Name: Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-15T20:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Dezellularisierung und Rezellularisierung von Reus Macca-Lungen mit einem spezialisierten Bioreaktor für die Geweberegeneration. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stammzellen in der Lungengewebetechnik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren danken den Herausgebern von Tissue Engineering für die Erlaubnis, Bilder aus einer früheren Veröffentlichung in diesem Bericht zu verwenden.

1. Dezellularisierung der Lunge von Ganzorganmakaken
<ol>
	<li>Vorbereitung von Lösungen
	<ol>
		<li>Autoklavieren Sie 10-15 L deionisiertes Wasser (dH2O) in 1-2 L Flaschen.</li>
		<li>"Triton-Lösung" (0,1 % Triton X-100 in dH2O) wird durch Mischen von 1 ml Triton X-100 in 999 ml dH2O unter Rühren unter Magnetrührer hergestellt. Die Lösung wird durch eine 0,22 μm Filtervorrichtung filtriert. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie die "SDC-Lösung" (2% SDC in dH2O) vor, indem Sie langsam 20 g Natriumdesoxycholat (SDC) zu ~900 ml dH2O unter Rühren hinzufügen. Sobald SDC aufgelöst ist, überführen Sie die Lösung in einen Messzylinder und bringen Sie das Volumen auf 1 ml mit dH2O. Die Lösung wird durch eine 0,22 μm Filtervorrichtung filtriert. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie die "NaCl-Lösung" vor, indem Sie 58 g NaCl zu ~900 ml dH2O hinzufügen und rühren, bis sie vollständig aufgelöst sind. dH2O zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen, filtrieren und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Orgel
	<ol>
		<li>Bei der Arbeit mit Makakengewebe ist äußerste Sorgfalt geboten, um infektiöse Expositionsereignisse zu vermeiden. Ziehen Sie die folgende persönliche Schutzausrüstung (PSA) an, bevor Sie mit Geweben von nichtmenschlichen Primaten umgehen: chirurgische Maske, Gesichtsschutz, OP-Handschuhe, Einwegkittel und eine zweite Schicht OP-Handschuhe.</li>
		<li>Entnahme von intakten Herz-Lungen-Blöcken aus tierischer Autopsie in PBS mit 50 U/ml Heparin, um die Gerinnung von äußerem Blut zu verhindern.</li>
		<li>Während die Lunge flach in einer Präparierschiene liegt, kanülieren Sie die Lungenarterie mit einer weiblichen Luer-Konnektorin mit einem Widerhaken in geeigneter Größe. Befestigen Sie die Kanüle mit einem alkoholsterilisierten Kabelbinder.</li>
		<li>Schieben Sie einen sterilen Kabelbinder um die Luftröhre, führen Sie eine 0,250-Zoll-Luer-Buchse in die Trachealöffnung ein und ziehen Sie den Kabelbinder um den Widerhaken des Verbindungsstücks fest, um die Luftröhre um den Widerhaken herum an Ort und Stelle zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie eingeschlossene Luft aus der Lunge, indem Sie PBS mit 30 U/ml Heparin und 5 μg/ml Natriumnitroprussid (SNP) instillieren. Lassen Sie die Lösung durch natürlichen Rückstoß ausstoßen und wiederholen Sie das Einträufeln noch zweimal. Nach der dritten Instillation verschließen Sie die tracheale Luer-Kanüle mit einem Luer-Plug, um die Lösung in der Lunge zu halten.</li>
		<li>Schneiden Sie die Herzspitze ab und spülen Sie die inneren Ventrikel mit PBS-Heparin-SNP, um das Restblut zu entfernen. Zerreißen Sie beide Vorhöfe, um die Drainage des Lungenkreislaufs bei der Perfusion zu erleichtern.</li>
		<li>Tauchen Sie den Herz-Lungen-Block in dH2O. Füllen Sie eine 60 ml Spritze mit der PBS-Heparin-SNP-Lösung. Tauchen Sie die arterielle Kanüle mit einer Pinzette ein, so dass alle Luftblasen aus der Gefäßöffnung entweichen. Setzen Sie die Spritze auf, entfernen Sie vorsichtig den Kolben und lassen Sie die Flüssigkeit in das Gefäßsystem fließen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Stopfen von der Trachealkanüle und lassen Sie die Flüssigkeit in den Atemwegen durch natürlichen Rückstoß ausgestoßen werden. Geben Sie weiterhin PBS-Heparin-SNP-Lösung in die Spritze, die mit der Gefäßkanüle verbunden ist, um einen Druck von ~15-20 cm H2O über der Arterie aufrechtzuerhalten. Setzen Sie die Perfusion fort, bis so viel Blut wie möglich aus dem Lungengefäßsystem entnommen wird.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dezellularisierung
	<ol>
		<li>Tag 1: Tauchen Sie den Herz-Lungen-Block in dH2O. Blasen Sie die Lunge mit dH2O auf und perfundieren Sie sie mit 60-ml-Spritzen, die an der subgetauchten Tracheal- bzw. Arterienkanüle befestigt sind. Wiederholen Sie die Atemwegs- und Gefäßspülungen mit dH2O 4x mehr für insgesamt fünf Spülungen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Lunge aus dem Wasser und tauchen Sie den Block in Triton-Lösung. Blasen Sie die Lunge auf und perfundieren Sie sie wie zuvor mit Triton-Lösung. Wiederholen Sie die Instillation ein zweites Mal und inkubieren Sie die untergetauchten Organe über Nacht bei 4 °C in Triton-Lösung.</li>
		<li>TAG 2: Nach der Inkubation über Nacht den Lungenblock aus der Triton-Lösung entfernen, extern mit dH2O waschen und dann den Block in frisches dH2O tauchen. Wiederholen Sie die 5-fache Wäsche mit dH2O wie in Schritt 1.3.1.</li>
		<li>Entfernen Sie die Lunge von dH2O und tauchen Sie sie in SDC-Lösung. Aufblasen und perfundieren Sie mit der SDC-Lösung auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.3.2. Über Nacht bei 4 °C in SDC-Lösung inkubieren.</li>
		<li>TAG 3: Waschen Sie das Tuch erneut mit dH2O wie in 1.3.1.</li>
		<li>Entfernen Sie das Gewebe von dH2O und tauchen Sie es in NaCl-Lösung. Aufblasen und Perfundieren mit NaCl-Lösung auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.3.2. Inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in NaCl-Lösung.</li>
		<li>Die Lunge wird wie in Schritt 1.3.1 mit dH2O von NaCl-Lösung gereinigt</li>.
