Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vivo humanes Gefäßnetzwerk zu generieren. Dies wird erreicht, indem zunächst aus menschlichem Blut gewonnene endotheliale koloniebildende Zellen und mesenchymale Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark kultiviert werden. Beide Zelltypen werden dann zu einem kollagenbasierten Gel vermischt, das subkutan in eine immundefiziente Maus injiziert wird.

Sieben Tage später wird das Implantat entnommen und auf die Bildung eines menschlichen Gefäßnetzwerks untersucht. Letztendlich kann das Vorhandensein von humanspezifischen Mikrogefäßen in den Implantaten durch seine Histologie und Immunhistochemie verifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber einer sauren Methode wie der chirurgischen Implantation des Konstrukts ist LED, sie ist einfach und leicht durchzuführen und erfordert keine Operation.

Beginnen Sie mit dem Auftauen einer Durchstechflasche mit E-FCKW und verdünnen Sie die Zellen sofort in einem konischen 15-Milliliter-Molekül mit 10 Millilitern DMEM. Schleudern Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 1200 U/min herunter und suspendieren Sie das Zellpellet mit Resus in 10 Millilitern warmem EGM zwei Medium. Übertragen Sie dann die Zellen auf eine 100 Millimeter große Gewebekulturplatte, die mit 1%iger Gelatine beschichtet ist, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator.

Saugen Sie am nächsten Morgen das Medium und alle ungebundenen Zellen vorsichtig ab. Füttern Sie dann die gebundenen Zellen mit 10 Millilitern frischem E GM zwei Medium. Setzen Sie diesen Vorgang in den nächsten Tagen fort, bis sich eine konfluente Monoschicht gebildet hat.

Waschen Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter Trips in EDTA und stellen Sie die Platte für fünf Minuten wieder in den Inkubator. Nach fünf Minuten unter dem Mikroskop klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und prüfen Sie, ob sich die Zellen abgelöst haben.

Wenn nicht, wiederholen Sie die kurzen Inkubationen mit leichtem Schaukeln. Sobald sich die Zellen vollständig abgelöst haben, geben Sie acht Milliliter EGM zwei Medium zu den Zellen und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Medium. Zählen Sie die Zellen und drehen Sie sie fünf Minuten lang mit 1200 U/min herunter.

Plattieren Sie nun die Zellen auf Gewebekulturplatten, die mit 1%Gelatine beschichtet sind, bei einer Sitzdichte von 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter. In EGM two medium inkubieren Sie die Zellen und füttern sie alle zwei bis drei Tage mit EGM two medium. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die folgenden Passagen zwischen den Passagen vier und acht.

Die E-FCKW werden einsatzbereit sein. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um MSCs heranwachsen zu lassen. Ersetzen Sie einfach E GM two medium durch M-S-C-G-M medium.

Verwenden Sie eine unbeschichtete Kulturplatte. Beginnen Sie die Subkultur bei 80 % Konfluenz und die Subkultur bei einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Für dieses Experiment werden 800.000 E-FCKW und 1.200.000 MSCs pro Implantat benötigt.

In der Regel werden fünf Implantate gleichzeitig präpariert. Um zu beginnen, aspirieren Sie ein Zellmedium von den Kulturplatten und waschen Sie jede Zellplatte mit 10 Millilitern PBS. Ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie die Platten unter leichtem Schaukeln.

Kontrollieren Sie die Zellen alle zwei bis fünf Minuten unter dem Mikroskop, bis sich alle Zellen abgelöst haben. Fügen Sie dann acht Milliliter DMEM hinzu und sammeln Sie die Zelllösung. Zählen Sie in einem 15-Milliliter-Konus die Zellen und übertragen Sie genügend Zellen für fünf Implantate in einen einzigen 15-Milliliter-Konus.

Schleudern Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 1200 U/min herunter und entfernen Sie das Snat. Bereiten Sie vorsichtig eine Mischung aus Fibrinogen und Kollagenfibronektin auf Eis vor. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet ganz vorsichtig in der eiskalten Mischung.

Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, laden Sie die Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine verschlossene 26-Gauge-Nadel. Halten Sie die geladene Spritze auf Eis, bis die Zellmischung injiziert wird. Betäubte vier sechs Wochen alte athyme nackte immundefiziente Mäuse mit einer ISO-Fluorkammer.

Sobald die Mäuse betäubt sind und nicht mehr auf Zehenkneifen reagieren, fahren Sie mit den Injektionen für jede Maus fort. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um 50 Mikroliter Thrombinlösungen subkutan in den oberen dorsalen Bereich zu injizieren. Injizieren Sie an der gleichen Stelle 200 Mikroliter der Zellmischung.

Mit einer 26-Gauge-Nadel gelieren die injizierten Makromoleküle und bilden eine kleine, aber spürbare Beule unter der Haut. Legen Sie die Mäuse nach der Injektion auf eine Schicht Gaze, um Komfort und Wärme zu gewährleisten. Beobachten Sie sie, bis sie gehfähig werden.

Beobachten Sie in den nächsten drei Tagen täglich den allgemeinen Gesundheitszustand des Tieres. Eine Woche nach den Injektionen euthanasieren Sie die Mäuse mit Kohlendioxid und entfernen Sie chirurgisch den Gelpfropfen. Nach der Entnahme fotografieren Sie die Gelplugs neben einem Lineal, legen Sie dann jeden Gelplug in eine histologische Kassette und tauchen Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur in eine 10%ige neutrale gepufferte Form.

Waschen Sie am nächsten Tag die 10%ige neutrale gepufferte Form mit destilliertem Wasser ab. Lagern Sie die Kassetten in PBS bei vier Grad Celsius, bis sie für die histologische Bewertung ausgewertet werden. Machen Sie sieben Mikrometer-Abschnitte des Implantats, die in Paraffin eingebettet sind.

Quantifizieren Sie dann die Dichte der Mikrogefäße im mittleren Teil der Implantate. Mit Hilfe eines H- und e-Färbe-Scores wird die Anzahl der Gefäße pro Quadratmillimeter ermittelt, um die menschliche Natur der mikrovaskulären Gefäße zu demonstrieren. Die Schnitte werden mit einem handelsüblichen Anti-Human-CD-31-Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 100

Dieses Phasenkontrastbild zeigt die charakteristische Kopfsteinpflastermorphologie von Endothelzellen in einer typischen konfluenten Monoschicht aus aus Nabelschnurblut gewonnenen FCKW. Dieses Bild zeigt die typische spindelförmige Morphologie von MSCs aus dem menschlichen Knochenmark. Nach einer einwöchigen Inkubation im Mauswirt sah das Implantat, das durch eine gelb gestrichelte Linie markiert ist, bei höherer Vergrößerung ganz anders aus als das Gewebe des Wirts.

Es wurden mehrere Mikrogefäße freigelegt, deren luminale Strukturen rote Blutkörperchen enthalten und durch die gelben Pfeilspitzen hervorgehoben sind. Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Stopfen reagierte das Lumen der Mikrogefäße auf einen monoklonalen Antikörper gegen humanes CD 31. Die Zellkerne wurden mit Hämatin gegengefärbt.

Sobald Sie die Meisterschaft beherrschen, kann diese Technologie innerhalb einer Unze durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.