High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Anwendungen, bei denen Zellen in kleinen Pikoliter-Größen verkapselt sind, wurden oft durch die Unfähigkeit eingeschränkt, die Anzahl der Zellen pro Tropfen zu kontrollieren. Dieses Protokoll demonstriert eine Methode zur Steuerung der Zellverkapselung durch die Kombination von zwei unterschiedlichen mikrofluidischen Phänomenen, der fluiddynamischen Zellordnung und der Tropfenerzeugung an einer strömungsfokussierenden Mikrodüse. In einem stromaufwärts gelegenen Kanal wird eine ausreichend hohe Durchflussmenge von wässriger Lösung mit suspendierten Zellen oder Partikeln bereitgestellt, um die Bildung von Zügen mit gleichem Abstand in Strömungsrichtung stromabwärts zu bewirken.

Eine strömungsfokussierende Tropfenerzeugungsdüse wird verwendet, um wässrige Tropfen mit Kilohertz-Raten in einer tensidstabilisierten zulässigen Ölträgerflüssigkeit zu bilden. Die geordneten Zellpartikelzüge werden dann mit der Tropfenerzeugung kombiniert, indem die wässrigen und Ölflussraten abgestimmt werden, um Tropfenerzeugungsraten bereitzustellen, die mit der Ankunft von längs angeordneten Zellen oder Partikeln an der Tropfenerzeugungsdüse synchronisiert sind, während Partikel als Zellsurrogate verwendet werden. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, müssen die Durchflussraten ausreichend klein sein, um die Flüssigkeit zu begrenzen.

Die schiere Belastung biologischer Zellen, die Überlappung der Zellordnung, der Tropfenerzeugung und der Lebensfähigkeit der Zelle. Die Begrenzung der wässrigen Durchflussrate bietet ein ideales Betriebsregime für die kontrollierte Verkapselung von Einzel- und Mehrfachzellen. Die Analyse von Videomikroskopiedaten zeigt, dass sowohl die Effizienz der Einzel- als auch der Doppelzell- oder Partikelverkapselung die Effizienz der zufälligen Verkapselung übertrifft und die Anzahl der Tropfen, die nicht die gewünschte Anzahl von Zellen oder Partikeln enthalten, erheblich reduziert.

Der Einschluss von Zellen und Tropfen begrenzt die Verdünnung von Zellsekreten, hebt die Zellheterogenität hervor und kontrolliert auch interzelluläre Signale im Vergleich zu einer Massensuspension. Effiziente Mittel, um diese Zellen in Tropfen einzukapseln, bieten biologischen Forschern ein wertvolles Werkzeug, um dieses Verfahren zu beginnen. Entwerfen Sie ein Mikrokanalmuster, wie in dieser Abbildung in der AutoCAD-Software gezeigt.

Der lange Kanalabschnitt stellt den wässrigen Strömungsordnungskanal mit einer Breite von 27 Mikrometern dar. Das vergrößerte Düsenschema zeigt gleiche Kanalbreiten von 27 Mikrometern für den wässrigen Bestellkanal und den Ölkanal, gefolgt von der Düsenkontraktion von 22 Mikrometern und der plötzlichen Ausdehnung auf einen breiteren 61-Mikron-Kanal. Die Gerätehöhe beträgt 52 Mikrometer.

Sowohl wässrige als auch Öleinlässe weisen große Schmutzfilter mit Lücken in der Größenordnung der Bestellkanalbreite auf, wie in diesem vergrößerten Schema des Öleinlasses dargestellt. Gezeigt. Hier ist ein echtes Bild des Bestellkanals und der Düse, die mit Farbstoff injiziert wurden. Beauftragen Sie einen Drittanbieter, um eine hochauflösende Transparenzmaske auf Mylar-Folie oder Quarz zu drucken, bei der die Kanäle auf dunklem Hintergrund transparent sind.

Erstellen Sie anschließend einen Silikon- und SU Eight-Fotolackmaster für das Nachformen. Kleben Sie die Urform auf den Boden einer Petrischale, um sie für die PDMS-Nachbildung zu formen. Nachdem das Abformen der Replik abgeschlossen ist und der Geräteumriss ausgeschnitten wurde, verwenden Sie einen Biopsiestanzer mit einem Außendurchmesser von 0,75 Millimetern, um fluidische Ports in den drei in dieser Abbildung gezeigten runden Bereichen zu stanzen, ein liebes Tesafilm auf die Musterseite des PDMS und ziehen Sie es ab, um jeglichen Staub nach dem Plasmakleben zu entfernen.

