Name: Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Zellverkapselung durch Tröpfchenausstoß für 3D-Bioprinting und Gewebetechnik. Diese Methode nutzt Magnetventile und Druckluft zur präzisen Zellpositionierung und unterstützt die Entwicklung komplexer Zellstrukturen.

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NIH3T3-Zellen der Zubereitung: A. Zellen für Ejection <ol><li> Trypsinize Zellen, dann verdünnt 1:1 mit Zell-Medien und Übertragung von einem T75 Kolben in ein 15 ml Falcon-Röhrchen </li><li> Spin down-Zellen zu einem Pellet durch Zentrifugation, Absaugen des Überstandes und waschen Sie die Zellen mit DPBS </li><li> Spin down-Zellen zu einem Pellet erneut, und saugen Überstand </li><li> Die Zellen in den Medien </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte mit Zählkammer (~ 200 X 10 4 Zellen / ml pro Flasche T75) </li><li> Zentrifugenzelle Lösung absaugen Überstand und resuspendieren in entsprechender Höhe von Medien für unterschiedliche Zell-Konzentrationen </li></ol> B. Zell-Ausstoß <ol><li> Vortex-Zellen, bevor Sie zum Auswerfen </li><li> Transfer-200 ul der Zell-Lösung in die Spritze </li><li> Festlegen geeigneter Modus Impulsgeber <ol><li> Zum Auswerfen einzelner Tropfen und mehrere Tröpfchen (Bursts), setzen Impulsgeber zu &quot;E. BUR&quot;-Modus </li><li> Für die kontinuierliche Tröpfchenausstoß setzen Impulsgeber auf &quot;NORM&quot;-Modus </li></ol></li><li> Ändern Signal-Einstellungen <ol><li> Set hohen und niedrigen Ausgangsspannung: HIL bis 5 V und LOL auf 0 V und sicherstellen, dass die &quot;LIM&quot; LED ist an </li><li> Set-Signal als Rechteckimpuls </li><li> Ändern Sie die Höhe der Zeit das Magnetventil ist offen für Tröpfchenausstoß indem Sie den Wert für &quot;WID&quot; oder Ändern Einschaltdauer (&quot;Pflicht&quot;) </li><li> Ändern Sie die Frequenz eines Rückschlags indem Sie den Wert für &quot;PRO&quot; </li><li> Ändern Sie die Anzahl der Tropfen in einem Ausbruch, indem der Wert für &quot;BUR&quot; ausgeworfen </li></ol></li><li> Eject Zelle Lösung auf den vorbereiteten Untergrund für die Bildgebung mit Mikroskop </li></ol> C. Färbung <ol><li> Make up Farbstofflösung mit 0,5 ul Calcein-AM und 2 ul Ethidium Homodimer pro ml DPBS </li><li> Tauchen vorbereiteten Untergrund in Farbstofflösung </li><li> Lassen Sie Probe für 10 Minuten bei 37 ° C inkubieren, bevor Bildgebung </li></ol> Experiment Validation <ol><li> Auf einem Nikon Eclipse TE-2000 U Fluoreszenzmikroskop <ol><li> Spot fortschrittliche Software (Diagnostics, Inc.) </li><li> Live / Dead Assay </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<table><tbody><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>Zellen-Auswurfvorrichtung mit Magnetventil</td><td></td><td></td><td></td><td>Betriebsfrequenz: 1 kHz, 30 psi, 50 nl bis 0,5 µl. 12-V-Ventiltreiber: 2,5 A Ansteuerstrom</td></tr><tr><td>5-Gallonen-tragbarer Lufttank</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>Druckluft: 30 psi</td></tr><tr><td>Druckregler</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulsgenerator</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>Erzeugung der Ansteuerfrequenz: 50 MHz</td></tr><tr><td>XYZ-Stage</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>Mit Schrittmotor: xy-Stage mit 6-Zoll-Verfahrweg (NLS4-6-25), z-Stage mit 2,5-Zoll-Verfahrweg (NLS4-2.5-25), 3-Achsen-Controller (NSC-G3), 0,1-µm-Auflösung</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>Zelllinie</td><td></td><td></td><td>Fibroblasten</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td><td>0,05%-ige Lösung</td></tr><tr><td>NIH-3T3-Zellmedium</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>Gewebekulturgefäße</td></tr><tr><td>Kunststoff-konische Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, für Gewebekultur</td></tr></tbody></table>