		<li>Frische "DNase-Lösung" (30 μg/ml DNase, 1,3 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2 in dH2O) Bereiten Sie die Lunge in dieser Lösung vor und träufeln Sie sie wie in Schritt 1.3.2 in die Atemwege und Gefäße. Inkubieren Sie die Lunge 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in DNase-Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie frische "PBS-Lösung" vor (1x PBS + 5x Antibiotikum/Antimykotikum). Entfernen Sie die Lunge aus der DNase-Lösung und waschen Sie sie extern mit PBS-Lösung. Tauchen Sie die Lunge in PBS-Lösung und waschen Sie sie fünfmal mit dieser Lösung, wie in Schritt 1.3.1.</li>
		<li>Lagern Sie die Lunge in PBS-Lösung in einem verschlossenen Behälter über Nacht bei 4 °C. Am nächsten Tag (TAG 4) die Lunge wie in Schritt 1.3.1 fünfmal in frischer, eiskalter PBS-Lösung waschen und bis zur Verwendung in PBS-Lösung in einem sterilen, verschlossenen Behälter bei 4 °C lagern.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bioreaktor für große Organe
<ol>
	<li>Montage und Gewebeinstallation
	<ol>
		<li>Montieren Sie im Voraus Atemschlaufen- und Gefäßschlingenstrukturen sowie Adapter für Tracheal- und Gefäßkanülen (Abbildung 1). Mit Ausnahme von steril verpackten Luftfiltern und Spritzenanschlüssen können alle Komponenten des Bioreaktors autoklaviert werden.</li>
		<li>Montieren Sie die Bioreaktorkomponenten unter einer Laminar-Flow-Haube gemäß dem Schema in Abbildung 2. Füllen Sie die Hauptkammer mit Kulturmedium, das unmittelbar vor der Verwendung im Bioreaktor auf die 5 %CO 2 -Atmosphäre eines Zellkulturinkubators ausgeglichen wurde.</li>
		<li>Setzen Sie die Adapter für Tracheal- und Gefäßkanülen an den Lungenkanülen an und installieren Sie die Organe in der Hauptbioreaktorkammer, indem Sie die Lunge im Kulturmedium baden und die Kanülenadapter an den entsprechenden Anschlüssen im modifizierten Deckel anbringen. Befestigen Sie den Deckel nach dem Anschließen sicher und fest. Die Kammer wird für die Dauer der Rezellularisierung nicht wieder geöffnet.</li>
		<li>Füllen Sie das Trachealreservoir etwa zur Hälfte mit Nährmedium und setzen Sie die modifizierte Kappe auf.</li>
		<li>Sterile 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter, Luer-Stopfen und Spritzenanschlüsse wie angegeben auf alle Kammern aufbringen.</li>
		<li>Verbinden Sie das Luftröhrenreservoir über das Atemschlaufengerät mit der Hauptkammer. Befestigen Sie den Atemschlauch wie angegeben.</li>
		<li>Mit den Spritzenöffnungen und einer 60-ml-Spritze mit einer 18-G-Nadel wird Luft aus dem Schlauch angesaugt. Bewegen Sie die Richtungsrichtung der 3-Wege-Absperrhähne, um den Flüssigkeitsstrom in die Spritze zu leiten.</li>
		<li>Bringen Sie die versiegelten, zusammenhängend verbundenen Bioreaktorkammern mit den installierten Organen in einen Gewebekultur-Inkubator, um Temperatur und Gas auszugleichen. Beatmung der Lunge mit einer Spritzenpumpe, die an der Hauptkammer befestigt ist, mit ~1 vollem "Atemzug" alle 2 Minuten, und perfundiere das Gefäßsystem über die Peristaltikpumpe bei ca. 10 ml/min für insgesamt ~30 Minuten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aussaat der Atemwege
	<ol>
		<li>Bereiten Sie Suspensionen von Zellen vor, die mit der gewünschten Zelldichte in die Atemwege ausgesät werden sollen (das Volumen hängt von der Organgröße ab).</li>
		<li>Blasen Sie die Lunge mit der Zellsuspension auf, indem Sie sie vorsichtig durch den Spritzenanschluss injizieren, der an dem Dreiwegehahn in der Atemschlaufe befestigt ist.</li>
		<li>Halten Sie die Lunge über Nacht statisch bei 37 °C, 5 % CO2 ohne Atemwegs- oder Gefäßperfusion, damit sich die Zellen an die dezellularisierte Lungenmatrix anheften können.</li>
		<li>Nach der Inkubation über Nacht nehmen Sie das Standard-Atemwegsbeatmungsprogramm wieder auf und kultivieren die Organe für 3-7 Tage (oder eine andere gewünschte Dauer).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gefäß-Aussaat
	<ol>
		<li>Bereiten Sie Suspensionen von Endothelzellkulturen wie oben für die Aussaat von Atemwegszellen vor.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in das Endothel-Seeding-Reservoir, das einen kleinen magnetischen Rührstab enthält.</li>
		<li>Ändern Sie die Richtungsrichtung des Flusswegs von der Hauptkammer zum Endothelaussaatreservoir, indem Sie das Ventil an dem Absperrhahn drehen, der in dem Schlauch positioniert ist, der diese beiden Kompartimente verbindet, und säen Sie die Endothelzellen allmählich unter leichtem Rühren mit der Peristaltikpumpe aus.</li>
		<li>Wenn die Aussaat abgeschlossen ist (d. h. das Volumen der Endothelzellsuspension im Endothel-Seeding-Reservoir ist erschöpft), stoppen Sie die Perfusion und inkubieren Sie statisch für ~4-6 Stunden. Starten Sie die vaskuläre Perfusion mit dem Hauptkammermedium mit einer Geschwindigkeit von ~10 ml/min (oder dem gewünschten Druck, falls überwacht).</li>
		<li>Kultur für 3-7 Tage mit kontinuierlicher Gefäßperfusion</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fehlerbehebung und alternative Ansätze
<ol>
	<li>Trachealkanülierung: Anstelle eines Kabelbinders können Nähte verwendet werden, um die Luer-Kanüle an Ort und Stelle zu halten, wenn die Luftröhre zu klein ist. Ein 1/4 Zoll weiblicher Luer-Anschluss dient als ausreichende Kanüle für eine Vielzahl von Luftröhrendurchmessern.</li>
