Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Das Hauptziel dieses Protokolls ist die Entwicklung und Synthese von dualmodalen Nanosensoren, die in der Lage sind, bakterielle Verunreinigungen wie E.coli O157:H7 zu erkennen. Magnetofluoreszierende Nanosensoren werden synthetisiert, indem Eisenoxid-Nanopartikel in einem zweistufigen Verfahren funktionalisiert werden. Zunächst werden Targeting-Antikörper an die Oberfläche des Nanopartikels konjugiert.

Dann wird Fluoreszenzfarbstoff in seine Codierung geladen. Die Kopplung dieser Modalitäten ermöglicht einen schnellen und empfindlichen Nachweis von bakteriellen Verunreinigungen sowohl in niedrig- als auch in hochkonzentrierten Lösungen. In Gegenwart einer kleinen Menge von Bakterien schwärmen die Nanosensoren um die Bakterien herum, da die konjugierten Antikörper gezielt eingesetzt werden.

Dieses Schwärmen verändert die Wechselwirkungen des magnetischen Kerns des Nanosensors mit den umgebenden Wasserprotonen, was eine empfindliche Detektion von Änderungen der magnetischen Relaxationswerte ermöglicht. Mit zunehmender Konzentration bakterieller Verunreinigungen in Lösungen nimmt das Schwärmen ab und die Fähigkeit der magnetischen Modalität, die Kontamination zu quantifizieren, wird verringert. Mit zunehmender Bakterienkonzentration steigt jedoch auch die Fluoreszenzabgabe der Bio-Nanosensoren.

Aus diesem Grund ist die Paarung von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten wichtig. Die Kombination ermöglichte den Nachweis von nur einer koloniebildenden Einheit von E.coli O157:H7 innerhalb von Minuten. Der erste Schritt in der Synthese von magnetofluoreszierenden Nanosensoren ist die Herstellung einer Eisensalzlösung, die sowohl aus Eisen- als auch aus Eisenchlorid besteht.

Das Eisen wird die Nanosensoren mit einem magnetischen Kern ausstatten, der ihre Anpassungsfähigkeit an magnetische Relaxationsplattformen ermöglicht. Als weitere Lösungen werden Polyacrylsäure und Ammoniumhydroxid benötigt. Salzsäure wird in die Eisensalzlösung eingebracht, die dann während des Vortexens zur Ammoniumhydroxidlösung gegeben wird.

Schließlich wird die Polyacrylsäurelösung zugegeben, und die resultierende Mischung wird eine weitere Stunde lang vortext, während die Reaktion fortgesetzt wird. Die resultierende Lösung wird zentrifugiert, um die größeren Moleküle auszufällen und Nanopartikel zu isolieren, die kleiner als 100 Nanometer sind. Die Lösung wird dann über Nacht zur Reinigung dialysiert.

Der nächste Schritt ist die Konjugation von zielgerichteten Antikörpern gegen die Polyacrylsäure-Codierung der neu synthetisierten Eisensäure-Nanopartikel. Zu den benötigten Materialien gehören MES-Puffer, EDC, NHS und die ausgewählten Antikörper. Zuerst wird EDC zur Nanopartikellösung hinzugefügt, gefolgt von NHS und schließlich dem Antikörper.

Die Mischung wird dann drei Stunden lang auf einen Tischmixer gegeben, während die Reaktion fortgesetzt wird. Die Lösung wird mit einer magnetischen Säule gereinigt. Die magnetisierte Säule fängt die Nanopartikel ein, so dass nur frei schwebende Antikörper austreten können.

Anschließend wird die Säule mit PBS-Puffer gewaschen und die konjugierten Nanosensoren werden gesammelt. Die Nanopartikel sind dann bereit für die Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff, was die zweite Schlüsselmodalität für den Nachweis darstellt. Eines der wichtigsten Merkmale unseres Nanosensors ist die Kombination der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten, die aus mehreren Gründen wichtig ist.

Erstens ermöglicht die Kombination der Modalitäten, dass jede Modalität die andere gewissermaßen gegenprüft, was das Risiko von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen erheblich reduziert, was eine der größten Hürden für die verschiedenen heute verwendeten Diagnoseplattformen darstellt. Und zweitens erweitert die Kombination der Modalitäten den Bereich, in dem wir bakterielle Kontaminationen nicht nur nachweisen, sondern auch quantifizieren können, erheblich. Der letzte Schritt bei der Herstellung der Nanosensoren ist die Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs in die Codierung des Nanopartikels.

Dies wird einfach erreicht, indem der Lösung während des Vortexens Farbstoff zugesetzt wird und dem Farbstoff dann weitere Zeit gelassen wird, in die Codierung des Nanosensors zu diffundieren. Die voll funktionsfähigen Nanosensoren werden dann ein letztes Mal zur Aufreinigung dialysiert. Um die Nanosensoren zu charakterisieren, werden die Größe und die Fluoreszenzabgabe mit einem Zetasizer und einem Fluoreszenzplatten-Reader erfasst.

