Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilm

Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von oberflächenhaftenden Bakterien, die in eine Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen, EPS, mikrobiellen Ursprungs eingebettet sind.

Um die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Biofilmen in vitro zu untersuchen, nehmen Sie einen Objektträger mit einem Kanal, der einen Biofilm von Staphylococcus aureus enthält – einem opportunistischen Krankheitserreger. Die gentechnisch veränderten Bakterien exprimieren ein fluoreszierendes Protein für den mikroskopischen Nachweis. Der Kanal ist mit Behältern verbunden, die mit Medien gefüllt sind, um die Bakterien mit Nährstoffen zu versorgen.

Fügen Sie eine Suspension von Neutrophilen hinzu, die mit einem fluoreszierenden Zellverfolgungsfarbstoff markiert ist. Das Medium enthält auch ein Ethidium-Homodimer, das die DNA der abgestorbenen Zellen färbt. Unter physiologischen Bedingungen inkubieren.

Die Mustererkennungsrezeptoren auf Neutrophilen binden an die Erreger-assoziierten molekularen Muster auf den Bakterien. Die Bindung veranlasst Neutrophile, die Bakterien zu phagozytieren und extrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies oder ROSs zu produzieren, die die Bakterien abtöten.

Um der Immunantwort zu entgehen, setzen Bakterien entgiftende Enzyme frei, die das ROS und das Leukocidin-Toxin verringern, das den Zelltod verursacht. Monomeres Leukocidin bindet an spezifische Rezeptoren auf den Neutrophilen und durchläuft eine Multimerisierung, um eine Pore zu bilden, die die Integrität der Membran stört und die Zellen abtötet.

Das Ethidium-Homodimer dringt durch die geschädigte Zellmembran ein und färbt die abgestorbenen Zellen.

Unter einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop scheint eine Untergruppe von Bakterienzellen und Neutrophilen tot zu sein, was auf eine Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilm hinweist.

Verwenden Sie einen fluoreszierenden Stamm von S. aureus, wie z. B. USA300, der GFP exprimiert, um die Mikroskopie zu erleichtern. Inkubieren Sie Neutrophile mit 100 mikromolaren BCD für 30 Minuten in einer Wippe bei 37 Grad Celsius mit 5 % atmosphärischem Kohlendioxid. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln inkubiert werden, und begrenzen Sie die Lichteinwirkung.

Um überschüssiges BCD zu waschen, zentrifugieren Sie die Neutrophilen fünf Minuten lang bei 270 RCF und aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Neutrophilen in frischem HBSS. Fügen Sie dann den BCD-gefärbten Neutrophilen Ethidium-Homodimer-1 in einer Endkonzentration von 4 Mikromolaren hinzu, um den Tod von Neutrophilen und Bakterien zu überwachen.

Waschen Sie den Biofilm mit HBSS und fügen Sie 150 Mikroliter Neutrophile zu dem S. aureus-Biofilm hinzu, der in Mikroobjektträgern gezüchtet wurde. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer. Die Anzahl der Bakterienzellen basiert auf den Zellzahlen, die aus der 18-Stunden-Biofilmbeschichtung gewonnen werden.

Abbildung der Wechselwirkung des neutrophilen Biofilms mit Hilfe von Fluoreszenzkanälen, die den Fluoreszenzfarbstoffen oder den Anregungs- und Emissionswellenlängen der Proteine entsprechen.