Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Nehmen Sie das gewünschte Plasmid in serumfreien Medien ein. Dieses Plasmid kodiert vesikelspezifische Proteine mit fluoreszierenden Tags.

Nehmen Sie in einem anderen Röhrchen das Transfektionsreagenz in serumfreiem Medium verdünnt.

Mischen Sie die beiden Lösungen und inkubieren Sie.

Das Transfektionsreagenz verbindet sich mit dem Plasmid und bildet einen Komplex.

Nehmen Sie eine Vertiefung mit adhärenten Neuronen in den Medien mit Serum. Fügen Sie die Komplexe hinzu und inkubieren Sie. Der Komplex erleichtert den Eintritt des Plasmids in die Zelle.

Entsorgen Sie das Medium, um nicht internalisierte Komplexe zu entfernen.

Fügen Sie frische Medien hinzu und inkubieren Sie dann.

Das Plasmid gelangt in den Zellkern, um transkribiert zu werden, und wird dann in vesikelspezifische fluoreszierende Proteine übersetzt, die die Vesikel in den Neuronen markieren.

Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop unter kontrollierter Temperatur Bilder in bestimmten Zeitintervallen auf.

Um die Bilder zu analysieren, definieren Sie Tracking-Parameter.

Identifizieren Sie das interessierende Vesikel und notieren Sie seine Koordinaten in jedem der Bilder.

Kompilieren Sie die Daten, um die Bewegung des Vesikels zu visualisieren.

Mischen Sie bei diesem Verfahren 4 Mikrogramm Plasmid mit 200 Mikrolitern serumfreiem Medium. Verdünnen Sie in einem separaten Röhrchen acht Mikroliter des Transfektionsreagenzes in 200 Mikrolitern serumfreiem Medium. Inkubieren Sie die Lösung dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten werden die Plasmidlösung und die Transfektionsreagenzlösung gemischt und die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend die Mischung in die beschichteten Glasbodenschalen geben.

Inkubieren Sie die Neuronen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie anschließend das Medium durch 2 Milliliter zerebrales kortikales Kulturmedium und inkubieren Sie die Neuronen ein bis zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie für die Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera mit 40-fach-Objektiven ausgestattet ist. Halten Sie die Temperatur mit einem Inkubationssystem bei 37 Grad Celsius. Erfassen Sie Neuronenbilder mit 1 Bild alle 5 Sekunden über einen Zeitraum von 100 Sekunden, gesteuert von der Bilderfassungssoftware.

Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie alle sequenziellen Bilder in der ImageJ-Software mit manueller Nachverfolgung. Um die sequenziellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie Bild, dann Stapel, gefolgt von zu stapelnden Bildern, und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie danach Plugins und dann Manuelle Nachverfolgung. Es öffnet sich ein Tracking-Fenster. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen "Parameter anzeigen" und definieren Sie die Tracking-Parameter im Abschnitt "Parameter".

Klicken Sie dann auf Spur hinzufügen, um eine neue Spur zu starten. Nachdem Sie die interessierenden Vesikel bestimmt haben, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequenziellen Bildern, um die XY-Koordinaten aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die XY-Koordinaten der Vesikel aus allen sequenziellen Bildern zu erfassen. Jedes Bild wechselt automatisch zum nachfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt wurde.