Säugetierzellverkapselung in Alginatperlen unter Verwendung eines einfachen gerafften Gefäßes

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Immobilisierung von Säugetierzellen, wie z. B. Pankreasinseln in Alginatkügelchen mit einem einfachen gerührten Gefäß. Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, Alginattröpfchen durch Wasser- und Ölemulsion zu erzeugen, gefolgt von einer internen Gelierung der Alginattröpfchen. Der erste Schritt des Verfahrens besteht in der Herstellung einer Emulsion, bei der eine wässrige Phase, die Alginatzellen und Kalziumkarbonat enthält, in einer organischen Mineralölphase dispergiert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die Emulsion durch Zugabe einer öllöslichen Säure, wie z. B. Essigsäure, anzusäuern, die sich schnell in die wässrige Phase aufteilt. Der pH-Abfall führt zur Auflösung des Kalziumkarbonats und zur internen Gelierung der Alginattröpfchen zu Kügelchen. Der letzte Schritt besteht darin, die Kügelchen aus der Emulsion durch Zugabe einer wässrigen Lösung zurückzugewinnen, die Phasen durch Zentrifugation zu trennen und anschließend die Kügelchen zu waschen und zu filtrieren.

Die immobilisierten Zellen können dann in vitro kultiviert oder für eine Transplantation verwendet werden. Die von uns beschriebene Methode ist eine Alternative zur Verwendung von düsenbasierten Zellverkapselungen zur Erzeugung von Alginatkügelchen. Dies wurde von einer Methode zur Immobilisierung von Enzymen und mikrobiellen Zellen abgeleitet, über die Poncelet und andere erstmals 1992 berichteten.

Die Anwendung, die uns am meisten interessiert, ist die Alginatverkapselung als Mittel zur Immunisolierung transplantierter Zellen, um den Bedarf an Medikamenten gegen Abstoßungsreaktionen zu verringern oder sogar zu eliminieren. Die Hauptvorteile des emulsionsbasierten Verfahrens gegenüber düsenbasierten Bauelementen sind seine Skalierbarkeit und seine Robustheit. Da die Tröpfchen fast gleichzeitig erzeugt werden, können in sehr kurzer Zeit sehr große Mengen an Kügelchen hergestellt werden, entweder aus sehr verdünnten oder sehr konzentrierten Alginatlösungen.

Darüber hinaus ist der Prozess sehr robust und nicht störanfällig, selbst wenn Partikel vorhanden sind, die die Düsen verstopfen könnten, und schließlich ist die Prozessausrüstung ziemlich einfach und daher für die meisten Labore zugänglich, sehr relativ kostengünstig. Die wichtigsten Verarbeitungsschritte sind die Emulgierung, um die Alginattröpfchen zu bilden, und die Ansäuerung, um die interne Kalziumquelle freizusetzen. Die Tröpfchengröße wird hauptsächlich durch die Laufradkonstruktion, die Rührgeschwindigkeit und die Rührdauer beeinflusst.

Die mechanischen Eigenschaften der Kügelchen und das Überleben der Zellen werden durch das Ausmaß und die Dauer der Versauerung beeinflusst. In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der Zellen für die Transplantation in 5%-Alginatkügelchen eingekapselt werden. Diese Parameter müssten wahrscheinlich für andere potenzielle Anwendungen optimiert werden.

Zur Herstellung von 5%-Alginatkügelchen, die eine Halb- und Halbmischung aus LVM- und MVG-Alginaten enthalten, werden 583 Milligramm LVM- und 583 Milligramm MVG-Alginsäurepulver abgewogen. 20 Milliliter Prozesspuffer auf eine magnetische Rührplatte geben. Für Transplantationsanwendungen verwenden wir einen 10 millimolaren HEPES-Puffer, der 170 millimolares Natriumchlorid bei einem pH-Wert von 7,4 enthält.

Geben Sie nach und nach das Alginsäurepulver in die Lösung. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei niedriger Geschwindigkeit rühren. Befestigen Sie den Kolben gegebenenfalls an der Rührplatte.

Wenn das Alginat am nächsten Tag unvollständig aufgelöst ist, befestigen Sie das Glas auf einem Rotationsmixer und mischen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius weiter. Sobald das Alginat vollständig aufgelöst ist, sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie 30 Minuten lang autoklavieren. Lassen Sie die Temperatur unter 50 Grad Celsius fallen, bevor Sie den Autoklaven öffnen.

Bereiten Sie die Calciumcarbonat-Suspension vor, indem Sie ein Gramm Calciumcarbonat zu 20 Millilitern Prozesspuffer hinzufügen. Autoklavieren Sie die Calciumcarbonat-Suspension und das Rührgefäß, das für den Emulsionsprozess verwendet wird. Entfernen Sie vor dem Gebrauch alle Spuren von Kondenswasser aus dem Gefäß.

Unmittelbar vor dem Emulsionsprozess 44 Mikroliter Eisessig in 11 Milliliter Mineralöl auflösen, das in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben wird. Ein häufiger Fehler ist die unvollständige Auflösung der Essigsäure, vermeiden Sie das Pipettieren von Mengen unter 10 Mikrolitern und stellen Sie sicher, dass die Säure durch wiederholtes Vortexen vollständig aufgelöst wird. Lassen Sie alle Lösungen Raumtemperatur erreichen, bevor Sie mit der Zellverkapselung fortfahren.

