Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biologische Matrizen ganzer Organe aus der Lunge von Reus Maccas zu isolieren und diese Matrizen als Gerüste für die Untersuchung von Anwendungen im Bereich des Lungengewebe-Engineerings zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst ganze Reuss Maca-Lungen mit Detergenzien, Salzen und Enzymen dezellularisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die dezellularisierten Lungengerüste in einen Bioreaktor zu installieren, der sowohl die Atemwege belüften als auch das Lungengefäßsystem mit flüssigen Zellkulturmedien durchbluten kann.

Als nächstes werden die Lungengerüste mit Stammzellen über die Atemwege und Endothelzellen über das Lungengefäßsystem platziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen im Lungengerüst unter den vom Bioreaktor bereitgestellten Beatmungs- und Perfusionsbedingungen für die gewünschte Zeit zu kultivieren, gefolgt von der Analyse der resultierenden Zell- und Gewebemorphologie. Letztendlich führt die Reaktivierung von azellulären Maca-Lungengerüsten mit Stammzellen und Endothelzellen zu künstlich hergestelltem Gewebe, das die anatomischen und histologischen Merkmale von nativem Lungengewebe nachahmt.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Lungengewebes zu beantworten: Engineering-Bereiche, z. B. ob Stamm- oder Vorläuferzellen zur Regeneration von Lungengewebe verwendet werden können, entweder allein oder im Zusammenspiel mit reifen Lungenepithel- und Endothelzellen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Lungenerkrankungen im Endstadium, da die Aktivierung von azellulären Lungenmatrizen mit vom Patienten stammenden Stamm- oder Vorläuferzellen das Potenzial hat, die Anzahl der für eine Lungentransplantation verfügbaren Spenderlungen zu erhöhen. Darüber hinaus können die daraus resultierenden Lungen, die mit patienteneigenen Stammzellen hergestellt wurden, resistent gegen Immunabstoßung sein.

Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir uns ein zuvor veröffentlichtes Joe-Video von Mitgliedern des Labors von Dr. Laura Nicholson an der Yale University ansahen. Hier stellen wir Modifikationen ihres Verfahrens für Nagetiere vor, um den Bedürfnissen unseres Großtiermodells Resus Meac gerecht zu werden. Bei der Arbeit mit Maca-Geweben ist äußerste Sorgfalt geboten, um infektiöse Expositionsereignisse zu vermeiden.

Ziehen Sie vor dem Umgang mit nicht-menschlichem Primatengewebe persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich chirurgischer Maske, Gesichtsschutz, einer Schicht OP-Handschuhe, Einwegkittel und einer zweiten Schicht OP-Handschuhe, während die Lunge flach in einer Präparierschiene liegt, und kanülieren Sie die Lungenarterie mit einem weiblichen Köderkonnektor mit einem Widerhaken in geeigneter Größe. Befestigen Sie die Kanüle mit einem alkoholsterilisierten Kabelbinder. Schiebe einen Plastikkabelbinder um die Luftröhre.

Führen Sie eine weibliche Köderverbindung in die Trachealöffnung ein und ziehen Sie den Kabelbinder um den Widerhaken des Verschlusses fest, um die Luftröhre um den Widerhaken herum an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie eingeschlossene Luft aus der Lunge, indem Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS einträufeln, die 30 Einheiten pro Milliliter Heparin und fünf Mikrogramm pro Milliliter Natriumnitropressseite enthält. Abgekürzte SNP ermöglichen es, dass die Lösung durch natürlichen Rückstoß ausgestoßen wird, bevor sie wiederholt wird.

Doppelte Installation nach der dritten Atemwegsinstallation mit der PBS Heparin SNP-Lösung. Verschließen Sie die Trachealköderkanüle mit einem Köderstopfen. Schneiden Sie die Spitze des Herzens ab und spülen Sie die inneren Ventrikel mit PBS Heparin SNP, um das restliche Blut zu entfernen, beide Vorhöfe zu zerreißen und die Drainage des Lungenkreislaufs nach der Perfusion zu erleichtern.