	<li>Blutentnahme durch Perfusion der Lungenarterien: Da Gewebe von Leichentieren entnommen wird, sind Mikrothromben häufig und verhindern, dass einige Bereiche des Lungenkapillarbetts vollständig von Blutresten befreit werden. Während der Dezellularisierung werden diese kleinen Gefäße jedoch durchlässig, und die Dezellularisierungsreagenzien lysieren und bauen diese Gerinnsel effizient ab. Die Prädezellularisierungsperfusion sollte durchgeführt werden, um so viel Blut wie möglich zu entfernen, aber es ist nicht notwendig, alle Blutspuren aus dem Parenchym zu entfernen.</li>
	<li>Ausstoß von Flüssigkeiten aus der Lunge: Makakenlungen behalten ex vivo einen starken natürlichen Rückstoß, selbst wenn sie mit Flüssigkeit aufgeblasen werden. Bei der Dezellularisierung werden die Zellen jedoch lysiert und setzen Materialien (einschließlich DNA) frei, die die Viskosität der eingeflößten Flüssigkeiten erhöhen und dadurch deren Ausscheidung erschweren. Eine Inkubation über Nacht bei 4 °C, während man in die eingeträufelte Flüssigkeit eingetaucht ist, reicht in der Regel aus, damit die Lunge die viskose Flüssigkeit vollständig ausstoßen kann. Alternativ können Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus der Lunge ausstoßen lassen und dann mit dem Einträufeln der nachfolgenden Lösungen fortfahren. Die Zugabe von Reinigungsmitteln und entionisiertem Wasser erleichtert in der Regel die Entfernung der viskosen Flüssigkeiten und ermöglicht einen effizienten Ablauf der Dezellularisierung.</li>
	<li>Zusatz von Antibiotika zu Waschmitteln: Antibiotika und Antimykotika können sowohl zu deionisierten Wasserwaschlösungen als auch zu Waschmittellösungen hinzugefügt werden; Penicillin/Streptomycin fällt jedoch in Gegenwart von Natriumdesoxycholat aus, und diese Ausfällungen können die Dezellularisierungs- und Waschprozesse beeinträchtigen. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Antibiotika/Antimykotika während der Dezellularisierung nicht erforderlich, da die in diesen Konzentrationen verwendeten Detergenzien in der Lage sind, Mikroben zu lysieren und abzutöten. Nach der Dezellularisierung ist das Spülen und Lagern mit PBS-Lösung (enthält 5x Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B) ausreichend, um die meisten Kontaminationen zu verhindern.</li>
	<li>Entfernung von Luft aus den Bioreaktorschläuchen: Die Luft wird effizient aus den Bioreaktorschläuchen mit einer Spritze angesaugt, wobei eine Nadel in die Nadelöffnungen in den Dreiwege-Absperrhähnen eingeführt wird. Alternativ kann 1x PBS oder Nährmedium durch den Schlauch gespült werden, bevor die Organe mit einer auf die gleiche Weise angebrachten Spritze installiert werden.</li>
	<li>Beatmung und Perfusion der Lunge während und nach der Rezellularisierung: Während die in diesem Bericht aufgeführten Flussraten und -zeiten sowohl für die Zelladhäsion als auch für die Beatmung der Atemwegsflüssigkeit und die Gefäßperfusion ausreichend waren, sollten diese Werte vom Anwender empirisch bestimmt werden. Die Kulturzeiten können auch auf der Grundlage der Wachstumsraten der eingeflößten Zellen angepasst werden.</li>
</ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+function+of+bioartificial+lungs+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats.</a> Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Joag, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+models+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Primate models of AIDS.</a> Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).</li>
<li>Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+models+for+AIDS+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Targets+Infect.+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-human primate models for AIDS vaccine research.</a> Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).</li>
<li>Borda, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunopathologic+alterations+in+rhesus+macaques+affected+with+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy.</a> Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).</li>
<li>Fabbrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+response+to+high-carbohydrate+and+low-carbohydrate+meals+in+a+non-human+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Lung+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Lung Engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+new+stretching+apparatus+and+the+effects+of+cyclic+strain+and+substratum+on+mouse+lung+epithelial-12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+embryonic+stem+cells+to+vascular+wall+cells+under+in+vitro+pulsatile+flow+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading.</a> J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells+from+the+bone+marrow+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.</a> Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).</li>
<li>Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+replication+of+ovine+lentivirus+in+endothelial+cells+cultured+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues.</a> Virology. 238, 316-326 (1006).</li>
<li>Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+diverse+tissues+exhibit+differences+in+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology.</a> Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Organ+Tissue+Engineering%3A+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Gewebe können effizient und effektiv durch eine Reihe von Verfahren dezellularisiert werden, bei denen physikalische, chemische und enzymatische Wirkstoffe zum Einsatz kommen12,20. Zu den Herausforderungen bei der Herstellung biologischer 3D-Matrizen aus großen Organen gehören der Bedarf an großen Mengen an Dezellularisierungslösungen, teure kommerzielle Geräte (z. B. Bioreaktoren) und eine schwindelerregende Menge an methodischen Störungen, die erforderlich sind, um das aus dem Gewebe gewonnene Endpr...

