Name: Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung humaner mikrovaskulärer Netzwerke in immundefizienten Mäusen durch Injektion von ECFCs und MSCs in einem Kollagen/Fibronektin-Gel. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung humaner Zellintegration in vivo.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH K99EB009096-01A1 an JM-M unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Machen EGM-2 Medium (500 mL) <ul><li> Add 100 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 395 ml Endothelial Basal Medium (EBM-2). </li><li> 5 ml 100x Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung (GPS). </li><li> Fügen Sie alle EGM-2 SingleQuots Ergänzungen außer Hydrocortison (dh, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, Heparin, Ascorbinsäure, und GA-1000). </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen MSCGM Medium (500 mL) <ul><li> 5 ml 100x GPS bis 440 ml mesenchymalen Stammzellen Basal Medium (MSCBM). </li><li> Fügen Sie alle Inhalte der MSCGM SingleQuots Kit. </li><li> Add hFGF-B Aliquot von EGM-2 SingleQuots ergänzt. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen DMEM-Medium (500 mL) <ul><li> 50 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 440 ml 1x hohen Glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). </li><li> 5 ml 100x GPS. </li><li> 5 ml nicht essentielle Aminosäure-Lösung. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen Kollagen / Fibronektin-Lösung (3,6 mL; aus am selben Tag nach der Injektion) <ul><li> Fügen Sie 0,4 ml 10x DMEM auf 150 ul destilliertem H 2 O. </li><li> 100 l 1M HEPES (25 mM final). </li><li> Vorsichtig fügen 2,4 ml Rinder-Kollagen (5 mg / mL Lager 3 mg / mL endg.) und vorsichtig mischen auf dem Eis. </li><li> Stellen Sie den pH-Wert auf neutral durch Zugabe von 1N NaOH-Lösung (ca. 30 mL). </li><li> Verwenden Sie Phenolrot-Indikator auf einen neutralen pH bewerten; Alternative verwenden Sie pH-Testpapier auf pH-Monitor. </li><li> Add 120 ul humanem Fibronectin (1 mg / mL Lager 30 pg / mL endg.) </li><li> Fügen Sie 0,4 ml FBS (10% endg.) </li><li> halten Lösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ul></li><li> Machen Fibrinogen-Lösung (1 mL, machte am selben Tag nach der Injektion) <ul><li> Zugabe von 30 mg in Pulverform Fibrinogen zu 1 ml 0,9 N NaCl (pH 7,4)-Lösung (30 mg / mL endg.). </li><li> Vor dem Gebrauch inkubieren Fibrinogen-Lösung bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen, vor der Zugabe zu den Kollagen / Fibronektin Gel. </li></ul></li><li> Machen Thrombin-Lösung (200 mL) <ul><li> Add 1 KU von pulverförmigen Thrombin zu 200 ml 0,9% NaCl Kochsalzlösung (50 U / mL). </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Spritze Filter und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Vor dem Gebrauch verdünnt mit 0,9% NaCl normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 U / mL. </li></ul></li><li> Machen Sie 1% Gelatine-Lösung (500 mL) <ul><li> 5 g pulverisierte Gelatine 500 ml Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Bei 121 ° C für 30 min. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Coat 100-mm-Zellkulturplatten mit 1% Gelatine Beschichtungslösung <ul><li> Fügen Sie 10 ml 1% Gelatine-Lösung in jede 100-mm Gewebekulturplatte. </li><li> Die Platten bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Vor dem Gebrauch entfernen Sie die Gelatine-Lösung und waschen Sie die Platten einmal mit PBS. </li></ul></li></ol> 2. Kultur der Menschenrechte Cord Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) Blut-Derived Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen ECFC stehen im Labor vor diesem Experiment. ECFC können aus den mononukleären Zellfraktion entweder Nabelschnurblut oder Erwachsener peripheren Blut als vorher 7 beschrieben isoliert werden. