Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Beginnen Sie mit einem TIRF-Mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) mit einer abgedeckten Bildgebungskammer, die ein Glasdeckglas mit anhaftenden menschlichen Neuroblastomzellen in einem Puffer enthält.

Diese Zellen exprimieren Fluorophore, die spezifisch für synaptische Vesikelmembranen sind.

Wählen Sie im Epifluoreszenzmodus eine Zelle für die Bildgebung aus.

Im TIRF-Modus richten Sie einen Laser durch das Objektiv auf die Probe, die als Fleck auf der Abdeckung erscheint.

Stellen Sie den Winkel so ein, dass er den kritischen Winkel an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas mit hohem Brechungsindex und der Probe mit niedrigerem Brechungsindex überschreitet, was zu einer Totalreflexion (TIR) führt, die als dünne Linie gesehen wird.

TIR erzeugt eine evaneszente Welle, die Fluorophore an der nächstgelegenen Membran anregt.

Die emittierte Fluoreszenz wird vom Objektiv erfasst und von einer Kamera erfasst.

Feinabstimmung für ein kontrastreiches Bild der Zellmembran in der Nähe des Deckglases.

Optimieren Sie die Aufnahmeeinstellungen, um Photobleaching zu minimieren und die Sampling-Frequenz einzustellen.

Beginnen Sie mit der TIRF-Bildgebung, um fusionierte synaptische Vesikel sichtbar