Bioengineering von Geweben und Organen ist eine attraktive Ergänzung zum Bereich der regenerativen Medizin. Die Schaffung von "im Labor gezüchteten" Organen, die für die Transplantation in Patienten geeignet sind, um die Funktionalität erkrankter Organe zu ersetzen, ist sehr wünschenswert, um den aktuellen und zukünftigen Bedarf an Transplantationen zu decken. Die Prinzipien des Tissue Engineering konzentrieren sich auf die Aussaat gewünschter Zelltypen oder Vorläufer davon in ein Gerüst, das die Form des manipulierten Gewebes unterstützt und gleichzeitig die geeigneten Wachstumsfaktoren und Kulturbedingungen liefert, die zur Nachahmung von Entwicklungs- oder Regenerationsprozessen erforderlich sind. Während synthetische Gerüste für das Tissue Engineering verwendet wurden, kann die natürliche extrazelluläre Matrix (EZM) die beste Quelle für organspezifische Gerüste für diesen Zweck sein. Die Dezellularisierung ganzer Organe ist ein Prozess, der die Entnahme von Zellen ermöglicht, während die chemischen und strukturellen Aspekte der nativen EZM intakt bleiben. Das resultierende azelluläre Matrixgerüst kann als Plattform verwendet werden, auf der regenerative Zellen in vitro ausgesät und kultiviert werden können 1,2.
Mehrere Nagetiermodelle der Lungendezellularisierung und anschließenden Rezellularisierung wurden entwickelt, um die Machbarkeit dieser Technologiezu untersuchen 3-6. Nagetiermodelle bieten zwar einen wesentlichen Proof-of-Concept, sind aber nicht direkt auf die klinischen Bedürfnisse des Menschen übertragbar. Eine kürzlich durchgeführte Studie wies darauf hin, dass genomische Reaktionen auf traumatische Verletzungen (und damit verbundene Entzündungen) zwischen Mäusen und Menschen nicht gut korrelieren; Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob es sinnvoll ist, Mäuse als Modelle für solch komplexe biochemische Prozesse beim Menschen zu verwenden7. Modelle für nichtmenschliche Primaten (NHP) bieten den Vorteil, dass sie der Biologie des Menschen auf genomischer, anatomischer und physiologischer Ebene sehr ähnlich sind und eine flexiblere Manipulation für eine bessere Extrapolation auf den Menschen ermöglichen. Der Rhesusaffe wurde in einer Vielzahl von präklinischen Anwendungen eingesetzt und ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Tissue Engineering8-11. Vor kurzem haben wir die erfolgreiche Dezellularisierung der Lunge von Rhesusaffen (Macacca mulatta) unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben, das minimale Auswirkungen auf die Lungen-ECMhat 12. Die Lungendezellularisierung wird erreicht, indem das Gewebe nacheinander mit vier Dezellularisierungslösungen behandelt wird, die aus Detergenzien, Salzen und Enzymen bestehen, und zwar mit intermittierendem Waschen mit deionisiertem Wasser (dH2O) und PBS. Wir haben dieses Verfahren optimiert, indem wir ein ursprünglich von Price et al. beschriebenes Protokoll modifiziert haben.4 Eine Vielzahl von histologischen und proteinanalytischen Techniken wurde verwendet, um die Bestandteile der resultierenden azellulären Matrizen im Vergleich zu einheimischen Makakenlungen zu charakterisieren.
In diesem Bericht demonstrieren wir ein detailliertes Protokoll für die Dezellularisierung von nichtmenschlichen Primatenlungen und die Rezellularisierung der resultierenden azellulären Lungengerüste in einem Großorgan-Bioreaktor, der ursprünglich von Calle et al. demonstriert wurde. 13 in JoVE. Durch die Änderung des ursprünglichen Protokolls, um den Anforderungen an Größe, Belüftung und Perfusion der Lungen von Großtieren gerecht zu werden, wurde die Technologie erfolgreich vom Nagetiermodell auf das Rhesusaffenmodell übertragen. Alle in diesem Bericht vorgestellten Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBC) durchgeführt, die am Tulane National Primate Research Center gelten. Die Demonstration dieser Technik ist unerlässlich, da die Identifizierung anatomischer Strukturen und die physische Manipulation größerer Organe manchmal schwierig ist, ohne die Schritte des Protokolls zu visualisieren. Die durch diese Methoden ermöglichten Studien bilden eine Grundlage für wesentliche präklinische Studien in dezellularisierten Rhesusaffen-Lungen, in denen die Rezellularisierung mit Rhesus-Stammzellen der mesenchymalen Linie und Rhesus-Mikrovaskulären Endothelzellen beurteilt werden kann. Unsere Version dieses Bioreaktors simuliert die Entwicklungsumgebung und wendet mechanische Dehnungs- und Dehnungskräfte in der Lunge von Großtieren an und ermöglicht die Untersuchung der Lungenrezellularisierung unter Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie die Lungen- und Endothelentwicklung erleichtern13-15.

