Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, dualmodale Nanosensoren zu entwerfen und herzustellen, die in der Lage sind, bakterielle Kontaminanten wie E.coli O157:H7 nachzuweisen. Magneto-fluoreszierende Nanosensoren werden durch die Funktionalisierung von Eisenoxid-Nanopartikeln über ein zweistufiges Verfahren synthetisiert. Zunächst werden gezielt Antikörper an die Oberfläche des Nanopartikels konjugiert.

Anschließend wird ein fluoreszierender Farbstoff in seine Codierung eingeladen. Die Kombination dieser Modalitäten ermöglicht einen schnellen und empfindlichen Nachweis bakterieller Kontaminationen sowohl in verdünnten als auch in hochkonzentrierten Lösungen. Bei geringer Menge an Bakterien sammeln sich die Nanosensoren aufgrund der gezielten Bindung der konjugierten Antikörper um die Bakterien herum.

Dieses Schwärmen verändert die Wechselwirkungen zwischen dem magnetischen Kern der Nanosensoren und den umgebenden Wasserprotonen, wodurch eine empfindliche Detektion von Änderungen der magnetischen Relaxationswerte ermöglicht wird. Wenn die Konzentration bakterieller Kontaminationen in Lösungen zunimmt, nimmt das Schwärmen ab und die Fähigkeit des magnetischen Verfahrens, die Kontamination zu quantifizieren, wird verringert. Allerdings nimmt mit steigender bakterieller Konzentration auch die Fluoreszenzemission der Bio-Nanosensoren zu.

Aus diesem Grund ist die Kombination magnetischer und fluoreszenter Modalitäten wichtig. Die Kombination ermöglichte die Detektion von lediglich einer koloniebildenden Einheit von E.coli O157:H7 innerhalb weniger Minuten. Der erste Schritt bei der Synthese magneto-fluoreszierender Nanosensoren ist die Herstellung einer Eisensalzlösung, die sowohl ferroses als auch ferrisches Chlorid enthält.

Das Eisen verleiht den Nanosensoren einen magnetischen Kern, der deren Anpassungsfähigkeit an Magnetrelaxationsplattformen ermöglicht. Zusätzlich benötigte Lösungen sind Polyacrylsäure und Ammoniumhydroxid. Salzsäure wird der Eisensalzlösung zugesetzt, die anschließend unter Wirbeln zu der Ammoniumhydroxidlösung gegeben wird.

Schließlich wird die Polyacrylsäure-Lösung zugegeben, und das resultierende Gemisch wird für eine zusätzliche Stunde verwirbelt, während die Reaktion weiterläuft. Die resultierende Lösung wird zentrifugiert, um die größeren Moleküle auszufällen und Nanopartikel zu isolieren, die kleiner als 100 Nanometer sind. Anschließend wird die Lösung zur Reinigung über Nacht dialysiert.

Der nächste Schritt ist die Kopplung von gezielten Antikörpern an die Polyacrylsäure-Codierung der neu synthetisierten Eisenoxids-Nanopartikel. Erforderliche Materialien sind MES-Puffer, EDC, NHS und die ausgewählten Antikörper. Zunächst wird EDC der Nanopartikellösung zugesetzt, gefolgt von NHS und schließlich dem Antikörper.

Die Mischung wird anschließend drei Stunden lang auf einem Tischmischer belassen, während die Reaktion weiterläuft. Die Lösung wird mithilfe einer magnetischen Säule gereinigt. Die magnetisierte Säule bindet die Nanopartikel und lässt nur freischwimmende Antikörper durchtreten.

Anschließend wird die Säule mit PBS-Puffer gewaschen und die konjugierten Nanosensoren gewonnen. Die Nanopartikel sind danach bereit für die Zugabe eines fluoreszierenden Farbstoffs, der die zweite entscheidende Detektionsmodalität bereitstellt. Eines der wichtigsten Merkmale unseres Nanosensors ist die Kombination der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten, was aus mehreren Gründen von Bedeutung ist.

Zunächst ermöglicht die Kombination der Modalitäten eine gegenseitige Überprüfung, wodurch das Risiko von Falsch-positiven und Falsch-negativen Ergebnissen erheblich verringert wird – eine der größten Herausforderungen, mit denen verschiedene derzeit verwendete diagnostische Plattformen konfrontiert sind. Zweitens erweitert die Kombination der Modalitäten deutlich den Bereich, innerhalb dessen wir bakterielle Kontamination nicht nur nachweisen, sondern auch quantifizieren können. Der letzte Schritt bei der Herstellung der Nanosensoren ist die Einschließung eines fluoreszierenden Farbstoffs in die Kodierung des Nanopartikels.

Dies wird einfach erreicht, indem Farbstoff zur Lösung gegeben und vortexiert wird, gefolgt von einer zusätzlichen Zeit, damit der Farbstoff in die Kodierung des Nanosensors eindiffundieren kann. Die vollständig funktionalisierten Nanosensoren werden anschließend ein letztes Mal dialysiert, um sie zu reinigen. Zur Charakterisierung der Nanosensoren werden Größe und Fluoreszenzemission mittels eines Zetasizers und eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts aufgezeichnet.

