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Beginnen Sie damit, die Komponenten des Tissue-Grinders auf Eis zu legen. Dieses Gerät besteht aus einem Mörser und zwei Stößeln mit unterschiedlichen Durchmessern.
Gießen Sie einen gekühlten Salzpuffer in den Mörser und fügen Sie dann Mäusehirngewebe hinzu.
Der Puffer hält das osmotische Gleichgewicht aufrecht und bewahrt so die Zellstruktur und -funktion.
Mahlen Sie das Gewebe mit mehreren sanften Bewegungen mit dem Stößel mit kleinerem Durchmesser, der das Gewebe mechanisch in kleinere Stücke schert.
Streichen Sie anschließend mit dem Stößel mit größerem Durchmesser, um die weitere Zerlegung des Gewebes in seine einzelnen Zellen zu erleichtern.
Die Mischung in ein Röhrchen geben und zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand.
Fügen Sie gekühltes Salz, Puffer und Wirbel hinzu, um die Zellklumpen und das Myelin aufzubrechen.
Fügen Sie als Nächstes ein Dichtegradientenmedium und eine Zentrifuge hinzu.
Aufgrund von Unterschieden in Form und Masse siedeln sich Zellen in der unteren Schicht an, während sich Ablagerungen und Myelin in der oberen Schicht ansammeln.
Entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie eine geeignete Lösung hinzu, um eine mehrzellige Suspension für die weitere Verwendung zu erhalten.
Für die Gewebehomogenisierung geben Sie 3 Milliliter vorgekühltes HBSS in den vorgekühlten Glasmörser einer Dounce Gewebemühle und geben Sie die Hälfte eines geernteten Gehirns in den Mörser. Mazerieren Sie das Gewebe vorsichtig mit 10 Zügen Stößel A, gefolgt von 10 Zügen Stößel B, und geben Sie die homogenisierte Mischung in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Füllen Sie das Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 10 Millilitern mit vorgekühltem HBSS für die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in 7 Millilitern frischem HBSS mit Vortexing, bevor Sie die Probe auf Eis halten. Zur Entfernung von Ablagerungen fügen Sie jeder aufgeschlossenen oder homogenisierten Probe 3 Milliliter vorgekühlte isotonische Lösung hinzu und wirbeln Sie die Proben vorsichtig ein, um sicherzustellen, dass sie homogen gemischt sind.
Zentrifugieren Sie anschließend die Proben und entfernen Sie vorsichtig die weißliche Scheibe aus Schmutz und Myelin, die an der Oberfläche der Lösung schwimmen. Wenn die Rückstände entsorgt wurden, sammeln Sie alle bis auf die letzten 100 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen, ohne die Pellets zu beschädigen. Jedes Pellet wird in 1 Milliliter FACS/BL-Lösung resuspendiert, um es in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
Nach der Zentrifugation mit der Partikellösung ist es wichtig, die Trümmerscheibe und den Überstand sehr vorsichtig zu entfernen, ohne das Küvettenpellet zu entfernen, um Probenverluste zu vermeiden.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig aus jedem Röhrchen abgesaugt und die Pellets in 350 Mikrolitern frischem FACS/BL pro Röhrchen resuspendiert.