In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Trium Castine-Telomerase in vitro zu rekonstituieren und ihre Aktivität zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das rekombinante His-Tag, Trillium Castine Turt oder TC Turt Protein in E. coli exprimiert wird. Das exprimierte TC Turt Protein wird anschließend durch verschiedene Chromatographieschritte gereinigt.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Trium-Castine-Käfer zu kultivieren und die gesamte RNA aus den Larven der Trium-Castane-Käfer zu isolieren. Das Telomerase-Enzym wird anschließend in vitro durch Mischen des rekombinanten TC-Turts mit der extrahierten Gesamt-RNA rekonstituiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die in vitro aus rekombinanten Proteinen und Gesamt-RNA rekonstituierte Telomerase eine Telomerase-Aktivität aufweist, wie im TRAP-Assay sichtbar gemacht werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in den Trium-KE-Telomerase-Komplex ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf andere Proteinnukleinsäure-Komplexe. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Isolierung der gesamten RNA aus dem Käfer äußerst empfindlich gegenüber RNA-Abbau ist und daher größte Sorgfalt erforderlich ist, um eine ordnungsgemäße Rekonstitution sicherzustellen. Dieses Protokoll beginnt mit der Expression des rekombinanten TC TURP mit einem durch das Tobacco-Etch-Virus-Protease spaltbaren N-terminalen HEXA-Histamin-Tag in transformierten Rosetta DE drei P lyse S Zellen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Nach der Zellernte werden die Zellen auf Eis für zwei Minuten in 32stel-Sekunden-Intervallen mit 32stel-Sekunden-Pausen bei etwa 51 Watt Leistung beschallt.

Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen bei 18.000 U/min für 20 Minuten, um die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen, und entfernen Sie vorsichtig das SUP natin. Reinigen Sie das supra natin mittels Nickelaffinitätschromatographie gemäß dem schriftlichen Protokoll. ELUTE TC turt mithilfe eines ole-Gradienten von der Nickel-NTA-Harze ab und sammeln Sie Fraktionen zu je drei Milliliter.

Verwenden Sie für die SDS-Page-Analyse die Page-Analyse, um zu bestimmen, in welchen Fraktionen das TC-Turt-Protein enthalten ist. Konzentrieren Sie diese Fraktionen in einem AmCon-30-Kilodalton-Millipore-Filter auf ein Volumen von weniger als 10 Milliliter. Äquilibrieren Sie anschließend eine HS-poröse Säule vorab.

Um das TC Turt-Protein durch Kationenaustauschchromatographie weiter zu reinigen, laden Sie das Protein-Gemisch auf die poröse HS-Säule auf und waschen Sie es, um alle Protein- und Nukleinsäurekontaminationen zu entfernen. Spülen Sie die Säule anschließend mit Puffer, der 500 Millimolar Kaliumchlorid enthält, gefolgt von 700 Millimolar Kaliumchlorid, um eventuelle verbleibende Kontaminationen zu entfernen. Eluieren Sie das TC Turt-Protein mit einem Puffer mit einem Molar Kaliumchlorid von der porösen HS-Säule.

An diesem Punkt sollte das Protein über 99 % rein sein. Entfernen Sie abschließend alle Proteinaggregate, indem Sie das Protein über eine vorgeregelte SUEx 200-Größe-Ausschluss-Säule laufen lassen. Das gereinigte TC Turt-Protein ist nun bereit für die in-vitro-Rekonstitution.

Einige Wochen vor diesem Protokoll wurde die Trium-Castin-Kultur angelegt, indem 100 adulte Käfer in einen Behälter mit 28,5 Gramm Mehl und 1,5 Gramm getrockneter Bäckerhefe gegeben wurden. Die Kulturen wurden drei bis vier Wochen lang bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Umgebung gelagert, um Fortpflanzung und Wachstum zu ermöglichen. Nach der Inkubation werden 20 Käferlarven aus der Kultur geerntet, indem sie von den adulten Käfern und der Mehl-Hefe-Kultur getrennt werden.

Entfernen Sie Blüten- oder Hefepartikel, die an den Käfern haften, bevor Sie diese zermahlen. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche sowie den Mörser und Stößel mit RNA-Zap, um alle Spuren von Ribonuklease zu entfernen, bevor Sie die Käfer in flüssigem Stickstoff zermahlen. Zermahlen Sie die Larven mit Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver.

Überführen Sie das Pulver unter Beibehaltung des flüssigen Stickstoffs in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass das Pulver bis zum Hinzufügen des Extraktionspuffers gefroren bleibt. Lassen Sie überschüssigen flüssigen Stickstoff verdampfen, nachdem der flüssige Stickstoff vollständig verdampft ist. Homogenisieren Sie das Käferpulver in 200 Mikroliter Extraktionspuffer und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.

Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 15.000 U/min für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation das gesammelte Überstandsmaterial in flüssigem Stickstoff sofort schockgefrieren. Schließlich die gesamte RNA mit dem Kyogen RN easy Mini Minikit extrahieren.

Beginnen Sie die in-vitro-Rekonstitution der T-castin-Telomerase, indem Sie 20 Mikrogramm rekombinantes hist-TAG-TC-TURP-Protein mit 50 Mikroliter T-castin-Gesamt-RNA in Bindungspuffer mischen. Inkubieren Sie die TC-TURP-Gesamt-RNA-Mischung zwei Stunden lang bei 22 Grad Celsius in T-castin-Lysat unter Zusatz eines RNase-Inhibitors, um RNA-Abbau zu verhindern. Reinigen Sie schließlich den Komplex über eine Nickel-NTA-Säule, um Lysat-Verunreinigungen und überschüssige RNA zu entfernen. Die rekonstituierte T-castin-Telomerase ist nun bereit für den Telomerase-Repeat-Amplification-Protocol-Assay.

Um den Trap-Assay zu beginnen, mischen Sie vier Mikrogramm gereinigtes Nickel-NTA-T-castin-Telomerase in 50 Mikroliter Verlängerungspuffer. Inkubieren Sie die Mischung 60 Minuten bei 30 Grad Celsius, um die Verlängerung einzelsträngiger DNA durch die rekonstituierte T-castin-Telomerase zu ermöglichen.

Extrahieren Sie die langgestreckte einzelsträngige DNA, indem Sie der Reaktionsmischung ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform hinzufügen. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig, bis die Emulsion homogen ist. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die einzelsträngige DNA von Verunreinigungen zu trennen.

Überführen Sie die obere wässrige Schicht der Probe in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen. Nach Zugabe von Natriumacetat pH 5,0, Magnesiumchlorid und Ethanol wird die Probe am folgenden Tag über Nacht bei minus 20 Grad Celsius zur Ausfällung belassen. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend 30 Minuten bei 15.000 U/min und vier Grad Celsius, um die ausgefällte einsträngige DNA als Pellet abzutrennen.

Entfernen Sie die Lösung mithilfe eines Pipettiergeräts und geben Sie anschließend 200 Mikroliter 70 %igen Ethanol zur Probe hinzu, um das verbleibende Natriumacetat und Magnesiumchlorid auszuwaschen. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang mit derselben Geschwindigkeit und Temperatur, um die Probenprobe abzustoßen. Entfernen Sie die Ethanollösung und trocknen Sie die restlichen Spuren von Ethanol, indem Sie das Eppendorf-Röhrchen drei Minuten lang offen bei Raumtemperatur inkubieren.

Das Vorhandensein von Ethanol in der Probe hemmt die PCR-Amplifikation. Nach dem Trocknen des Ethanol resuspendieren Sie das Einzelstrang-DNA-Pellet in 50 Mikrolitern PCR-Reaktionspuffer. Amplifizieren Sie anschließend die Telomerase-Elongationsprodukte mittels PCR. Laufen Sie ein 12 %iges Polyacrylamidgel mit Tris-Borat-EDTA-Puffer 30 Minuten vorab.

Nach dem Vorgel und dem Beladen des Gels mit den PCR-Reaktionen das Gel 1,5 bis zwei Stunden lang bei 185 Volt laufen lassen. Als letzter Schritt das Gel trocknen und die Phosphorabbildungsplatte verwenden, um die angezeigte Aktivität sichtbar zu machen. Hier sehen Sie ein Beispiel für gereinigtes TC-Turt nach Größenausschlusschromatographie.

Das nach der Reinigung angereicherte Protein wird auf einem 12 %igen SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen und zeigt sich nach Größenausschlusschromatographie als mehr als 99 % rein. Ein Chromatogramm wird ebenfalls bereitgestellt, um die Reinheit und das Fehlen von Aggregaten in der gereinigten Proteinprobe zu belegen. Beachten Sie, dass die endgültige Proteinmenge variieren kann.

Obwohl eine erwartete Ausbeute von fünf bis 10 Milligramm vorliegt, nachdem alle Reinigungsschritte abgeschlossen wurden, ist ein repräsentativer Trap-Assay für die rekonstituierte T castin-Telomerase dargestellt. Die stufenförmige Leiter der Telomerase-Produkte ist in Spur eins zu erkennen. Sie fehlt jedoch sowohl in den mit RNAs behandelten Telomerase- als auch in den turt-Aktivstelle-Mutanten-Proben in Spur zwei bzw. drei.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Telomerase-Enzym in vitro unter Verwendung von rekombinantem Protein und Gesamt-RNA rekonstituiert werden kann, und wie die Telomerase-Aktivität getestet werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben – insbesondere die extrahierte Gesamt-RNA – äußerst sorgfältig zu behandeln, da jede Rnase-Kontamination zu keinem Ergebnis führt.