können Mutantenbibliotheken in etwa vier Stunden hergestellt werden, wenn der Vorgang korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, für jede PCR-Familie und den linearisierten Vektor geeignete überlappende Bereiche zuzuweisen, um eine In-vivo-Verknüpfung und Klonierung in einem einzigen Transformationschritt zu ermöglichen.Mittels eines ähnlichen Ansatzes können andere Methoden wie die in vivo-DNA-Probenahme, die Sättigungsmutationsbibliothek oder die DNA-Assembly durchgeführt werden, um Mutantenbibliotheken und/oder Stoffwechselwege zu konstruieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Bioingenieurwissenschaft den Weg, um Aktivitäten, Stabilitäten oder sogar unendliche Arten von Wechselwirkungen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dieses Saccharomyces cerevisiae-System für die Konstruktion und Durchmusterung von Bibliotheken nutzt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.

Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte für die Durchführung von Auswahlkampagnen für Hefeoberflächendisplays zur Anreicherung von Proteinvarianten, die an ein Antigen von Interesse binden.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Lernen Sie die Konstruktion und das Screening von Mutantenbibliotheken in Saccharomyces cerevisiae für gerichtete Evolution. Diese Methode nutzt computergestützte Algorithmen zur Auswahl von Zielregionen und ermöglicht effiziente Proteinoptimierung.

Entwicklung Methode Regie in

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