Befestigen Sie eine mit der PBS Heparin SNP-Lösung gefüllte 60-cm³-Spritze an der Lungenarterienkanüle und entfernen Sie vorsichtig den Kolben, damit die Flüssigkeit in das Gefäßsystem fließen kann. Entfernen Sie den Stopfen von der Trachealkanüle und lassen Sie die Flüssigkeit in den Atemwegen durch natürlichen Rückstoß ausgestoßen werden. Setzen Sie die Perfusion fort, bis so viel Blut wie möglich aus dem Lungengefäßsystem entnommen wird.

Der schwierigste Aspekt des Verfahrens ist das effektive Spülen und Waschen der Lungenatemwege Bei Flüssigkeiten wird der Flüssigkeitsfluss im Vergleich zu Gasen gehemmt, da die Atemwege nicht dazu bestimmt sind, Flüssigkeiten zu leiten, Zeit und Patienten sind erforderlich, um diese Schritte durchzuführen, wir empfehlen, mit dem Protokoll fortzufahren, obwohl Restflüssigkeit in den Atemwegen verbleibt, wenn die Dezellularisierung fortschreitet und Zelltrümmer ausgespült werden. Die Viskosität der Flüssigkeit bleibt niedrig und die Lunge ist in der Lage, Flüssigkeiten vom ersten Tag an effizient auszuscheiden. Tauchen Sie den Herz-Lungen-Block in deionisiertes Wasser, blasen Sie die Lunge auf und perfundieren Sie sie mit deionisiertem Wasser mit 60-ml-Spritzen, die an der submersen Tracheal- bzw. Arterienkanüle befestigt sind. Wiederholen Sie effektiv die Atemwegs- und Gefäßspülungen mit entionisiertem Wasser.

Entfernen Sie vier weitere Male für insgesamt fünf Spülgänge von jeweils etwa 0,5 bis einem Liter nach fünf Wäschen die Lunge aus dem Wasser und tauchen Sie den Block in Triton-Lösung. Blasen Sie die Lunge auf und perfundieren Sie sie mit Triton-Lösung. Wiederholen Sie die Installation wie zuvor ein zweites Mal und inkubieren Sie die eingetauchten Organe über Nacht bei vier Grad Celsius in Triton-Lösung.

Nach einer Inkubation über Nacht den Lungenblock aus der Triton-Lösung entfernen und extern mit entionisiertem Wasser waschen. Tauchen Sie dann den Block in frisches, deionisiertes Wasser. Träufeln Sie das entionisierte Wasser fünfmal in die Luftröhre und die Lungenarterie, um die Triton-Lösung und die Zelltrümmer auszuwaschen.

Entfernen Sie die Lunge aus deionisiertem Wasser und tauchen Sie sie in 2%ige Natriumdesoxybeschichtung oder SDC-Lösung. Aufblasen und Perfusionieren mit der SDC-Lösung auf die gleiche Weise. Tauchen Sie die Lunge am dritten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in SDC-Lösung.

Waschen Sie das Tuch erneut von außen und fünfmal durch die Atemwege und Gefäße mit entionisiertem Wasser. Entfernen Sie wie zuvor das Gewebe aus dem entionisierten Wasser und tauchen Sie es in die eine molare Natriumchloridlösung. Blasen Sie das Gewebe wie zuvor auf und perfundieren Sie es mit Natriumchloridlösung und tauchen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Natriumchloridlösung, nachdem Sie die Lungen mit fünf Spülgängen mit entionisiertem Wasser von Natriumchloridlösung gereinigt haben.

Baden Sie sie wie zuvor in frischer DNA-Lösung und träufeln Sie diese Lösung in die Atemwege und Gefäße. Inkubieren Sie die Lunge eine Stunde lang bei Raumtemperatur in DNA-Lösung. Entfernen Sie dann die Lunge aus der DNA-Lösung und waschen Sie sie extern mit PBS-Lösung.