titel der verkapselung von zellen durch tröpfchen

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Mein Name ist Hang Moon. Ich arbeite mit dem Professor für Kondome zusammen. Er und ich arbeiten mit dem XYJ-Stage, um eine 3D-Struktur einer Zelle herzustellen.Hallo, ich bin PE und Lynn und arbeite am Zell-Druck-Projekt mit Zell-Einschluss sowie Medium und Gele. Dies ist ein Magnetventil zur Ausstoßung einer Zelle und einer Zellmischung über das Zellmedium. Das Magnetventil wird durch zwei Signalleitungen aktiviert.Die Signalleitung stammt von hier aus einer Trockenplatine. Das Signal kommt von hier. Jene Leitung, die durch diese Leitung führt, ist der Funktionsgenerator erster Ordnung.Als Erstes wird durch unsere programmierte Methode erzeugt. Wenn Sie also möchten, können Sie die Brieftasche ändern, indem Sie das Programm mit der entsprechenden Schaltzeile ändern oder den Prozessgenerator am Computer steuern. Das zelluläre Ventil wird durch ein elektrisches Signal geöffnet und geschlossen, aber die Zelle wird über diese Leitung versorgt.Die Zelle und das Medium oder Agar-Gel werden über Spritzen zugeführt. Die Spritzen befinden sich im Wasser, und der Druck in der Spritze wird durch Luft erzeugt. Die Druckluft wird aus einem Tank über eine Leitung zugeführt.Die kleine Leitung und die ionisierte Luft strömen durch den Luftfilter. Der Luftfilter filtert Staub und andere Arten von Schmutz heraus. Der Druckerzeuger, wie wir ihn nennen, erzeugt das Signal, das verwendet wird, um das Solarluftventil zu öffnen oder zu schließen. Der Computer ist über einen P-I-B-U-S-V-Stecker verbunden.Wir können den USB-Anschluss direkt über unseren Computer, den Laptop, verwenden. Dieser ist hier mit dieser Seite verbunden. Anschließend können wir über den Steuerungslaptop hier die Steuerung vornehmen.Wenn wir also die Bewegung des Stages mit dem Öffnen der Glocke synchronisieren möchten, kann dies über denselben Controller wie den Laptop gesteuert werden. So können wir den Zeitpunkt steuern, zu dem sie sich öffnet, schließt, bewegt und stoppt. Und wir können die Bewegung mit dem Öffnen der Glocke synchronisieren.Dieses Stadium ist der motorisierte Tisch. Er wird automatisch über die Sterbesignal-Leitung und den Motor bewegt. Die Motorisierung beträgt somit 0,1 Mikrometer.Im Idealfall kann es die Linie bis zur 100-Millimeter-Linie ziehen. Die Strahlachse bewegt sich also auf und ab. So wird der Abstand zwischen dem Substrat und dem Solarband gesteuert.So kann die Auswurfhöhe gesteuert werden. Das Substrat ist hier mit den XY-Positionierern verbunden, X hier und Y dort. Es bewegt sich also in einer XY-Ebene.Es zeigt also eine Funktionserläuterung in bestimmten Phasen, die drei X-, Y- und G-Achsen umfasst. Die Jet- oder Jet-Achse bzw. die XY-Achse wird durch ein Signal gesteuert. Die Signalleitung ist hier mit dem Bewegungsregler verbunden. Dieser Bewegungsregler verfügt über keinen manuellen Schalter, da er nicht manuell gesteuert werden kann.Es wird über den Laptop-Computer gesteuert. Der Laptop-Computer ist also verbunden. Auf der Rückseite des Controllers haben wir drei xs für eine Druckzelle XY Jet.Es erzeugt also unabhängig drei verschiedene Arten von Signalen. Der Bewegungsregler kommuniziert über die HF-2,3,2-Steckverbinder, die direkt mit dem USV verbunden sind. Das USV ist anschließend mit einem Laptop-Computer verbunden.So wird der Laptop gesteuerte Bohrer bedient. Wir verwenden das AutoCAD-Programm, erstellen einen Gen-A-Pfad auf diese Weise, bamm. Und dann wird es in die Maschinensprache wie folgt umgewandelt.Die Maschinensprache wird also so übertragen, dass die einfachen Zeichen und Zahlen entsprechend behandelt werden. Jede Position steht hier in Bezug zu den X-, Y-, Z-Achsen. Ich wähle die Datei aus, die jenes Programm enthält, und öffne dann das Download-Programm auf diese Weise. Anschließend wähle ich aus der Datei genauso wie zuvor die Textdatei aus.Nur die Textdatei wird heruntergeladen. Wählen Sie die Textdatei aus, und der Download vom Laptop auf den Com-Motion-Controller-Executive erfolgt automatisch, woraufhin das BAM-Zeichen erscheint, wie ich bereits erwähnt habe, BAM. In diesem Kolben befinden sich NIH/3T3-Mausfibroblastenzellen. Zunächst werde ich das alte Medium abpipettieren.Dieser Prozess dient der Umpflanzung der Zellen, die am Boden des Kolbens anhaften. Nach dem Absaugen des Mediums werde ich sechs RYS hinzufügen, was ein Enzym ist. Okay? Nachdem das Trypsin in den Kolben gegeben wurde, müssen wir drei bis fünf Minuten warten, bis sich die Zellen vom Boden des Kolbens gelöst haben.Jetzt sind wir bereit, das Medium hinzuzufügen und die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen zu überführen. Es handelt sich um eine Verdünnung im Verhältnis eins zu eins. Ich gebe hier sechs Milliliter dieses Mediums hinzu und werde die Schalen leicht ausspülen, um sicherzustellen, dass alle Zellen überführt werden.Und nun sind die