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen ECFCs (typischerweise 0,5-1x10 6 Zellen in 1 ml des Einfrierens Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes EGM-2 Medium. </li><li> Fügen Sie die 10 ml ECFC Aufhängung in einer 1% Gelatine beschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisches EGM-2 Medium. </li><li> Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte durch eine konfluente Monolayer zellulären bedeckt ist. Bei Konfluenz Subkultur der Zellen wie folgt: </li><li> Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml EGM-2 Medium und sammeln Sie die Zelle Lösungenbindung an den 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. </li><li> Platte die Zellen in 1% Gelatine beschichtete Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen / cm 2 mit EGM-2 Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. </li></ol> Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. ECFCs wird zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 3. Kultur der Menschenrechte Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen des menschlichen MSC stehen im Labor vor diesem Experiment. MSC isoliert aus Knochenmark saugt wie bisher 11 beschrieben. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von MSCs (typischerweise 0.50-1x10 6 Zellen in 1 mL Einfrieren Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes MSCGM Medium. </li><li> Fügen Sie die 10 ml MSC Suspension in eine unbeschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisch MSCGM Medium. </li><li> Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte 80% konfluenten Zellen Monoschicht erreicht. Bei 80% Konfluenz, Subkultur der Zellen wie folgt: </li><li> Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml MSCGM Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. </li><li> Platte die Zellen in unbeschichteten Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit MSCGM Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. </li></ol> Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. MSCs werden zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 4. Resuspension der Zellen in Collagen / Fibronectin / Fibrinogen-Lösung (Tag 0) Vor dem Versuch, stellen Sie sicher, es gibt genug ECFCs und MSCs in Kultur; 0.8x10 6 ECFCs und 1.2x10 6 MSCs wird für jedes Implantat und Maus erforderlich. <ol><li> Saugen Sie sich das Medium der jede Kultur Platte und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml DMEM-Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der ECFCs und MSCs geerntet. </li><li> Transfer-4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 Zellen) und 6x10 6 PLM (5x 1.2x10 6 Zellen) in einem einzigen 50-mL konischen Rohr. Dies ist der Gesamtbetrag der Zellen für die fünf einzelnen Implantate und Mäuse benötigt. Zentrifugation bei 1200 rpm und Überstand. </li><li> Sanft, mit 100 uL der Fibrinogen-Lösung auf 0,9 ml Kollagen / Fibronektin-Lösung (3 mg / mL letzten Fibrinogenkonzentration); halten Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Zellpellet auf 1 mL eiskaltem Kollagen / Fibronektin / Fibrinogen-Lösung, mischen Sie die Zellen sehr vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Laden Sie die Mischung in eine 1-mL sterile Spritze, und legen Sie eine 26-Gauge-Nadel mit seiner Kappe auf der Spitze der Spritze. Halten Sie die geladene Spritze auf Eis, bis Injektion. </li></ol> 5. Die Injektion in Immundefiziente Nacktmaus (Tag 0) Alle Tierversuche werden mit 6-Wochen alten athymischer (nu / nu) Mäusen durchgeführt werden. <ol><li> Vor der Injektion, betäuben die immundefizienten Mäusen, indem sie sie in eine Gaskammer liefert Isofluran. Lassen Sie die Maus auf die Isofluran für ca. 2 Minuten inhalieren, bis sie betäubt und reagiert nicht mehr bis zu den Zehen Prise (Überwachung ihrer Herzschläge durch Inspektion) sind. </li><li> Für jede Maus injizieren 50 ul Thrombin-Lösung (10 U / ml) subkutan in den oberen dorsalen Bereich mit einem 26-Gauge-Nadel. </li><li in der gleichen stelle wo thrombin injiziert wurde zu injizieren ul zelle mischung unter verwendung eines collagen wird gel bei c und fibrinogen fibrin-gel gegenwart von bilden. als ergebnis sollte das implantat bilden eine kleine aber sp bump die haut.><li> Nach der Injektion statt der Mäuse auf einer Schicht aus Gaze für Komfort und Wärme und beobachten sie, bis sie ambulant zu werden. Dann nach, beobachten die Mäuse täglich für die ersten drei Tage. </li></ol> 6. Harvesting (Tag 7) <ol><li> Eine Woche nach der Injektion, euthanize die Mäuse, indem sie sie in eine Gaskammer liefert komprimierte CO 2-Gas. </li><li> Sobald eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektions-und chirurgisch zu entfernen das Gel-Stecker. Digitale Fotos der abgerufenen Gel-Stecker mit einer Skala wird empfohlen. </li><li> Legen Sie die geernteten Gel Stecker in histologischen Kassette und tief sie in 10% neutral gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie die 10% neutral gepuffertem Formalin weg mit destilliertem H 2 O und Ort der histologischen Kassetten bei 4 ° C in PBS bis histologische Beurteilung. </li></ol> 7. Evaluation: Histologie (H &amp; E) und Immunhistochemie (hCD31) <ol><li> Zur histologischen Auswertung werden die Implantate in Paraffin und geschnitten (7 Mikrometer dicke Abschnitte) mit Standard-histologische Verfahren eingebettet. </li><li> Quantify microvessel Dichte durch Auswertung von Hämatoxilin und Eosin (H &amp; E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der Implantate übernommen. Standard-Protokolle für die H &amp; E Färbung kann an anderer Stelle gefunden werden. Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. Bericht Mikrogefäßen Dichte wie die durchschnittliche Zahl der roten Blutkörperchen gefüllten Mikrogefäßen aus den Bereichen analysiert und Gefäße / mm 2 angegeben. </li><li> Zur Demonstration der menschlichen Natur der mikrovaskulären Gefäße, Abschnitte der abgerufenen Implantat sollte immunhistochemisch mit einem human-spezifischen CD31 (hCD31) Antikörper unter Verwendung von Standard Färbeprotokollen gefärbt werden. Wir empfehlen die Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31-Antikörper aus DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) in einer 1:100-Verdünnung. Der menschliche Spezifität dieses Antikörpers wurde durch die negative Reaktion mit einer Vielfalt von Maus Gewebeschnitten, die in parallel 7,11 gefärbt wurden gewonnen bestätigt worden. Zu beachten ist, sind Maus Blutgefäße oft im Inneren der Implantate zu sehen (besonders um die Grenze), sondern mit der Maus Schiffe keine Flecken mit diesem Antikörper positiv. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von menschlichen MSC durch immunhistochemische Färbung mit human-spezifische Antikörper gegen CD90 bzw. α-smooth muscle actin (α-SMA) nachgewiesen werden. Menschliche MSC sind sowohl in den perivaskulären Region neu gebildete Blutgefäße und interstitiell in das Implantat 11 befindet sich gefunden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Typisches Erscheinungsbild ECFC und MSC Kulturen. Phasenkontrast-Aufnahmen zeigt die typische Erscheinungsbild der ECFCs und MSCs in Kultur. (A) Monolayer von Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs Darstellung der charakteristischen Kopfsteinpflaster Morphologie der Endothelzellen. (B) Human Knochenmark abgeleiteten MSCs Anzeige einer Spindelform Morphologie. Scaler Bars, 200 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Aussehen der explantierten Stecker am Tag 7. Humanem Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs und Knochenmark abgeleiteten MSCs wurden in Kollagen / Fibronektin / Fibrin-Gel eingebettet und subkutan in Nacktmäuse implantiert, wie im Text beschrieben. (A) Nach 7 Tagen, sobald die Maus wurde eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektionsstelle und setzen die Zelle / Gelpfropfen durch Umklappen der Haut. (B) Aussehen des Steckers chirurgisch aus der Maus und vor Formalinfixierung entfernt. Die rote Farbe des Implantats ist ein Indiz für Vaskularisation. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Histologische Identifizierung von Gefäßnetz in explantierten Stecker. Hämatoxilin und Eosin (H &amp; E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (gekennzeichnet durch ein gelbes gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe (dh, Fettgewebe und Skelettmuskulatur). (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Mikrogefäßen (gelbe Pfeilspitze zeigt auf einige von ihnen) im Stecker; Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Immunhistochemische Identifizierung von menschlichenLumen. Immunhistochemisch gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. Bei einer Verdünnung 1:100; Färbung wurde mit einem monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31 (hCD31) Antikörper aus DakoCytomation (. Cat # M0823 Clone JC70A); durchgeführt Zellkerne wurden mit Hämatoxilin gegengefärbt. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (abgegrenzt durch eine schwarze gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe. Die spezifischen menschlichen, CD31-positive Mikrogefäßen sind in braun (Peroxidase-Färbung) gefärbt. (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Menschen Mikrogefäßen (schwarz Pfeilspitze an einigen hCD31-positive Lumen) im Stecker.