Geben Sie 10 Milliliter Mineralöl in den Spinnerkolben und beginnen Sie mit 250 U/min zu rühren. Werden adhärente Zellen wie Beta-tc3-Zellen verwendet, trypsinisieren die Zellen die Zellen. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe des vollständigen Mediums und Entnahme einer Probe für die Zellzählung.

Bestimmen Sie die Zellkonzentration manuell oder mit einem automatisierten Zellzähler. Zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei 300 g und resuspendieren Sie dann die Zellpalette in vollständigem Medium. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und resuspendieren Sie die Zellen dann in dem entsprechenden Volumen des vollständigen Mediums, um das 10- und 1/2-fache der gewünschten Endkonzentration in den Kügelchen zu erhalten.

Übertragen Sie 9,9 Milliliter Alginatlösung in ein Röhrchen mit flachem Boden, fügen Sie dann 1,1 Milliliter des Zellmaterials und 550 Mikroliter der Calciumcarbonatsuspension hinzu. Mischen Sie das Alginat, das Calciumcarbonat und die Zellsuspension durch leichtes Vortexen. Sofort 10,5 Milliliter dieser Mischung mit einer Spritze in das Rühröl geben.

Erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit und starten Sie dann den Timer. Zur Bestimmung der Rührgeschwindigkeit sollte zunächst eine Normkurve erzeugt werden, die die Raupengröße mit der Rührgeschwindigkeit in Beziehung setzt. Nach 12 Minuten fügen Sie 10 Milliliter des Öls und der Essigsäurelösung hinzu, um die Emulsion anzusäuern, das Kalzium aus dem Karbonat freizusetzen und gelierte Kügelchen zu erhalten.

Warten Sie acht Minuten für diesen internen Gelierungsschritt. Beachten Sie die Farbveränderung der emulgierten Tröpfchen, die den pH-Indikator Phenolrot enthalten. Reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit auf 400 U/min, neutralisieren Sie die Säure durch Zugabe von 40 Millilitern Prozesspuffer gemischt mit 10% Medium, was zu einer Phaseninversion führt.

Stoppen Sie das Rühren eine Minute später und füllen Sie das Gemisch in konische Röhrchen um. Spülen Sie den Spinnkolben mit zusätzlichen 20 Millilitern Medium aus und geben Sie dieses in die Röhrchen. Saugen Sie so viel wässrige Lösung wie möglich an, bevor Sie die Ölphase ansaugen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen drei Minuten lang bei 630 g, um das Absetzen der Beads und die Phasentrennung zu beschleunigen. Entfernen Sie das Öl und den überschüssigen Prozesspuffer, indem Sie mit einer Pasteurpipette aspirieren. Waschen Sie die Kügelchen mindestens einmal mit mittlerer Hitze und einer Zentrifugation von 630 g zwischen den Wäschen.

Filtern Sie die Bead-Suspension auf 40-Mikron-Nylon-Zellsieben und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit von unten im Sieb an. Übertragen Sie die Kügelchen mit einem Spatel in ein bekanntes Volumen des Mediums. Messen Sie das Bead-Volumen und füllen Sie das Medium nach, um die gewünschte Bead-Konzentration zu erhalten.

Eine typische Konzentration beträgt ein Milliliter Kügelchen pro fünf Milliliter Gesamtvolumen. Fassen Sie die Kügelchen ab diesem Zeitpunkt immer mit Pipetten mit großer Bohrung an, um eine Beschädigung der Kügelchen zu vermeiden. Die verkapselten Zellen können nun in T-Flaschen überführt und für In-vitro-Kulturen oder Transplantationen verwendet werden.

Am Ende des Emulsionsprozesses sollten Alginatkügelchen mit immobilisierten Zellen erhalten werden. Nach dem Prozess sollten die Größenverteilung der Kügelchen und das Überleben der Zellen routinemäßig beurteilt werden. Um die Größenverteilung der Kügelchen zu bestimmen, können die Kügelchen mit Toluidinblau gefärbt und anschließend einer Bildanalyse unterzogen werden.

Von diesem Prozess wird eine breite Bead-Größenverteilung erwartet. Um das Überleben der Zellen zu beurteilen, können die Kügelchen mit lebenden Totfärbungen wie Calcein-AM und Ethidium-Homodimer inkubiert werden. Mit dem in diesem Video beschriebenen Verfahren wurde das Überleben der Beta-tc3-Zellen zu 76 % gemessen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Säugetierzellen in Alginatkügelchen mit einem einfachen Rührsystem immobilisiert. Das in diesem Video gezeigte Basisprotokoll sollte geeignet sein, eine Vielzahl von Zelltypen mit einer breiten Palette von Alginattypen und Kalzitrationen zu immobilisieren. Wir empfehlen, bei jeder neuen Charge Alginat oder Öl eine Standardkurve zu erstellen, die die durchschnittliche Bead-Größe mit der Rührgeschwindigkeit in Beziehung setzt.

Der von uns beschriebene Emulgierprozess ist eine vielversprechende Alternative zu düsenbasierten Zellverkapselungen. Es ist eine robuste und einfache Methode, um Säugetierzellen in Alginatkügelchen zu immobilisieren. Da wir und andere auf der ganzen Welt Düsenzelltherapien entwickeln, wird ein solcher Umfang an Methoden für die vielen Tausend Diabetiker erforderlich sein.

Wir haben vielversprechende Ergebnisse aus der Transplantation einer Betazelllinie in 5%-Alginatkügelchen veröffentlicht und untersuchen weiterhin die In-vivo-Leistung dieser verbesserten Barriere gegen Transplantatabstoßung.