Zellen bereit, in diesem Reagenzglas zentrifugiert zu werden. Jetzt werden wir diese Zellen bei tausend U/min drei bis fünf Minuten lang zentrifugieren. Nachdem die Zellen nun als Pellet abgetrennt wurden, werde ich den Überstand abpipettieren.Jetzt werde ich die Zellen mit PBS ausspülen. Dies dient der Färbung der Zellen. Die Farbstoffe, die wir verwenden, sind Esterase-Substrate.Okay, jetzt werden wir erneut zentrifugieren und die Zellen als Pellet abtrennen. Anschließend pipettiere ich die PBS ab und resuspendiere die Zellen erneut in Medium, um sie zu zählen.Ich mische die Zellen, damit die Konzentration in der gesamten Probe gleichmäßig ist, wenn wir eine Stichprobe entnehmen. Nun werde ich hundert Mikroliter der Zellen entnehmen, um die Zelldichte zu messen. Jetzt gebe ich hundert Mikroliter Trypanblau hinzu, das ein Farbstoff ist.Wir warten drei bis fünf Minuten, damit die Färbung in die Membranen abgestorbener Zellen eindringen kann. Bei der Zählung berücksichtigen wir die blauen Zellen nicht. Die Zellen sind bereit, mit dem Hämocytometer gezählt zu werden. Ich werde 50 Mikroliter der Zellmischung auf jede Seite des Hämocytometers übertragen.Okay, ich werde es mit der Seite eines Deckgläschens abdecken. Der Hämocytometer hat zwei Seiten. Ich werde die erste Seite zählen und nach der Zählung beider Seiten den Durchschnitt bilden und dann mit zwei multiplizieren, da wir eine Verdünnung im Verhältnis 1:1 mit der blauen Flüssigkeit durchgeführt haben.Unsere Zelldichte beträgt also im Grunde 135 mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter. Für unser Experiment verwenden wir eine Zelllösung mit einer Konzentration von einer halben Million Zellen pro Milliliter. Da wir 13,5 Millionen Zellen haben, werde ich die Zellen in 27 Milliliter Medium resuspendieren.Wir verwenden zwei verschiedene Arten von Farbstoffen. Dies ist ein Live-Dead-Assay von Molecular Probes. Unser erster Farbstoff heißt Calcium AM.Unser zweiter Farbstoff wird AUM-Homodimer genannt. Er färbt tote Zellen. Wir verwenden blaue Anregung, um grüne Fluoreszenz zu erhalten, und grüne Anregung, um rote Fluoreszenz zu erhalten. Bei diesen beiden Farbstoffen wird unsere Würfellösung zur Bildgebung in PBS hergestellt.Zunächst werde ich fünf Milliliter PBS in ein Reagenzglas überführen – Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Das ist eine Kochsalzlösung. Nun werde ich einen halben Mikroliter Calcium am pro Milliliter hinzufügen.Jetzt gebe ich 2,5 µL Calciumam in das Reagenzglas und 2 µL des Homodimers von Athe pro ml PBS. Hier ist die Btex-Maschine. Sie sorgt dafür, dass die Zellen und das Medium gleichmäßig über das gesamte Volumen verteilt werden.Jetzt geben wir die Zelle mit 200 Mikroliter in die Sieben hier. Dann setzen wir die Kappe auf, die fest verschlossen wird, sodass hier die Luft durch das geöffnete Ventil eindringt. Anschließend stelle ich den Riemen entsprechend ein und danach ändere ich den Druck.Also passe ich an. Der Druck beträgt fünf PSI. Der Druck im Inneren der Schläuche beträgt fünf PSI.Von hier bis hier verbindet es sich durch das Innere des Lochs. Wir öffnen also einfach hier die Glocke, und dann wird die Zelle mit einem Druck von fünf PSI befüllt und anschließend geöffnet. Danach beginnt das Sona-Ventil zu arbeiten.Und dann rollen wir das Substrat. Das Substrat ist lediglich eine einfache Objektträgerplatte. Anschließend geben wir die geeignete Portion auf und befestigen das Substrat mit etwas Klebeband, so, verstanden?Und einfach befestige ich es. Wir richten also das gesamte System – die Zelle, das Ablaufventil und das Substrat – ein, während das Ablaufventil bewegt und mit der Arbeit beginnt. Wir stellen somit alles ein und öffnen dann das Ablaufventil, um zu starten.Dann bewegen wir den Tisch so, richtig? Und dann erzeugen wir ein Muster auf dem Substrat, ein Muster auf dem Substrat, und schwupps, ein Zeichen. Ich werde diese Tropfen, die wir gedruckt haben, in die Farbstofflösung eintauchen, die wir zuvor hergestellt haben.Und nun werden die Tröpfchen 10 Minuten lang inkubiert und anschließend abgebildet. Zuerst werde ich das Bild durch das Okular justieren. Unser erstes Bild ist lediglich ein Hellfeldbild.Ich schalte das Licht aus und wechsle den Filter, sodass wir eine blaue Anregung haben, die grüne Fluoreszenz zeigt. Das dritte Bild, das wir aufnehmen werden, zeigt die toten Zellen, die mit dem Thm-Homodimer angefärbt sind. Mit grünem Licht erhalten wir eine rote Fluoreszenz.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel eingekapselt sind. Die Hydrogelkultur, die neurale Vorläuferzellen enthält, wird fixiert, permeabilisiert und mit einer Blockierungslösung behandelt, um eine unspezifische Immunfärbung zu verhindern. Ein primärer Antikörpercocktail wird zugegeben, um spezifische Proteine zu binden, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern und einer Kernfärbung. Die Probe wird dann auf einen Objektträger...

Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel-System verkapselt sind

Dieses Video und Manuskript beschreiben ein Emulsions-basiertes Verfahren zur Einkapselung von Säugetierzellen in 0,5% bis 10% Alginatperlen, die in großen Chargen unter Verwendung eines einfachen Rührkessels hergestellt werden können. Die eingekapselten Zellen können in vitro kultiviert oder für zelluläre Therapieanwendungen transplantiert werden.

Säugetierzellverkapselung in Alginatperlen unter Verwendung eines einfachen gerafften Gefäßes

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Aussaat knappe Bevölkerung der Zellen mittels Pipettenspitzen Tröpfchen mikrofluidischen Geräten um höhere Effizienz der Kapselung von Zellen in Tröpfchen zu bieten.

Eine Pipettenspitze basierte Methode für das Seeding Zellen Tröpfchen mikrofluidischen Plattformen

Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von Alginat als Polymer bei der Mikroverkapselung von verewigten Zellen zur langfristigen Lieferung von Biologika an Nagetieraugen vorgestellt.

Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge

Das vorgestellte experimentelle Protokoll kann verwendet werden, um Echtzeitmessungen der Kavitationsaktivität in einem Zellkulturgerät durchzuführen, mit dem Ziel, die Untersuchung der Bedingungen zu ermöglichen, die für eine erfolgreiche Wirkstoffabgabe und / oder andere Bioeffekte erforderlich sind.

Untersuchung der Kavitationstherapie

Wasser-in-Öl-Tröpfchen-Assays sind nützlich für die analytische Chemie, die Enzymevolution und die Einzelzellanalyse, erfordern jedoch typischerweise Mikrofluidik, um die Tröpfchen zu bilden. Hier beschreiben wir die Partikel-Template-Emulgierung, einen mikrofluidikfreien Ansatz zur Durchführung von Tröpfchenassays.

Partikel-Template-Emulgierung ermöglicht mikrofluidsäurefreie Tröpfchen-Assays

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

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Schnelle Verkapselung des rekonstituierten Zytoskeletts in riesigen unilamellären Vesikeln

Dieser Leitfaden für Einsteiger stellt ein allgemeines Protokoll für die Herstellung von Riesen-Unilamellären Vesikeln (GUVs) mit der Tröpfchentransfermethode vor, diskutiert die kritischen Schritte und gibt Einblicke, um mögliche Anpassungen zu unterstützen, die für verschiedene Anwendungen, einschließlich synthetischer Biologie und Mikrorobotik, erforderlich sind.

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Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

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