Tauchen Sie die Lunge in PBS-Lösung und waschen Sie diese Lösung fünfmal durch die Atemwege und Gefäße. Lagern Sie die Lunge wie bisher in PBS-Lösung in einem verschlossenen Behälter über Nacht bei vier Grad Celsius am vierten Tag. Waschen Sie die Lunge fünfmal in frischer, eiskalter PBS-Lösung durch die Atemwege und das Gefäßsystem.

Bewahren Sie sie dann bis zur Verwendung in PBS-Lösung in einem sterilen, verschlossenen Behälter bei vier Grad Celsius auf. Montieren Sie die Komponenten des Bioreaktors unter einer Laminar-Flow-Haube gemäß dem Schema. Füllen Sie im Textprotokoll die Hauptkammer mit Kulturmedium, das unmittelbar vor der Verwendung im Bioreaktor auf die 5%CO2-Atmosphäre eines Zellkulturinkubators äquilibriert wurde, und legen Sie die Tracheal- und Gefäßkanülenadapter auf die Lungenkanüle.

Installieren Sie die Organe in der Hauptkammer des Bioreaktors, indem Sie die Lunge im Nährmedium baden und die Kanülenadapter an den entsprechenden Anschlüssen im modifizierten Deckel anbringen. Befestigen Sie den Deckel nach dem Anschließen sicher und fest. Die Kammer wird für die Dauer der Sättigung nicht wieder geöffnet: Saugen Sie Luft aus dem Schlauch an, indem Sie die Spritzenöffnungen und eine 60-CCC-Spritze verwenden, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die die Richtungsabhängigkeit der Dreiwege-Absperrhähne bewegt, um den Flüssigkeitsfluss in die Spritze zu leiten.

Bringen Sie die versiegelten, zusammenhängend verbundenen Bioreaktorkammern mit den installierten Organen in einen Gewebekultur-Inkubator, um Temperatur und Gas auszugleichen. Beatmen Sie die Lunge mit einer Spritzenpumpe, die an der Hauptkammer befestigt ist, mit etwa einem vollen Atemzug alle zwei Minuten, und perfundieren Sie das Gefäßsystem über die Peristaltikpumpe mit etwa 10 Millilitern pro Minute für insgesamt 30 Minuten für die Sitzgelegenheit der Atemwege. Blasen Sie die Lunge mit der Zellsuspension auf, indem Sie sie vorsichtig durch den Spritzenanschluss injizieren, der an dem Drei-Wege-Stopphahn in der Atemschlaufe befestigt ist.

Halten Sie die Lunge statisch bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 über Nacht ohne Atemwege oder Gefäßperfusion, damit sich die Zellen an die dezellularisierte Lungenmatrix anheften können. Nach der Inkubation über Nacht wird das Standard-Atemwegsbeatmungsprogramm wieder aufgenommen und die Organe drei bis sieben Tage lang für die Gefäßsitzposition kultiviert. Die Richtungsabhängigkeit des Strömungswegs kann von der Hauptkammer zu einem endothelialen Sitzreservoir geändert werden, indem das Ventil an dem Absperrhahn, der in dem Schlauch positioniert ist, der diese beiden Kompartimente verbindet, die Endothelzellen allmählich mit der Peristaltikpumpe aussäen, während sie nach Beendigung der Aussaat unter Verwendung des magnetischen Rührwerks sanft gerührt werden.

Stampft die Perfusion und inkubiert statisch für etwa vier bis sechs Stunden. Die Gefäßperfusion mit dem Hauptkammermedium mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 Millilitern pro Minute wird wieder aufgenommen. Kultur für drei bis sieben Tage mit kontinuierlicher Gefäßperfusion gleichzeitig mit der Kulturperiode der Atemwegsbeatmung.

