Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse

Beginnen Sie mit einer Glasbodenschale mit embryonalen kortikalen Neuronen auf einem Totalreflexions-Fluoreszenz- oder TIRF-Mikroskoptisch.

Diese Neuronen exprimieren ein pH-empfindliches grün fluoreszierendes Protein oder einen GFP-markierten Vesikelmarker, der bei neutralem extrazellulärem pH-Wert fluoresziert, aber in sauren Vesikeln nicht fluoreszierend bleibt.

Bei der Vesikelfusion mit der Plasmamembran induziert die Exposition gegenüber dem extrazellulären pH-Wert eine Fluoreszenz, die das Exozytoseereignis markiert.

Wählen Sie das Objektiv aus und stellen Sie den Brechungsindex so ein, dass er dem Neuron entspricht.

Richten Sie den Laserstrahl in einem Winkel auf das Glas, was eine Totalreflexion verursacht und eine evaneszente Welle erzeugt. Diese Welle regt selektiv GFP-Marker in der Nähe der Plasmamembran an.

Stellen Sie die TIRF-Eindringtiefe so ein, dass GFP-Marker über dem evaneszierenden Feld ausgeschlossen werden.

Verwenden Sie zunächst eine Weitfeld-Epifluoreszenzbeleuchtung, um GFP-exprimierende Neuronen zu lokalisieren.

Wechseln Sie dann zur TIRF-Beleuchtung für die membranspezifische Anregung.

Nehmen Sie Zeitrafferbilder auf, um das Vesikelfusionsereignis aufzuzeichnen u