Name: High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Erfahren Sie die präzise Mikroverkapselung von Zellen in Pikolitertropfen durch kombinierte Zellordnung und Tropfengenerierung. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Einzel- und Mehrfachzellkapselung mit hoher Effizienz.

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Wir danken RainDance Technologies für die Probe von PFPE-PEG-Tensid in dieser Studie verwendeten, und wir danken den BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, Regisseur) für die Silizium-Wafer verwendet werden, um Schimmel PDMS-Kanal Repliken zu erstellen.

<ol><li>Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+mechanisms+of+microdroplets+using+localized+electric+fields+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).</li>
<li>Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdroplet+dilutor+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">A microdroplet dilutor for high-throughput screening.</a> Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).</li>
<li>Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+stochastic+confinement+enhances+analysis+of+rare+cells+by+isolating+cells+and+creating+high+density+environments+for+control+of+diffusible+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals.</a> Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).</li>
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<li>Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengraving+method+for+rapid+selection+of+single+cells+producing+antigen-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies.</a> Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).</li>
<li>Bradshaw, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+detection+of+secreted+products+from+human+lymphocytes+by+microengraving%3A+Cytokines+and+antigen-reactive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies.</a> Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).</li>
<li>Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+incubation%2C+and+parallel+functional+testing+and+identification+by+FISH+of+rare+microbial+single-copy+cells+from+multi-species+mixtures+using+the+combination+of+chemistrode+and+stochastic+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement.</a> Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).</li>
<li>Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilution-free+analysis+from+picoliter+droplets+by+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biomedical materials. 5, 21001(2010).</li>
<li>Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+encapsulation+of+single-cells+into+monodisperse+picolitre+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops.</a> Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82, 364(2003).</li>
<li>Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dripping+to+Jetting+Transitions+in+Coflowing+Liquid+Streams%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams.</a> Physical Review Letters. 99, (2007).</li>
<li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).</li>
<li>Segrí, G., Silberberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Particle+Displacements+in+Poiseuille+Flow+of+Suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions.</a> Nature. 189, 209-210 (1961).</li>
<li>Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).</li>
<li>Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Segregation+and+Dynamics+in+Confined+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows.</a> Physical Review Letters. 102, (2009).</li>
<li>Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+lateral+particle+ordering+in+finite+Reynolds+number+channel+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows.</a> Physics of Fluids. 22, 081703(2010).</li>
<li>Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+self-assembly+and+control+of+microfluidic+particle+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane.</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J. Vis. Exp. (8), e319(2007).</li>
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<li>Holtze, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).</li>
<li>Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Flow-Rate+Controlled+Breakup+in+Confined+Geometries%3A+A+Route+to+Monodisperse+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions.</a> Physical Review Letters. 94, (2005).</li>
<li>Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+droplets+and+bubbles+in+a+microfluidic+T-junction-scaling+and+mechanism+of+break-up%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up.</a> Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).</li>
<li>Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsification+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%3A+effect+of+the+viscosities+of+the+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids.</a> Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorosurfactants+for+microdroplets%3A+interfacial+tension+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis.</a> Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+novel+fluorous+surfactants+for+microdroplet+stabilisation+in+fluorous+oil+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams.</a> Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).</li>
<li>Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+3D+droplet+self-assembly+for+ultra-high-density+digital+micro-reactor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays.</a> Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).</li>
</ol>

JE ist ein Erfinder auf einen anhängigen Patent auf die Technologie in diesem Manuskript verwendet basiert.

