Quantifizierungsassay für bakterielle Infektionen: Eine Methode zur Quantifizierung der intraokularen bakteriellen Last im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Bakterielle Endophthalmitis ist eine entzündliche Augenerkrankung, die auftritt, wenn Bacillus cereus – ein pathogenes Bakterium – die intraokulare Region infiziert.

Um die bakterielle Infektion zu quantifizieren, legen Sie ein euthanasiertes Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis seitlich auf einen Operationstisch. Üben Sie leichten Druck unter dem Auge aus, um den Augapfel von der Augenhöhle zu lösen. Übertragen Sie den Augapfel in ein Röhrchen mit einem geeigneten Puffer, der mit einem Proteasehemmer-Cocktail ergänzt wird.

Homogenisieren Sie das Augengewebe, um es aufzulösen, wobei Bakterien in der Suspension freigesetzt werden. Die im Puffer vorhandenen Proteaseinhibitoren inaktivieren die freigesetzten zellulären Proteasen, um die Lebensfähigkeit der Bakterien aufrechtzuerhalten. Als nächstes verdünnen Sie die Bakteriensuspension seriell, um verschiedene Konzentrationen von Bacillus cereus zu erhalten.

Es wird eine abgewinkelte Kulturplatte mit dem angereicherten Agarmedium entnommen und die Reihen entsprechend der einzelnen Verdünnungskonzentration abgegrenzt. Geben Sie einige Tropfen der Bakteriensuspension auf den oberen Rand der dafür vorgesehenen Reihe und lassen Sie sie bis zum Ende der Platte nach unten fließen, um die gleichmäßige Ausbreitung der Bakterien zu unterstützen. Den Teller flach drücken und inkubieren.

Während der Inkubation nutzt jedes Bakterium die Nährstoffe aus dem Agar, um sich zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Die Anzahl der Kolonien nimmt ab, was einer Zunahme der Verdünnung der Bakteriensuspension entspricht. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien in einer bestimmten Reihe, um die okuläre Bakterienlast zu quantifizieren.

Geben Sie am geeigneten experimentellen Endpunkt 400 Mikroliter PBS, ergänzt mit Proteaseinhibitor, in ein beschriftetes autoklaviertes Entnahmeröhrchen pro Auge auf Eis und platzieren Sie eine offene, feine Pinzette auf beiden Seiten des infizierten Auges. Schiebe die Spitzen nach unten in Richtung Kopf, um das Auge zu stützen.

Sobald sich die Zange hinter dem Augapfel befindet, drücke die Zange zusammen und ziehe die Pinzette vom Kopf weg, um den Augapfel zu lösen. Setze dann den Augapfel sofort in das entsprechend beschriftete Entnahmeröhrchen ein. Legen Sie innerhalb von 60 Minuten nach der Probenentnahme die geschlossenen Entnahmeröhrchen in einen Gewebehomogenisator und homogenisieren Sie die Proben für zwei einminütige Homogenisierungsperioden mit einer 30-sekündigen Ruhephase dazwischen.

Nach der Homogenisierung legen Sie die Proben auf Eis und verdünnen die Proben mit 20-Mikroliter-Aliquoten des Homogenats seriell in 180 Mikrolitern PBS pro Verdünnung, bis ein Faktor von 1 mal 10 bis -8 erreicht ist. Beschriften Sie als Nächstes jede Reihe einer quadratischen, vorgewärmten BHI-Platte mit der entsprechenden Verdünnungskonzentration und fügen Sie mit der in einem 45-Grad-Winkel geneigten Platte 10 Mikroliter jeder Verdünnung in einzelne Reihen oben auf der Platte hinzu. Lassen Sie jede Probe laufen, bis sie fast den Boden der Platte erreicht, bevor Sie die Platte flach hinlegen. Wenn die Proben in den Agar aufgenommen wurden, geben Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Die Bienenvölker sollten nach achtstündiger Inkubation sichtbar sein.

Für eine genaue Darstellung der Konzentration in der Probe zählen Sie die Reihe mit 10 bis 100 Kolonien.