Eine kleine Probe des Nanosensors wird einer wässrigen Lösung im Küvette hinzugefügt und zur Aufnahme der Größe in den Zetasizer eingebracht. Für die Fluoreszenzanalyse wird eine Probe des Nanosensors auf eine 96-Well-Platte gegeben und in den Fluoreszenz-Plattenleser eingesetzt. Im Idealfall haben die Nanosensoren einen Durchmesser von etwa 70 Nanometern und zeigen eine Fluoreszenzemission bei 575 Nanometern.

Neben der Synthese der Nanosensoren ist das Kultivieren von Bakterien notwendig, um bakterielle Zielstrukturen im Labor bereitzustellen. Eine Glycerin-Stammlösung von Bakterien wird verwendet, um eine Kultur in Nährbouillon herzustellen. Diese Lösung wird anschließend zur Inkubation freigegeben.

Nach der anfänglichen Inkubationszeit werden serielle Verdünnungen durchgeführt, um eine breite Palette bakterieller Konzentrationen zu erreichen. Je hundert Mikroliter jeder Konzentration werden auf eine Nähragarplatte aufgebracht und anschließend 24 Stunden lang inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die Kolonien auf jeder Platte gezählt, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, also die CFU-Zahl pro Milliliter jeder verdünnten Stammlösung, zu bestimmen.

Nachdem die bakteriellen Stammlösungen hergestellt wurden, können sie nun gemeinsam mit den vorbereiteten Nanosensoren verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt dieses bestimmten Serotyps der Bakterien, der ihn von anderen Serotypen unterscheidet, ist der, dass man bei einer Infektion mit anderen Serotypen viele koloniebildende Einheiten benötigt, um eine Infektion zu bekommen. Bei diesem speziellen E. coli hingegen reichen bereits 10 bis 100 KBE (koloniebildende Einheiten) aus, um eine Infektion zu verursachen.

Unsere Technologie ist derart etabliert, dass selbst eine einzige koloniebildende bakterielle Kontamination nicht übersehen wird. Um Lösungen für die Messung im magnetischen Relaxometer vorzubereiten, werden zunächst 300 Mikroliter PBS in ein Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Anschließend wird eine Probe der Bakterienstammlösung zugegeben, gefolgt vom Zusatz der Nanosensoren.

Die Lösung wird anschließend in ein Glasrohr überführt, und ein Stück Parafilm wird zur Verhinderung von Verdunstung darauf platziert. Das Glasrohr wird dann in ein größeres NMR-Röhrchen eingesetzt und in den magnetischen Relaxometer gegeben. Eine Referenzlösung, die keine Bakterien enthält, sondern lediglich Nanosensor und PBS, wird verwendet, um einen Basiswert für T2 zu erhalten, wie dargestellt.

Anschließend werden Lösungen mit unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen in den magnetischen Relaxometer zur Analyse eingebracht, und die Änderungen der T2-Werte resultieren aus der Bindung zwischen den Nanosensoren und den Bakterien. Wie gezeigt, kann die Anwesenheit von nur einer einzigen bakteriellen KBE innerhalb weniger Minuten mit dieser Methode nachgewiesen werden. Allerdings werden die MR-Messwerte mit steigender Bakterienkonzentration weniger quantifizierbar, weshalb die Verwendung fluoreszenter Transmissionsdaten ebenso entscheidend für eine genaue Quantifizierung der Bakterien ist.

Bevor die Fluoreszenzdaten erfasst werden können, muss die Probe zunächst zentrifugiert werden. Die Lösung wird aus dem Glasröhrchen in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und anschließend zentrifugiert. Dadurch werden die Bakterien und die daran gebundenen Nanosensoren von frei in Lösung schwimmenden Nanosensoren getrennt.

Das Überstand wird verworfen, und das bakterielle Pellet wird in PBS resuspendiert. Abschließend kann die Probe mittels Fluoreszenzemission analysiert werden. Die Stärke der Emission steht in Beziehung zur Menge an Nanosensoren, die in Lösung verbleiben, und damit auch zur Menge an vorhandenen Bakterien.

Wie zu sehen ist, verstärkt sich die Fluoreszenzabgabe mit steigender Bakterienkonzentration, und gleichzeitig nimmt auch die Empfindlichkeit zu. Daher ermöglicht die Kombination beider magnetischer und fluoreszenter Modalitäten den Nachweis und die Quantifizierung bakterieller Kontamination in sowohl frühen als auch späten Entwicklungsstadien. Neben dem Nachweis von Bakterien in einfachen Lösungen wie PBS können diese Nanosensoren auch in komplexeren Medien wie Seewasser oder Milch funktionieren.

Außerdem wurden diese Nanosensoren hinsichtlich ihrer Spezifität in Gegenwart von Nicht-Ziel-Bakterien und hitzeinaktivierten Zielbakterien getestet. Wie gezeigt wurde, reagieren magneto-fluoreszierende Nanosensoren kaum bis gar nicht mit Nicht-Ziel- oder nicht lebenden Bakterien, was auf die Spezifität der konjugierten Antikörper zurückzuführen ist. Dies zeigt ihre Wirksamkeit bei der Detektion spezifischer Bakterien auch in Gegenwart anderer Arten.

Abschließend ist auch wichtig zu beachten, dass diese Nanosensoren leicht für den Nachweis anderer Krankheitserreger angepasst werden können. Sie können diese Nanosensoren, die wir in unserem Labor hergestellt haben, innerhalb eines Monats synthetisieren oder formulieren. Sie können dies innerhalb eines Monats tun, und dieser einmonatige Produktionsaufwand kann Ihnen eine zehnjährige Anwendung ermöglichen.