Trotz der relativ hohen Grad der Bestellung werden nicht alle Tropfen enthalten die richtige Anzahl von Partikeln oder Zellen. Verkapselungseffizienz kann als die Anzahl von Zellen oder Partikeln, die in Tropfen mit der gewünschten Belegung durch die Gesamtzahl unterteilt eingekapselt geworden berechnet werden. Diese Rohdaten können entweder von einem automatisierten High-Speed-Video-Algorithmus oder aus einer Stichprobe von Imaging gesammelt Emulsion erhalten werden. Dies kann zu der Fraktion von Teilchen P k<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> AutoCAD </td><td> AutoDesk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Transparenz-Maske </td><td> Fineline Imaging Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Fotolack </td><td> MicroChem </td><td> 2050 </td><td></td></tr><tr><td> Dektak Profilometer </td><td> Veeco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> BD Falcon </td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS-Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Dow Corning Corp </td><td> Sylgard 184, Werkstoff-Nummer (240) 4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumexsikkator </td><td> Jencons </td><td> 250-030 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Alcatel Vacuum Technology </td><td> 2010 C2 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumregler </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-00910-10 </td><td></td></tr><tr><td> Backofen </td><td> Thermo Scientific </td><td> Lindberg Blue M, OV800F </td><td></td></tr><tr><td> Biopsiestanze, 0,75 mm </td><td> Harris </td><td> Uni-Core-15072 </td><td></td></tr><tr><td> Labor Corona Anlage </td><td> Electro-Technic Products Inc. </td><td> BD-20AC, SKU 12051A </td><td></td></tr><tr><td> Glas-Folien </td><td> Gold Seal </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Aquapel </td><td> PPG Industries </td><td></td><td> Alternative Strategie </td></tr><tr><td> Polystyrol-Mikrokügelchen, um 9,9 </td><td> Thermo </td><td> G1000 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Optiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1556 </td><td> Nicht nachgewiesen </td></tr><tr><td> Luer-Lok Spritzen </td><td> BD </td><td> 1 ml: 309628 3 ml: 309585 </td><td></td></tr><tr><td> FC-40 Fluorkohlenstofföl </td><td> 3M Inc. </td><td> Sigma Aldrich, F9755 </td><td></td></tr><tr><td> PFPE-PEG Fluortensid </td><td> RainDance Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leichtes Mineralöl </td><td> PTI Process Chemicals </td><td> 08042-47-5 </td><td> Alternative Strategie </td></tr><tr><td> Mineral-Öl-Tensid </td><td> Evonik Goldschmidt GmbH </td><td> Abil EM 90 </td><td> Alternative Strategie </td></tr><tr><td> Tygon Schlauch aus PVC </td><td> Kleinteile </td><td> TGY-010 </td><td></td></tr><tr><td> 30-Gauge-Luer-Lok Spritzennadel, 1/2 &quot; </td><td> Kleinteile </td><td> NE-301PL-C </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Carl Zeiss Imaging </td><td> Axio Observer.Z1 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Kamera </td><td> Vision Research </td><td> Phantom V310 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpen (2) </td><td> Chemyx Inc. </td><td> Nexus 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Silikonöl </td><td> Dow Corning </td><td> 200 Fluid, 10 cSt </td><td> Optional für Storage-Emulsion </td></tr></tbody></table>