Eine kleine Probe des Nanosensors wird in eine Küvetten-Wasserlösung gegeben und zur Größenbestimmung in den Zetasizer gegeben. Für die Fluoreszenzanalyse wird eine Probe des Nanosensors auf eine 96-Well-Platte gelegt und in den Fluoreszenzplatten-Reader eingeführt. Im Idealfall haben die Nanosensoren einen Durchmesser von etwa 70 Nanometern und eine Fluoreszenzöffnung von 575 Nanometern.

Neben der Synthese der Nanosensoren ist die Kultivierung von Bakterien notwendig, um die bakteriellen Ziele im Labor bereitzustellen. Ein Glycerinvorrat von Bakterien wird verwendet, um eine Kultur in Nährbrühe herzustellen. Diese Lösung wird dann inkubiert.

Nach der ersten Inkubationszeit werden serielle Verdünnungen durchgeführt, um ein breites Spektrum an Bakterienkonzentrationen zu erreichen. Einhundert Mikroliter jeder Konzentration werden auf eine Nährstoffschneckenplatte aufgetragen und dann 24 Stunden lang inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die Kolonien auf jeder Platte gezählt, um die koloniebildende Einheit oder die KBE-Anzahl pro mil jedes verdünnten Stammes zu bestimmen.

Nachdem die bakteriellen Stammlösungen nun hergestellt wurden, können sie in Verbindung mit den präparierten Nanosensoren verwendet werden. Und ein wichtiger Aspekt dieses speziellen Serotyps der Bakterien, der ihn von anderen Serotypen unterscheidet, ist, dass man bei einer Infektion mit den anderen Serotypen viele koloniebildende Einheiten haben muss, um eine Infektion zu bekommen. Aber in diesem speziellen E.coli sind 10 bis 100 KBE oder koloniebildende Einheiten gut genug, um eine Infektion zu verursachen.

Unsere Technologie ist so etabliert, dass Sie keine einzige bakterielle Kontamination verpassen. Um Lösungen für die Ablesung im magnetischen Relaxometer vorzubereiten, werden zunächst 300 Mikroliter PBS in ein Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Dann wird eine Probe des Bakterienbestands hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von Nanosensoren.

Die Lösung wird dann in ein Glasröhrchen überführt, und ein Stück Parafilm wird darauf gelegt, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Glasröhre wird dann in eine größere NMR-Röhre gelegt und in das magnetische Relaxometer eingeführt. Eine Basislösung, die keine Bakterien und nur Nanosensoren und PBS enthält, wird verwendet, um einen T2-Ausgangswert zu erhalten, wie gezeigt.

Dann werden Lösungen, die verschiedene Bakterienkonzentrationen enthalten, zur Analyse in das magnetische Relaxometer gegeben, und die Änderungen der T2-Werte werden durch die Bindung zwischen den Nanosensoren und den Bakterien verursacht. Wie gezeigt, kann mit dieser Modalität das Vorhandensein von nur einer bakteriellen KBE innerhalb von Minuten nachgewiesen werden. Mit zunehmender Bakterienkonzentration sind die MR-Werte jedoch weniger quantifizierbar, weshalb die Verwendung von Fluoreszenzsubsmissionsdaten auch einer genauen bakteriellen Quantifizierung gleichkommt.

Bevor Fluoreszenzdaten erhoben werden können, muss die Probe zunächst zentrifugiert werden. Die Lösung wird aus dem Glasrohr in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und anschließend zentrifugiert. Dadurch werden die Bakterien und die daran gebundenen Nanosensoren von frei schwebenden Nanosensoren in Lösung getrennt.

Das Übergewicht wird verworfen und das Bakterienpellet wird in PBS resuspendiert. Schließlich kann die Probe mittels Fluoreszenzeinreichung analysiert werden. Die Stärke der Emission hängt von der Menge der in Lösung verbleibenden Nanosensoren und damit auch von der Menge der vorhandenen Bakterien ab.

Wie man sehen kann, nimmt die Fluoreszenzunterwerfung mit zunehmender Bakterienkonzentration zu und wird auch empfindlicher. Aus diesem Grund ermöglicht die Paarung von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten den Nachweis und die Quantifizierung bakterieller Kontamination sowohl in frühen als auch in späten Entwicklungsstadien. Neben dem Nachweis von Bakterien in einfachen Lösungen wie PBS besitzen diese Nanosensoren auch die Fähigkeit, in komplexeren Medien wie Seewasser oder Milch zu funktionieren.

Darüber hinaus wurden diese Nanosensoren auf ihre Spezifität in Gegenwart von Nichtzielbakterien und hitzeinaktivierten Zielbakterien getestet. Wie gezeigt, reagieren magnetofluoreszierende Nanosensoren aufgrund der Spezifität der konjugierten Antikörper wenig bis gar nicht mit nicht zielgerichteten oder nicht lebenden Bakterien. Dies zeigt ihre Wirksamkeit beim Nachweis bestimmter Bakterien in Gegenwart anderer Spezies.

Schließlich ist es auch wichtig zu beachten, dass diese Nanosensoren auch für den Nachweis anderer Krankheitserreger leicht angepasst werden können. Sie können diese Nanosensoren synthetisieren oder formulieren, was wir jetzt in unserem Labor innerhalb eines Monats gemacht haben. Sie können es innerhalb eines Monats tun, und dieser eine Monat Produkt kann Ihnen eine Anwendung von etwa 10 Jahren geben.