Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes: Eine Technik zur Dezellularisierung von Herz und Lunge aus dem Mausmodell

Bei der Dezellularisierung werden die Organe ihrer zellulären Bestandteile beraubt, wobei die EZM-Struktur intakt bleibt. Dies trägt dazu bei, die 3D-Architektur von Organen zu erhalten. Für das Dezellularisierungsverfahren wird eine euthanasierte Maus in Rückenlage gelegt. Präparieren Sie die Maus und legen Sie den kardiopulmonalen Komplex frei.

Lizieren Sie alle großen Gefäße, die vom Herzen ausgehen, mit Ausnahme der Aorta und der großen Gefäße des Lungenkreislaufs. Dieser Schritt verhindert das Austreten von Flüssigkeit während des anschließenden Perfusionsverfahrens. Legen Sie eine Öffnung in der Luftröhre an und führen Sie einen Katheter durch diese Öffnung ein. Katheterisieren Sie die absteigende Aorta von unten, bis der Katheter den Aortenbogen erreicht.

Vernähen Sie die Katheter, um ihre Position zu sichern, und verbinden Sie sie mit der Perfusionspumpe. Beginnen Sie die Durchblutung mit entionisiertem Wasser. Die Perfusion durch die Aorta ermöglicht eine effiziente Entnahme von Blut aus dem gesamten Herzgefäßsystem. Schließlich gelangt das Wasser in die Lungenarterie und führt zur Lunge.

Nachdem Sie das Blut vollständig aus den Lungengefäßen entfernt haben, stoppen Sie die Wasserdurchblutung und ersetzen Sie es durch verschiedene Waschmittellösungen, die von mild bis stark reichen. Bei diesem Verfahren werden Zellen lysiert, die die intrazellulären Bestandteile freisetzen, wodurch Herz und Lunge durchscheinend erscheinen.

Erneut mit entionisiertem Wasser durchbluten, um alle verbleibenden Reinigungsmittelmoleküle zu entfernen. Lagern Sie den dezellularisierten kardiopulmonalen Komplex in einer antibiotikahaltigen Lösung, die eine lange Haltbarkeit gewährleistet.

Beginnen Sie damit, den Brustkorb, den Bauch und den Rücken der euthanasierten Maus mit dem Haarschneider zu rasieren. Desinfizieren Sie den Bereich mit 70% Ethanol. Stecken Sie die Maus dann an eine Styroporschale und strecken Sie dabei ihre Vorder- und Hintergliedmaßen sowie ihren Kopf und Schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.

Machen Sie mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster einen Hautschnitt, der von der submandibulären Region bis zum Unterbauch verläuft, und präparieren Sie subkutan, um die Brustwand und das Bauchfell freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer mikrochirurgischen Schere den Musculus pectoralis major und den Musculus pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.

Schneiden Sie das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte mit einer geraden Schere ab. Führen Sie dann eine Sternotomie durch, indem Sie das Brustbein entlang seiner Längsachse schneiden. Heben Sie beide Seiten der Brustwand an und stecken Sie sie fest, um den Herz-Lungen-Komplex freizulegen. Verwenden Sie eine Mikrozange mit runder Spitze, um den Thymus und das umgebende Fettgewebe herauszuschneiden, indem Sie sie vorsichtig von ihren Befestigungen abziehen und die Speiseröhre mit einer Mikroschere durchtrennen.

Trennen Sie die Venen brachiocephalica und die Arteria brachiocephalica mit einer scharfen Mikrozange. Trennen Sie dann die linke Arteria carotis communis und die linke Arteria subclavia vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern. Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine scharfe Mikrozange sowie eine Naht 9-0, um Stiche über dem Austritt der brachiozephalen Arteria communis und der linken Arteria subclavia zu platzieren. Verätzen Sie die brachiozephalen Venen.

Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band durchtrennen. Führen Sie einen 27-Gauge-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt, wobei Sie darauf achten, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht drei Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.

Schnitt der Maus auf Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule durchtrennt werden. Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und schieben Sie den Katheter bis zum Aortenbogen. Platzieren Sie mit einer Naht vier Stiche um die Aorta, beginnend 5 Millimeter unterhalb der Katheterspitze.

Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und untere Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 Minuten lang mit entionisiertem Wasser bei 200 Mikrolitern pro Minute durchbluten. Wechseln Sie dann das Perfusionsmittel auf 0,5 % DOC, verdünnt in entionisiertem Wasser und perfundierten über Nacht. Wechseln Sie am nächsten Tag das Perfusionsmittel auf 0,1 % SDS, verdünnt in entionisiertem Wasser und perfundierten für 8 Stunden. Dann 24 Stunden lang mit entionisiertem Wasser durchbluten, um das SDS und DOC wegzuspülen.

Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie die Ansätze am Thorax durchtrennen. Lagern Sie das Gewebe in einem sterilen Kryoröhrchen in entionisiertem Wasser mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,3 mikromolaren Natriumazid bei 4 Grad Celsius.