Das PDMS zu einem sauberen Glasobjektträger. Stellen Sie das gesamte Gerät in einen Ofen und heizen Sie den Ofen allmählich auf 120 Grad Celsius auf. Lassen Sie das Gerät über Nacht im 120 Grad Celsius heißen Ofen, um die Verklebung abzuschließen und das PDMS wieder in seinen ursprünglichen hydrophoben Zustand zu versetzen.

Ein alternatives Verfahren, um die Glasoberfläche des Kanals hydrophob zu machen, besteht darin, eine Beschichtung wie Aquae in die fluidischen Kanäle zu injizieren und dann mit Luft zu spülen. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer Spritzennadel ziehen Sie mehrere hundert Mikroliter Luft ein, gefolgt von einer winzigen Menge Aquil, die ausreicht, um nur die Metallspritzenspitze vorsichtig zu füllen, aber injizieren Sie das Aqua und anschließend die Spülluft fest in die Fluidiköffnungen. Ohne das PDMS zu brechen, um aggressiv zu verkleben.

Wiederholen Sie die Luftspülung an allen Einlass- und Auslassöffnungen, während Sie überschüssiges Aqua abwischen, um Ablagerungen zu vermeiden, die die Kanäle nach dem Trocknen verstopfen könnten. Die Kontrolle der Zellkonzentration ist wichtig, um die richtige Anzahl von Zellen mit der richtigen Anzahl von Tropfen zu erreichen. Dies besteht aus zwei herausfordernden Komponenten.

Die erste besteht darin, die richtige Konzentration im Voraus zu schätzen, und die zweite besteht darin, diese Konzentration während des Experiments aufrechtzuerhalten. Für das spezielle Gerät, das in dieser Studie verwendet wurde, sollten acht bis 15 Mikrometer Zellen oder Partikel für eine kontrollierte Verkapselung angemessen angeordnet sein. In dieser Demonstration werden 9,9-Mikrometer-Polys-Tagebuch-Mikrosphären als Zellsurrogate verwendet, um die Konzentration der wässrigen Partikelsuspension vorzubereiten, um eine ideale Audit-Verkapselung zu erreichen, beginnend mit einer Mikrosphären-Stammkonzentration von 1 % Feststoffe nach Gewicht unter Verwendung früherer Daten für die vollständige Reihenfolge. Erhöhen Sie als Richtwert die Konzentration auf 1,5 % Feststoff, indem Sie einen Milliliter der Stammprobe vorsichtig zentriffusionieren, 250 Mikroliter Supinatflüssigkeit entfernen und die Partikel durch Wirbelmischen oder sanfteres Mischen mit Resus suspendieren.

Bei der Verwendung von Zellen haben sowohl Zellen als auch Polystyrolpartikel ein spezifisches Gewicht von mehr als eins, obwohl dies in diesem Video nicht zu sehen ist. Bei Langzeitexperimenten, die in der Größenordnung von vielen Minuten bis Stunden dauern, kann die Lösung durch Zugabe eines gelösten Stoffes wie Calciumchlorid für Partikel oder Opti-Vorbereitung für Zellen mit Auftrieb angepasst werden. Nachdem die Zell- oder Partikelsuspension fertig ist, bereiten Sie eine 10-Milliliter-Probe der kontinuierlichen Fluorkohlenstoffölphase in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchenwirbel vor.

Mischen Sie das Tensid und das Fluorkohlenwasserstofföl auf ein Gewicht von ca. 2,5 %. Hier erhalten wir ein Gemisch von 2,4 Gewichtsgewichten, das für den Aufbau des Mikroverkapselungsexperiments akzeptabel ist. Schalten Sie zunächst das inverse optische Mikroskop und die Hochgeschwindigkeitskamera ein.

Konzentrieren Sie sich auf die Mikrokanalschicht und untersuchen Sie die Kanäle auf Verstopfungen und Ablagerungen, die sich lösen könnten. Wählen Sie einen Kanal, der frei von großen Ablagerungen oder offensichtlichen Verstopfungen ist. Schneiden Sie drei Längen durchscheinende Tigon-PVC-Schläuche für den wässrigen Öleinlass und den Emulsionsauslass ab, um das Totvolumen zu minimieren.

Schneiden Sie gerade so viel Schlauch ab, dass er von den Spritzenpumpen zum Mikroskop reicht. Schneiden Sie die Schlauchenden in einem Winkel von 45 Grad ab Um das Einführen in die Fluidikanschlüsse zu erleichtern, verwenden Sie eine Pinzette, um die Schlauchenden in die Fluidikanschlüsse zu drücken. Drücken Sie dann eine 30-Gauge-Spritzennadel aus Edelstahl mit stumpfer Spitze in das freie Ende des wässrigen Einlassrohrs.