<ol><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+creation+of+long-lasting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li>
<li>N&ouml, r, E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dies ist ein experimentelles Modell für Biotechnik humanen vaskulären Netzwerken. Die wichtigsten Merkmale dieses Modells sind: 1) Mikrogefäßen sind aus menschlichen Zellen aus postnatalen Gewebe (dh Blut und Knochenmark) isoliert gebildet; 2) Mikrogefäßen bei einem erwachsenen Tier gebildet werden, und 3) Mikrogefäßen nicht von der Vorschule entstehen bestehenden (Host) Schiffe, sondern sie gebildet sind, de novo, aus einzelnen Zellen in einem geeigneten Gel suspendiert. Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle in diesem Test, weil Verbindungen zu den murinen Gefäßsystem notwendig sind, um rote Blutkörperchen gefüllten Gefäße, eine der funktionellen read-out in diesem Test zu erzielen. Darüber hinaus sind Host-myeloischen Zellen, um das Implantat in den ersten Tagen nach der Transplantation rekrutiert, und sie sind notwendig für die Bildung der neuen Gefäßbett 12. Dieses experimentelle Modell bietet ein vielseitiges, quantifizierbare und relativ einfaches Modellsystem, um die postnatale Entstehung von menschlichen vaskulären Netzwerken in-vivo-Studie. Darüber hinaus ist dieser Test einfach durchzuführen und es bedarf keiner einen Einschnitt oder chirurgischen Eingriffs. Das Modell könnte verwendet werden, um den vaskulären Potenzial von verschiedenen Quellen der menschlichen Endothelzellen und perivaskulären Zellen zu studieren. Das Modell könnte verwendet werden, um für die anti-und / oder pro-vaskulären Verbindungen Bildschirm. Schließlich kann das Modell verwendet, um die Rolle (n) bestimmter Gene bei der Entstehung und Funktion einer Gefäßnetz der menschlichen Endothel zusammen zu studieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Endothelial Basal Medium, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot Ergänzungen </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x GPS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30 bis 009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenchymalen Stammzellen Growth Medium BulletKit, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe Glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-essentielle Aminosäure-Lösung, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe Glukose Dulbeccos Modified Eagle, gepudert DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Puffer-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Bovine Collagen I-Lösung </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex humanem Fibronectin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinogen aus Rinder-Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Fischer </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA-Lösung, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran, Flüssigkeit zur Inhalation </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Thrombin aus bovinem Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Formalin-Lösung, Buffered Neutral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonalen Maus-Anti-Human CD31 Antikörper </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Clone JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering humane mikrovaskuläre networks in immundefizienten mäusen

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Die Zukunft des Tissue Engineering und zell-basierte Therapien für die Geweberegeneration wird wahrscheinlich auf unsere Fähigkeit, funktionale Gefäßnetze in vivo zu generieren verlassen. In dieser Hinsicht ist die Suche nach experimentellen Modellen zu Blutgefäßnetze in vivo zu bauen von größter Bedeutung 1. Die Machbarkeit der Biotechnik mikrovaskulärer Netzwerke in vivo wurde zum ersten Mal gezeigt, mit menschlichem Gewebe stammenden reifen Endothelzellen (ECs) 2-4, aber wie autologen Endothelzellen gegenwärtigen Probleme für eine breite klinische Anwendung, weil sie schwierig in ausreichenden Mengen zu erhalten und erfordern Ernte von bestehenden Gefäßsystem. Diese Einschränkungen haben angezettelt die Suche nach anderen Quellen der ECs. Die Identifizierung von Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) im Blut präsentiert eine Gelegenheit, nicht-invasiv zu erhalten ECs 5-7. Wir und andere Autoren haben gezeigt, dass adulte und Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs die Fähigkeit, funktionale Gefäßnetze in vivo 7-11 bilden können. Wichtig ist, dass diese Studien haben auch gezeigt, dass eine stabile und dauerhafte Gefäßnetze zu erhalten, benötigen ECFCs Co-Implantation mit perivaskulären Zellen. Der Test wir hier beschreiben, veranschaulicht dieses Konzept: Wir zeigen, wie humanem Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs kann mit Knochenmark-abgeleitete mesenchymale Stammzellen (MSCs) als eine einzige Zellsuspension in einer Kollagen / Fibronektin / Fibrinogen-Gel kombiniert werden, um eine funktionelle menschliche Form Gefäßnetz innerhalb von 7 Tagen nach der Implantation in einen immundefizienten Maus. Die Anwesenheit von Menschen ECFC gesäumten Lumen mit Host-Erythrozyten kann während der Implantate zeigt nicht nur die Bildung (de novo) eines Gefäßnetz, sondern auch die Entwicklung von funktionellen Anastomosen mit dem Host-Kreislauf-System zu sehen. Das Mausmodell der biotechnologisch menschlichen Gefäßnetz ist ideal für Studien über die zellulären und molekularen Mechanismen der menschlichen Gefäßnetz Bildung und für die Entwicklung von Strategien, um technisch Gewebe vaskularisieren geeignet.