Während des gesamten Dezellularisierungsprozesses zeigten die MCCA-Lungen eine fortschreitende Aufhellung, die am Ende des Prozesses in einem durchscheinenden Aussehen gipfelte. Die Lungen behielten jedoch ihre groben anatomischen Merkmale bei und blieben weitgehend elastisch und in der Lage, nach dem Aufblasen mit Flüssigkeit einen natürlichen Rückstoß zu erzeugen. Auf mikroskopischer Ebene.

Die histologische Ultrastruktur blieb nach der Dezellularisierung intakt. Das sind bronchiale Atemwege, Bronchials, Alveolarsäcke. Blutgefäße und Kapillaren waren durch die Low-Power-Mikroskopie noch recht deutlich zu unterscheiden.

Die histologische Mikroanatomie zeigte jedoch, dass die grobe Anatomie und die Ultrastruktur der Lunge durch die Dezellularisierung zwar leicht gestört waren, das Gewebe jedoch vollständig keine intakten Zellen aufwies, wie hier zu sehen. Nur Spuren von DNA blieben in dezellularisierten Geweben zurück. Darüber hinaus bestand die Spuren-DNA, die durch Alkoholfällung konzentriert und in einem 0,8%igen AROS-Gel sichtbar gemacht wurde, hauptsächlich aus abgebauten Fragmenten mit niedrigem Molekulargewicht.

Die Wirksamkeit der zellulären Proteinentfernung wurde durch Western-Blot-Analysen sowohl von nativem als auch von dezellularisiertem Lungenprotein bewertet. Lysate mit einem Antikörper gegen Beta-Aktin, Beta-Aktin konnte in nativen Lungenlysaten leicht nachgewiesen werden, nicht jedoch in dezellularisierten Lungenlysaten, was darauf hindeutet, dass die Dezellularisierung Zellen dramatisch depletierte und zellassoziiertes Proteinmaterial 14 Tage nach der Aussaat der Atemwege mit mesenchymalen Stammzellen oder BMCs aus dem Maca-Knochenmark und Bioreaktorkulturen mit etwa einem Inspirations-Exspirationszyklus alle zwei Minuten entfernte. Das Parenchym der dezellularisierten Maca-Lunge wurde effektiv aktiviert.

BMCs kleideten die alveolären Septi aus, während sie ein klares und offenes Alveolallumen beibehielten. Die entblößte Matrix großer Atemwege wurde ebenfalls durch BMCs mit Hilfe des Bioreaktors isiert, die luminale Oberfläche eines Hauptstammbronchus wurde nach 14-tägiger Kultur mit einer Monoschicht aus Plattenepithelstoffen wie BMCs ausgekleidet. In dem hier gezeigten Bioreaktor befindet sich ein dezellularisierter Reus-Lungenlappen fünf Tage nach der Besiedlung des Gefäßsystems mit mikrovaskulären Endothelzellen und der Bereitstellung einer konstanten Gefäßperfusion mit Endothelkulturmedium bei fünf Millilitern pro Minute.

Die histologische Analyse ergab Zellen, die das kleine Gefäßsystem im Lungenparenchym auskleiden. In einigen Fällen schienen Zellen über mehrere zelluläre Projektionen über das Lumen an die Matrix gebunden zu sein, während andere Querschnitte von Gefäßen Zellen zeigten, die die Endotheloberfläche mit klarem Lumen auskleideten. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden wie Immunhistochemie, Western Blot und quantitative Echtzeit-PCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob sich die ausgesäten Stammzellen nach der Kultivierung auf der azellulären Lungenmatrix oder mit reifen Epithel- und Endothelzellen im Bioreaktor in pulmonale Zellen differenzieren. Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie man nicht-menschliche Primatenlungen dezellularisiert und anschließend die resultierenden azellulären Lungen als Gerüst für die Kultivierung von Stammzellen, Epithelzellen und Endothelzellen in einem Bioreaktorsystem verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit nicht-menschlichem Primatengewebe äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen vollständiger persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutzes und einer doppelten Schicht Latex- oder Nitrilhandschuhe, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.