Wiederholen Sie den Vorgang für das Öleinlassrohr. Bewegen Sie das Gerät und befestigen Sie den Schlauch mit einem 20-fachen Objektiv am Mikroskoptisch, richten Sie es aus und fokussieren Sie es auf die Gerätedüse. Stellen Sie das Mikroskop manuell auf die Kohler-Beleuchtung ein, um eine optimale Ausleuchtung in der Brennebene zu erzielen.

Mit der Hochgeschwindigkeitskamera-Software können Sie das Sichtfeld um die Düse herum zuschneiden, um höhere Bildraten zu ermöglichen, und dann die Bildrate, die Belichtungszeit und andere Kameraeinstellungen nach Bedarf für eine optimale Aufnahme einstellen. Füllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit der zuvor vorbereiteten, gut gemischten wässrigen Phasenlösung. Füllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit der Ölphasenlösung.

Kippen Sie eine der gefüllten Spritzen vertikal und bewegen Sie die Luftblasen zum Spritzenauslass. Drücken Sie den Kolben langsam genug lange hin, um die Luft zur Spritzenspitze zu drücken und die Spritze senkrecht zu halten. Verbinden Sie die Spritze mit der jeweiligen Spritzennadel, die bereits am Gerät befestigt ist.

Drücken Sie den Kolben, um das Totvolumen der Luft durch die Spritzennadel zu drücken, bis die Flüssigkeit durch den Schlauch fast zum Gerät gedrückt wird, befestigen Sie die Spritze sicher an einer Spritzenpumpe und rasten Sie in den Kolbenblock ein. Wiederholen Sie die Anschlüsse für die zweite Spritze und montieren Sie sie an einer zweiten Spritzenpumpe, versorgen Sie jede Spritzenpumpe mit Strom und programmieren Sie jede Pumpe. Stellen Sie die anfänglichen Durchflussraten gemäß den Protokollen des Herstellers auf 50 Mikroliter pro Minute für die Ölphase und fünf Mikroliter pro Minute ein.

Für den Start der wässrigen Phase warten die Pumpen, bis jede Flüssigkeit in das Gerät gelangt ist, und füllen die Kanäle, indem sie die verbleibende Totluft herausdrücken. Dies kann bei Verwendung der anfänglichen Durchflussraten mehrere Minuten dauern. Beobachten Sie die Tropfenbildung an der Düse.

Erhöhen Sie langsam die wässrige Durchflussrate, um die Reihenfolge der Partikel im langen wässrigen Lösungskanal zu beobachten. Da die Erhöhung der Durchflussrate die Durchflussrate nicht bis zu dem Punkt erhöht, an dem das Strahlen des wässrigen Fluidstroms an der Düse ausgelöst wird, wie in diesem Beispiel gezeigt, unter Verwendung einer anderen Tropfenerzeugungsdüsenanmerkung, ist die instationäre Strömung und der inkonsistente Tropfen hier. Wenn die Partikelkonzentration zu niedrig ist, um alternierende Züge mit relativ wenigen fehlenden Partikeln zu erzeugen, und die Probe nicht an den Auftrieb angepasst war, kippen Sie die Spritzenpumpe physikalisch in Richtung des Spritzenauslasses, um ein allmähliches Absetzen der Partikel in Richtung der Spritzenauslässe zu gewährleisten.

Sobald eine angemessene Reihenfolge erreicht ist, passen Sie die Öldurchflussrate an, um die Erzeugungshäufigkeit und die Größe der Tropfen abzustimmen. Passen Sie beide Durchflussraten iterativ an, um die gewünschten Verkapselungsraten und Tropfenvolumina zu erreichen. Sobald die stabile geordnete Verkapselung bestätigt ist, verlegen Sie den Auslassschlauch aus dem Abfallbehälter in einen Auffangbehälter für die zukünftige Verwendung.

Eine Einzel- und Doppelpartikel- oder Zellverkapselung kann mit hohem Wirkungsgrad erreicht werden. Die Verwendung dieses hier gezeigten Protokolls ist ein repräsentatives Ergebnis der Einzelpartikelverkapselung mit einer Öldurchflussrate von 60 Mikrolitern pro Minute und einer wässrigen Durchflussrate von neun Mikrolitern pro Minute. Lambda, die durchschnittliche Anzahl der Partikel für den Tropfen beträgt 0,95.