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Die Zukunft des Tissue Engineering und zellbasierter Therapien zur Geweberegeneration wird voraussichtlich von unserer Fähigkeit abhängen, funktionelle Gefäßnetzwerke zu generieren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein in vivo menschliches Gefäßnetzwerk zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst aus menschlichem Blut stammende endotheliale Kolonie-bildende Zellen und aus menschlichem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen kultiviert werden. Anschließend werden beide Zelltypen in ein Kollagen-basiertes Gel gemischt, das subkutan in eine immundefiziente Maus injiziert wird. Sieben Tage später wird das Implantat entnommen und auf die Bildung eines menschlichen vaskulären Netzwerks untersucht. Letztendlich kann das Vorhandensein menschenspezifischer Mikrogefäße innerhalb der Implantate durch histologische und immunhistochemische Verfahren nachgewiesen werden. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber einer Methode wie der chirurgischen Implantation eines Konstrukts ist LED, da sie einfach und leicht durchzuführen ist und keinen chirurgischen Eingriff erfordert.Beginnen Sie damit, eine Vial mit E CFCs aufzutauen, und verdünnen Sie die Zellen unverzüglich in einem 15-Milliliter-Kegelrohr, das 10 Milliliter DMEM enthält. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1200 U/min für fünf Minuten und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter warmem EGM-2-Medium. Überführen Sie die Zellen anschließend in eine mit 1 % Gelatine beschichtete 100-Millimeter-Zellkulturplatte und inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator.Am folgenden Morgen das Medium und alle nicht gebundenen Zellen vorsichtig abpipettieren. Anschließend die gebundenen Zellen mit 10 Milliliter frischem E GM zwei Medium versorgen. Diesen Vorgang in den nächsten Tagen fortsetzen, bis sich eine konfluente Zellschicht gebildet hat.Waschen Sie die Zellen anschließend mit 10 Milliliter PBS. Ersetzen Sie den PBS durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA und stellen Sie die Platte für fünf Minuten in den Inkubator. Überprüfen Sie nach fünf Minuten unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen gelöst haben, indem Sie vorsichtig auf die Platte klopfen.Falls dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die kurzen Inkubationen mit sanftem Schwenken. Sobald die Zellen vollständig abgelöst sind, geben Sie acht Milliliter EGM zwei Medium zu den Zellen hinzu und überführen die Zellen in ein 15-Milliliter-Kegelgefäß. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 1200 U/min.Plattieren Sie die Zellen nun auf mit 1 % Gelatine beschichteten Zellkulturschalen mit einer Ansiedlungsdichte von 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Inkubieren Sie die Zellen in EGM-2-Medium und versorgen Sie sie alle zwei bis drei Tage mit frischem EGM-2-Medium. Wiederholen Sie dieses Verfahren für nachfolgende Passagen zwischen der vierten und achten Passage.Die E CFCs sind gebrauchsfertig. Dieses Protokoll kann auch zum Kultivieren von MSCs verwendet werden. Ersetzen Sie dazu das E GM zwei Medium durch M-S-C-G-M Medium.Verwenden Sie eine nicht beschichtete Kulturplatte. Beginnen Sie die Subkultur bei 80 % Konfluenz und subkultivieren Sie mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Für dieses Experiment werden 800.000 E CFCs und 1.200.000 MSCs pro Implantat benötigt.Im Allgemeinen werden fünf Implantate gleichzeitig vorbereitet. Beginnen Sie damit, das Zellmedium von den Kulturplatten abzusaugen und spülen Sie jede Zellplatte mit 10 Milliliter PBS. Ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie die Platten mit sanftem Schütteln.