high-throughput-einzel-zell-und multiple-zelle mikroverkapselung

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Mikrofluidische Einschließungsmethoden wurden bereits früher genutzt, um Zellen in wässrigen, monodispersen Tröpfchen im Pikoliterbereich einzukapseln, wodurch eine Isolation von der Gesamtflüssigkeitsumgebung erreicht wird, was Anwendungen in der Hochdurchsatz-Screening, Zytometrie und Massenspektrometrie ermöglicht. Wir beschreiben eine Methode, die nicht nur die Einschließung einzelner Zellen ermöglicht, sondern auch die wiederholte Erfassung einer definierten Anzahl von Zellen (hier demonstrieren wir die Einschließung von einer und zwei Zellen), um sowohl die Isolation als auch die Wechselwirkungen zwischen Zellen in Gruppen kontrollierter Größe zu untersuchen. Durch die Kombination von Tröpfchengenerierungstechniken mit der Ordnung von Zellen und Partikeln zeigen wir eine gezielte Einschließung zellgroßer Partikel für eine effiziente, kontinuierliche Kapselung. Unter Verwendung einer wässrigen Partikelsuspension und einer nicht mischbaren Fluorkohlenstoff-Ölphase erzeugen wir wässrige Tröpfchen in Öl mittels einer Strömungsfokussierdüse. Die wässrige Durchflussrate ist ausreichend hoch, um eine Ordnung der Partikel zu erzeugen, die die Düse mit ganzzahligen Vielfachen der Tröpfchengenerierungsfrequenz erreichen, wodurch eine kontrollierte Anzahl von Zellen in jedem Tröpfchen eingeschlossen wird. Als repräsentative Ergebnisse werden 9,9-μm-Polystyrol-Partikel als Zellmodelle verwendet. Diese Studie zeigt eine Einschließungseffizienz für einzelne Partikel Pk=1 von 83,7 % und eine Doppel-Partikel-Einschließungseffizienz Pk=2 von 79,5 % im Vergleich zu den jeweiligen Poisson-Effizienzen von 39,3 % bzw. 33,3 %. Die Bedeutung einer konstanten Zell- und Partikelkonzentration wird als entscheidend für eine effiziente Einschließung herausgestellt, und Übergänge vom Tropfen- zum Strahlmodus (dripping to jetting) werden ebenfalls behandelt.
Einleitung
Kontinuierliche wässrige Zellsuspensionen in Medium teilen sich eine gemeinsame Flüssigumgebung, die parallele Zellinteraktionen ermöglicht und zudem die Effekte einzelner Zellen in Messungen des Mediums homogenisiert. Die Hochdurchsatz-Einschließung von Zellen in Tropfen im Pikoliter-Maßstab begrenzt die Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, ermöglicht die Erfassung zellulärer Diversität innerhalb der Proben, verhindert die Verdünnung von Reagenzien und exprimierten Biomarkern und verstärkt Signale aus Bioreaktor-Produkten. Die Tropfen erlauben außerdem, sie anschließend wieder zu größeren wässrigen Proben oder mit anderen Tropfen zusammenzuführen, um interzelluläre Signalübertragungsprozesse zu untersuchen.1,2 Die verminderte Verdünnung bedeutet stärkere Nachweissignale für genauere Messungen sowie die Möglichkeit, potenziell kostspielige Probenvolumina und Reagenzienmengen zu reduzieren.3 Die Einschließung von Zellen in Tropfen wurde bereits genutzt, um den Nachweis von Proteinausprägung,4 Antikörpern,5,6 Enzymen,7 und metabolischer Aktivität8 für Hochdurchsatz-Screenings zu verbessern, und könnte ebenfalls zur Verbesserung der Hochdurchsatz-Zytometrie eingesetzt werden.9 Weitere Studien zeigen Anwendungen im Bereich des Bio-Elektrosprayens von zellhaltigen Tropfen für die Massenspektrometrie10 und der gezielten Beschichtung von Oberflächen mit Zellen.11 Einige Anwendungen waren jedoch durch die fehlende Möglichkeit eingeschränkt, die Anzahl der in Tropfen eingeschlossenen Zellen gezielt zu steuern. Hier stellen wir eine Methode der geordneten Einschließung12 vor, die die nachgewiesenen Einschließungseffizienzen für eine und zwei Zellen erhöht und möglicherweise auf die Einschließung einer größeren Anzahl von Zellen übertragen werden kann.
Um eine monodisperse Tropfenbildung zu erreichen, ermöglicht die mikrofluidische „Flussfokussierung“ die Erzeugung von Tropfen kontrollierbarer Größe einer Flüssigkeit (einer wässrigen Zellmischung) in einer anderen (einer kontinuierlichen Ölphase) mithilfe einer Düse, an der sich die Ströme vereinigen.13 Bei einer gegebenen Düsengeometrie können die Tropfenbildungsrate f und die Tropfengröße durch Anpassung der Öl- und wässrigen Durchflussraten Qoil und Qaq verändert werden. Wenn die Durchflussraten steigen, kann der Übergang von der Tropfenbildung zur instabilen Ausbildung eines wässrigen Strahls (Jetting) an der Düse erfolgen.14
Wenn die wässrige Lösung suspendierte Partikel enthält, werden die Partikel an der Düse eingeschlossen und voneinander isoliert. Für die Tropfenbildung unter Verwendung einer zufällig verteilten wässrigen Zellsuspension beträgt der durchschnittliche Anteil an Tropfen Dk enthaltend k Zellen wird durch die Poisson-Statistik bestimmt, wobei Dk = λk exp(-λ)/(k!) und λ ist die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Tropfen. Der Bruchteil von Zellen die in den „korrekt“ verkapselten Tropfen enden, wird berechnet mithilfe von Pk = (k × Dk)/Σ(k' × Dk'). Der subtile Unterschied zwischen den beiden Metriken besteht darin, dass Dk bezieht sich auf die Nutzung von wässrigem Fluid und die Menge an Tropfen-Sortierung, die nach der Einschließung durchgeführt werden muss, und Pk bezieht sich auf die Nutzung der Zellprobe. Beispielsweise könnte man eine verdünnte Zellsuspension (niedriges λ) verwenden, um Tropfen zu kapseln, wobei die meisten Tropfen, die Zellen enthalten, jeweils nur eine einzige Zelle enthalten würden. Während die Effizienzmetrik Pk wäre hoch, der Großteil der Tropfen wäre leer (niedrig Dk), wodurch ein Sortiermechanismus zur Entfernung leerer Tropfen erforderlich ist, was ebenfalls die Durchsatzrate verringert.15