Der Partikelabstand in Strömungsrichtung beträgt etwa 17 bis 18 Mikrometer für vollständig geordnete alternierende Partikel. Die Tropfenerzeugungsrate in diesem Beispiel beträgt 6,1 Kilohertz bei einer durchschnittlichen Tropfengröße von 24,4 Pikolitern. Das Histogramm vergleicht die Partikeleffizienz der Tropfenverkapselung in der Größenordnung der Einzelpartikelverkapselung mit Plus.

In der Statistik beträgt die zufällige Verkapselung für eine Stichprobengröße von 517 Tropfen den durchschnittlichen Anteil der Tropfen, die ein Partikel enthalten, 79,5 % im Gegensatz zu einem vorhergesagten zufälligen Verkapselungsanteil von 36,7 %Der Anteil der Partikel, die in den korrekt verkapselten Tropfen landen, betrug 83,7 % bei einer Probengröße von 491 Partikeln. Während der zufällige Verkapselungsanteil 37,3 % betrug, wird die doppelte Partikelverkapselung einfach durch Reduzierung der Öldurchflussrate auf 30 Mikroliter pro Minute erreicht, während die wässrige Durchflussrate bei neun Mikrolitern pro Minute gehalten wird. Hier liegt die durchschnittliche Anzahl der Partikel pro Tropfen bei 1,8. Ähnlich wie bei der Einzelpartikelverkapselung.

Der Partikelabstand in Strömungsrichtung beträgt etwa 17 bis 18 Mikrometer für vollständig geordnete alternierende Partikel. Die größeren Tropfen haben eine durchschnittliche Tropfengröße von 39,8 Pikolitern und haben sich mit einer Rate von 3,8 Kilohertz im Vergleich zur zufälligen Verkapselung gebildet. Bei einer Stichprobengröße von 383 Tropfen beträgt der durchschnittliche Anteil der geordneten Verkapselungstropfen, die zwei Partikel enthalten, 71,5 %, im Gegensatz zu einem vorhergesagten zufälligen Verkapselungsanteil von 26,8 %Der Anteil der Partikel, die sich in den korrekt verkapselten Tropfen befanden, betrug bei einer Probengröße von 689 Partikeln 79,5 %, während der zufällige Verkapselungsanteil 33,4 % betrug.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl die Wirkungsgrade der Einzel- als auch der Doppelpartikelverkapselung die Wirkungsgrade der zufälligen Verkapselung um mehr als den Faktor zwei übertreffen und die Anzahl der Tropfen, die nicht die gewünschte Anzahl von Zellen oder Partikeln enthalten, stark reduzieren. Die Bedeutung der richtigen Partikel- oder Zellkonzentrationen für eine hohe Verkapselungseffizienz wird in diesem Versuchslauf veranschaulicht. Während die Öl- und wässrigen Durchflussraten die gleichen sind wie beim zuvor gezeigten Doppelpartikelverkapselungslauf, wird die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Tropfen Lambda auf 1,57 reduziert.

Folglich kommt es nicht zu einer vollständigen Ordnung, und so entstehen Löcher in den Zügen, die Sonnentropfen mit weniger Partikeln als erwartet hinterlassen. Dieses Histogramm zeigt den verringerten Wirkungsgrad für die Zwei-Partikel-Verkapselung aufgrund des niedrigeren Lambda-Wertes. Bei einer Stichprobengröße von 324 Tropfen betrug der durchschnittliche Anteil der Tropfen mit zwei Partikeln 55,9 %, wobei fast so viele Einzelpartikeltropfen wie Doppelpartikeltropfen verwendet wurden.

Dies bedeutet, dass Lambda gleich oder nahe der Anzahl der gewünschten Zellen pro Tropfen sein sollte, um korrekt verkapselte Partikel oder Zellen mit dem genau gewählten Lambda-Wert zu maximieren, je nachdem, ob weniger oder mehr Zellen pro Tropfen tolerierbar sind. In dieser Demonstration nutzen wir Auftriebsdiskrepanzen, um eine Echtzeitkontrolle der Konzentration während des Experiments zu ermöglichen. Bei längerfristigen Experimenten kann es jedoch ratsam sein, den Auftrieb anzupassen, um nach der Verkapselung der Zellen in wässrige Tropfen konsistentere Ergebnisse zu erzielen.

Zeitabhängige Experimente können in einem Zentrifugenröhrchen oder unter einem Mikroskop durchgeführt werden, indem die Tropfen wieder in mikrofluidische Arrays injiziert werden.