<table><tbody><tr><td>Natriumnitroprussid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Fisher</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Fisher</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Pankreas-DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>Brühe vorbereiten, aliquotieren und einfrieren</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fisher</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (kein Ca/Mg)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisch</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Premium Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 100x</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (EKGS)</td><td>ScienCell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zellaussaat und Bioreaktorkultur</td></tr><tr><td>Rückschlagventile</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td></td></tr><tr><td>Y-Anschlüsse</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhähne</td><td>Harvard Apparate</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 14 Schlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 16 Schlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Luer 1/8 Zoll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Buchse 1/8 Zoll</td><td>Cole-Parmer</td><td>SI-45502-04</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Stecker</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsanschlüsse</td><td>Medi-Dose EPS</td><td>IV2004</td><td></td></tr><tr><td>Latexschlauch</td><td>St. Louis Medical Suppy</td><td>HN10910</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchschelle</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06832-02</td><td></td></tr><tr><td>2 L Weithalsglas</td><td>Fisher</td><td>05-719-276</td><td></td></tr><tr><td>60 ml</td><td>Spritzen Fisher</td><td>NC9035364</td><td></td></tr></tbody></table>

dezellularisierung und rezellularisierung der lunge nichtmenschlicher primaten mit einem spezialisierten großorgan-bioreaktor