Überprüfen Sie die Zellen alle zwei bis fünf Minuten unter dem Mikroskop, bis sich alle Zellen gelöst haben. Geben Sie dann acht Milliliter DMEM hinzu und sammeln Sie die Zelllösung. Zählen Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Kegelrohr und überführen Sie ausreichend Zellen für fünf Implantate in ein einzelnes 15-Milliliter-Kegelrohr.Anschließend die Zellen bei 1200 U/min fünf Minuten lang abzentrifugieren und das Überstand entfernen. Vorsichtig eine Mischung aus Fibrinogen und Kollagen-Fibronectin auf Eis herstellen. Danach das Zellpellet vorsichtig in der eiskalten Mischung resuspendieren.Unter Vermeidung von Luftblasen wird die Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze gefüllt und eine verschlossene 26-Gauge-Nadel angebracht. Die beladene Spritze wird bis zur Injektion der Zellmischung auf Eis gehalten. Vier sechs Wochen alte athymische, nackt, immundefiziente Mäuse werden mittels einer ISO-Fluorin-Kammer anästhesiert.Nachdem die Mäuse anästhesiert sind und nicht mehr auf eine Zehenquetschung reagieren, fahren Sie mit den Injektionen für jede Maus fort. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel 50 µL Thrombin-Lösung subkutan in den oberen dorsalen Bereich. An derselben Stelle injizieren Sie 200 µL der Zellmischung.Mit einer 26-Gauge-Nadel injizierte Makromoleküle verquellen und bilden unter der Haut eine kleine, aber deutlich sichtbare Erhebung. Nach der Injektion die Mäuse zur Bequemlichkeit und Wärme auf eine Mullkompresse legen. Sie beobachten, bis sie wieder lauffähig sind.Beobachten Sie in den nächsten drei Tagen täglich die allgemeine Gesundheit der Tiere. Eine Woche nach den Injektionen werden die Mäuse mit Kohlendioxid euthanasiert und der Gel-Plug operativ entfernt. Nach der Entnahme werden die Gel-Plugs zusammen mit einem Lineal fotografiert, anschließend jeder Gel-Plug in eine histologische Kassette gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertem Formalin eingelagert.Am nächsten Tag das 10 %ige neutral gepufferte Formalin mit destilliertem Wasser abwaschen. Die Kassetten bis zur histologischen Auswertung bei vier Grad Celsius in PBS lagern. Stellen Sie sieben Mikrometer dicke Schnitte des in Paraffin eingebetteten Implantats her.Anschließend quantifizieren Sie die Dichte der Mikrogefäße im mittleren Bereich der Implantate. Mithilfe einer H-und-e-Färbung bewerten Sie die Anzahl der Gefäße pro Quadratmillimeter, um den humanen Charakter der mikrovaskulären Gefäße nachzuweisen. Färben Sie die Schnitte mit einem kommerziell erhältlichen anti-humanen CD31-Antikörper in einer Verdünnung von 1 zu 100.Dieses Phasenkontrastbild zeigt die charakteristische kieselsteinartige Morphologie von endothelialen Zellen in einer typischen konfluenten Monoschicht von aus Nabelschnurblut gewonnenen eCFCs. Dieses Bild zeigt die typische spindelförmige Morphologie von aus menschlichem Knochenmark gewonnenen MSCs. Nach einer einwöchigen Inkubation im Mauswirt sah das durch eine gelbe gestrichelte Linie markierte Implantat bei höherer Vergrößerung ganz anders aus als das Gewebe des Wirts.Mehrere Mikrogefäße zeigten ihre luminalen Strukturen, die rote Blutkörperchen enthielten, und sind durch die gelben Pfeilspitzen hervorgehoben. Bei immunhistochemischer Untersuchung der Plugs reagierten die Lumina der Mikrogefäße auf einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches CD31. Die Zellkerne wurden mit Hämatin kontrastgefärbt.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb einer Unze durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Transplantation menschlicher Haut auf eine immundefiziente Maus mit einer unterdrückten Neutrophilenreaktion. Bei der Methode wird menschliche Spalthaut auf das Transplantatbett der Maus aufgetragen, versiegelt und für die Genesung abgedeckt. Schließlich haftet die menschliche Haut an der Haut der Maus, wodurch Vaskularisierung und Durchblutung hergestellt werden, was zu einer erfolgreichen Haut-Xenotransplantation führt.

Eine Technik zur Transplantation menschlicher Haut in einem Mausmodell

Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.

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Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

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Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

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