Die Kombination von Tropfenerzeugung mit trägheitsbedingter Ordnung ermöglicht die Einschließung von Tropfen mit vorhersagbarerer Anzahl an Zellen pro Tropfen und höheren Durchsätzen im Vergleich zur zufälligen Einschließung. Die trägeheitsbedingte Fokussierung wurde erstmals von Segre und Silberberg16 entdeckt und beschreibt die Tendenz von Partikeln endlicher Größe, sich in Strömungskanälen in laterale Gleichgewichtspositionen einzustellen. Trägeheitsordnung bezeichnet die Neigung von Partikeln und Zellen, sich passiv in gleichmäßig beabstandete, versetzte Züge mit konstanter Geschwindigkeit anzuordnen. Sowohl Fokussierung als auch Ordnung erfordern ausreichend hohe Strömungsgeschwindigkeiten (hohe Reynolds-Zahl) und Partikelgrößen (hohe Partikel-Reynolds-Zahl).17,18 Hier gilt: Reynolds-Zahl Re =uDh/ν und Partikel-Reynolds-Zahl Rep =Re(a/Dh)2, wobei u eine charakteristische Strömungsgeschwindigkeit, Dh [=2wh/(w+h)] der hydraulische Durchmesser, ν die kinematische Viskosität, a der Partikeldurchmesser, w die Kanalbreite und h die Kanalhöhe ist. Empirisch nimmt die Länge, die zur Erzeugung vollständig geordneter Züge erforderlich ist, mit steigendem Re und Rep ab. Beachten Sie, dass die hohen Anforderungen an Re und Rep (in dieser Studie in der Größenordnung von 5 bzw. 0,5) mit der Notwendigkeit kollidieren können, die wässrigen Durchflussraten niedrig zu halten, um ein Ausströmen in Form eines Strahls („jetting“) an der Tropfenerzeugungsdüse zu vermeiden. Zudem führen hohe Durchflussraten zu höheren Scherspannungen auf die Zellen, die in diesem Protokoll nicht berücksichtigt werden. In der vorherigen Studie zur geordneten Einschließung wurde gezeigt, dass über 90 % der einzeln eingeschlossenen HL60-Zellen unter ähnlichen Strömungsbedingungen wie in dieser Studie die Integrität ihrer Zellmembran beibehielten.12 Der Einfluss der Größenordnung und der zeitlichen Skalen der Scherspannungen muss jedoch sorgfältig bewertet werden, wenn die Ergebnisse auf andere Zelltypen und Strömungsparameter übertragen werden sollen. Die Überschneidung der Anforderungen an die Zellordnung, Tropfenerzeugung und die lebensfähige wässrige Durchflussrate ergibt einen idealen Betriebsbereich für die kontrollierte Einschließung einzelner und mehrerer Zellen.
Da nur sehr wenige Studien den Abstand zwischen Partikelzügen untersuchen,19,20 lässt sich dieser am einfachsten empirisch bestimmen, wobei er von der Kanalgeometrie, der Durchflussrate, der Partikelgröße und der Partikelkonzentration abhängt. Dennoch bedeutet der gleichmäßige seitliche Abstand zwischen den Zügen, dass die Zellen in vorhersagbaren, konstanten Zeitabständen eintreffen. Wenn die Tropfenbildung mit derselben Rate erfolgt, mit der geordnete Zellen an der Düse eintreffen, werden die Zellen kontrolliert in die Tropfen eingeschlossen. Diese Technik wurde bereits verwendet, um Einzelzellen mit Durchsätzen im Bereich von 15 kHz einzuschließen,12 eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Studien, die Einschlussraten im Bereich von 60–160 Hz berichteten.4,15 Bei der kontrollierten Einschließung enthielten über 80 % der Tropfen genau eine einzige Zelle, was eine erhebliche Effizienzsteigerung gegenüber der Poisson- (zufälligen) Statistik darstellt, die im Durchschnitt eine Effizienz von weniger als 40 % vorhersagt.12
In früheren Arbeiten zur kontrollierten Verkapselung12 wurde die durchschnittliche Anzahl an Partikeln pro Tropfen λ so eingestellt, dass die Einzelzell-Verkapselung erreicht wurde. Wir vermuten, dass durch die gezielte Anpassung der Strömungsgeschwindigkeiten eine effiziente Verkapselung beliebiger Zellzahlen pro Tropfen erreicht werden kann, wenn λ gleich oder nahe der gewünschten Anzahl an Zellen pro Tropfen ist. Während die Einzelzell-Verkapselung wertvolle Informationen über individuelle Zellreaktionen auf Reize liefert, ermöglicht die Mehrfachzell-Verkapselung Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen definierten Zellzahlen und Zelltypen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von Polystyrol-Mikrokugeln sowie eine Diskussion zur kontrollierten Verkapselung mehrerer Zellen mittels eines passiven, trägheitsbasierten Ordnungskanals und einer Tropfen erzeugenden Düse.

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

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high-throughput-single-cell-and-multiple-cell-micro-encapsulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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