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Es steht eine unzureichende Anzahl von Lungen zur Verfügung, um den aktuellen und zukünftigen Bedarf an Organtransplantationen zu decken. Die bioartifizielle Geweberegeneration ist eine attraktive Alternative zur klassischen Organtransplantation. Bei dieser Technologie wird die natürliche biologische extrazelluläre Matrix (ECM) eines Organs als Gerüst genutzt, auf das autologe Zellen oder Stamm-/Vorläuferzellen ausgesät und kultiviert werden können, so dass die Regeneration des ursprünglichen Gewebes erleichtert wird. Die natürliche EZM wird durch einen Prozess namens Dezellularisierung isoliert. Die Dezellularisierung wird durch die Behandlung von Geweben mit einer Reihe von Detergenzien, Salzen und Enzymen erreicht, um eine effektive Entfernung von Zellmaterial zu erreichen, während die EZM intakt bleibt. Studien, die unter Verwendung der Dezellularisierung und anschließenden Rezellularisierung von Nagetierlungen durchgeführt wurden, zeigten einen marginalen Erfolg bei der Erzeugung von lungenähnlichem Gewebe, das in vivo zum Gasaustausch fähig ist. Nagetiermodelle bieten zwar einen wesentlichen Proof-of-Concept, sind aber nicht direkt auf den menschlichen Gebrauch übertragbar. Nichtmenschliche Primaten (NHP) bieten ein geeigneteres Modell, um den Einsatz biokünstlicher Organproduktion für einen späteren klinischen Einsatz zu untersuchen.
Die Protokolle zur vollständigen Dezellularisierung der Lunge, die vom NHP-Rhesusaffen gewonnen wurde, werden vorgestellt. Die resultierende azelluläre Lunge kann mit einer Vielzahl von Zellen besiedelt werden, darunter mesenchymale Stammzellen und Endothelzellen. Das Manuskript beschreibt auch die Entwicklung eines Bioreaktorsystems, in dem zellgesäte Makakenlungen unter Bedingungen mechanischer Dehnung und Belastung durch Unterdruckbeatmung sowie pulsierende Perfusion durch das Gefäßsystem kultiviert werden können; Es ist bekannt, dass diese Kräfte die Differenzierung entlang der Lungen- bzw. Endothellinien steuern. Repräsentative Ergebnisse der Dezellularisierung und des Cell Seeding werden zur Verfügung gestellt.

