Isolierung mononukleärer Zellen aus dem Gehirn von Mäusen: Eine Dichtegradienten-Zentrifugationstechnik zur Isolierung von im Gehirn ansässigen mononukleären Zellen

Mononukleäre Zellen im Gehirn, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gehirnfunktion und der Homöostase.

Um diese mononukleären Zellen zu isolieren, nehmen Sie zunächst ein frisch entnommenes Mäusegehirn, das mit Kochsalzlösung durchblutet ist.

Die Perfusion ermöglicht die Entfernung von Blut und seinen Bestandteilen aus den Blutgefäßen, wodurch in den nachfolgenden Schritten die Isolierung von im Gehirn ansässigen Immunzellen ermöglicht wird.

Spülen Sie nun das Gehirn mit geeigneten Medien aus, um anhaftende rote Blutkörperchen zu entfernen. Nach dem Spülen wird es zerkleinert, um kleine Taschentuchstücke zu erhalten.

Homogenisieren Sie die Gewebestücke, um eine Suspension aus einzelnen Zellen und Zellfragmenten zu erhalten.

Zu dieser Suspension fügen Sie dann gekühltes Medium und geeignetes Dichtegradientenmedium in geeigneten Volumina hinzu, um ein Gradientenmedium mit niedriger Dichte zu bilden.

Fügen Sie als Nächstes ein bestimmtes Volumen eines Gradientenmediums mit hoher Dichte hinzu. Das Verlaufsmedium mit hoher Dichte bildet unten eine separate Schicht, wodurch ein diskontinuierlicher Dichtegradient entsteht.

Zentrifugieren Sie die Suspension bei hoher Geschwindigkeit und niedrigen Temperaturen. Mononukleäre Zellen befinden sich an der Schnittstelle zwischen den beiden Medienschichten mit Dichtegradienten.

Entsorgen Sie die oberste Schicht mit Zelltrümmern und Myelin - der Fettgewebehülle, die die Axone der Nervenzellen umgibt.

Übertragen Sie die Grenzschicht in ein frisches Röhrchen, das ein geeignetes Medium und eine Zentrifuge enthält.

Gereinigte mononukleäre Zellen sedimentieren als Pellet und können zur weiteren Analyse in einem Puffer resuspendiert werden.

Schneiden Sie den Schädel vorsichtig von der Nase bis zum Hals ab und geben Sie das Gehirn jedes Tieres aus der Schädelbox in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern RPMI-Medium.

Mischen Sie die Röhrchen gut, um die anhaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen, und entfernen Sie das Medium durch Aspiration. Geben Sie 10 Milliliter frisches Medium in jedes Röhrchen und geben Sie die Gehirne in einzelne 100-Millimeter-Schalen

Hacken Sie jedes Gehirn mit einem Rasiermesser fein und geben Sie mit einer Plastikpipette so viel Gewebe wie möglich von einer Schale in 6 Milliliter Medium in einen eiskalten 7-Milliliter-Sinterglas-Homogenisator.

Mahlen Sie das Gehirn mit dem "lockeren" Kolben des Stößels, bevor Sie den "engen" Kolben verwenden, um das Gewebe zu bringen, bis die Suspension homogen ist. Gießen Sie dann die resultierende Gewebeaufschlämmung in ein vorgekühltes konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis.

Wenn alle Proben homogenisiert sind, stellen Sie das Volumen in jedem Röhrchen auf 7 Milliliter mit frischem Medium ein, bevor Sie jede Gewebesuspension in ein neues gekühltes 15-Milliliter-Röhrchen geben, das 3 Milliliter 100 % Basalmembranmatrix pro Röhrchen enthält.

Mischen Sie einige Male durch Inversion und fügen Sie mit einer 3-Milliliter-Pipette vorsichtig und langsam 1 Milliliter 70%ige Dichtegradientenlösung unter jede Gewebelösungsprobe hinzu.

Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und entfernen Sie fast die gesamte oberste Schicht, wobei Sie darauf achten müssen, dass das gesamte Myelin vollständig entfernt wird.

Übertragen Sie die Schnittstelle in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit frischem Medium auf 10 Milliliter ein. Zentrifugieren Sie dann die Proben erneut und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Pellets in etwa 100 Mikrolitern Medium pro Röhrchen resuspendieren.

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