Die unten gezeigten Ergebnisse stellen separate Experimente dar, bei denen entweder der Atemwegs- oder der Gefäßkompartiment mit aus Rhesusmakaken stammenden mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks oder mit aus Rhesuslunge stammenden mikrovaskulären Endothelzellen besiedelt wurde, die zuvor wie beschrieben isoliert und charakterisiert worden waren16-18.
Während des gesamten Dekellularisierungsprozesses zeigten die Makakenlungen eine fortschreitende Aufhellung, die in einem durchs...

Die Dezellularisierung ganzer Organe erzeugt natürliche biologische Gerüste, die für die regenerative Medizin verwendet werden können. Die Beschreibung eines nichtmenschlichen Primatenmodells der Lungenregeneration wird vorgestellt, in dem ganze Lungen dezellularisiert und dann mit adulten Stammzellen und Endothelzellen in einem Bioreaktor besiedelt werden, der die Gefäßzirkulation und die Beatmung von Flüssigmedien erleichtert.

Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biologische Matrizen ganzer Organe aus der Lunge von Reus Maccas zu isolieren und diese Matrizen als Gerüste für die Untersuchung von Anwendungen im Bereich des Lungengewebe-Engineerings zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst ganze Reuss Maca-Lungen mit Detergenzien, Salzen und Enzymen dezellularisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die dezellularisierten Lungengerüste in einen Bioreaktor zu installieren, der sowohl die Atemwege belüften als auch das Lungengefäßsystem mit flüssigen Zellkulturmedien durchbluten kann.Als nächstes werden die Lungengerüste mit Stammzellen über die Atemwege und Endothelzellen über das Lungengefäßsystem platziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen im Lungengerüst unter den vom Bioreaktor bereitgestellten Beatmungs- und Perfusionsbedingungen für die gewünschte Zeit zu kultivieren, gefolgt von der Analyse der resultierenden Zell- und Gewebemorphologie. Letztendlich führt die Reaktivierung von azellulären Maca-Lungengerüsten mit Stammzellen und Endothelzellen zu künstlich hergestelltem Gewebe, das die anatomischen und histologischen Merkmale von nativem Lungengewebe nachahmt.Di

nonhuman-primate-lung-decellularization-recellularization-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine dezellularisierte Lunge extrazellulären Matrix und neuartige biomimetische Bioreaktor verwendet werden, um funktionelle Lungengewebe erzeugen können entwickelt werden. Durch Aussaat Zellen in die Matrix und die Kultivierung im Bioreaktor, generieren wir Gewebe, das effektive Gasaustausch zeigt, wenn in vivo für kurze Zeit transplantiert.

Vorgehensweise für Lung Technik

Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Die rezellularisierte extrazelluläre Matrix einer dezellularisierten Rattenleber kann als humanisiertes, dreidimensionales ex vivo-Modell verwendet werden, um die Verteilung und Transgenexpression eines Virus oder viralen Vektors zu untersuchen.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung reproduzierbarer, kleinräumiger künstlicher Lungengewebe, indem dezellularisierte, präzisionsgeschnittene Lungenschnitte mit alveolären Epithel-Typ-2-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen neu besiedelt werden.

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.

Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von regional dezellularisiertem Lungengewebe vorgestellt. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Komplexitäten in der extrazellulären Matrix und Zell-Matrix-Interaktionen.

Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

In diesem Artikel wird beschrieben, wie biotechnologisch hergestellte Mauslungen mit Hilfe von Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsmethoden hergestellt werden können. Es wird auch die anschließende orthotope Lungentransplantation beschrieben.

Transplantation einer biotechnologisch hergestellten Lunge unter Verwendung von dezellularisierten Mauslungen und primären humanen Endothelzellen

Erfahren Sie die Dezellularisierung und Rezellularisierung von Reus Macca-Lungen mit einem spezialisierten Bioreaktor für die Geweberegeneration. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stammzellen in der Lungengewebetechnik.

Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

Weitere Videos entdecken