Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse

Beginnen Sie mit einer Glasbodenschale mit embryonalen kortikalen Neuronen auf einem Totalreflexions-Fluoreszenz- oder TIRF-Mikroskoptisch.

Diese Neuronen exprimieren ein pH-empfindliches grün fluoreszierendes Protein oder einen GFP-markierten Vesikelmarker, der bei neutralem extrazellulärem pH-Wert fluoresziert, aber in sauren Vesikeln nicht fluoreszierend bleibt.

Bei der Vesikelfusion mit der Plasmamembran induziert die Exposition gegenüber dem extrazellulären pH-Wert eine Fluoreszenz, die das Exozytoseereignis markiert.

Wählen Sie das Objektiv aus und stellen Sie den Brechungsindex so ein, dass er dem Neuron entspricht.

Richten Sie den Laserstrahl in einem Winkel auf das Glas, was eine Totalreflexion verursacht und eine evaneszente Welle erzeugt. Diese Welle regt selektiv GFP-Marker in der Nähe der Plasmamembran an.

Stellen Sie die TIRF-Eindringtiefe so ein, dass GFP-Marker über dem evaneszierenden Feld ausgeschlossen werden.

Verwenden Sie zunächst eine Weitfeld-Epifluoreszenzbeleuchtung, um GFP-exprimierende Neuronen zu lokalisieren.

Wechseln Sie dann zur TIRF-Beleuchtung für die membranspezifische Anregung.

Nehmen Sie Zeitrafferbilder auf, um das Vesikelfusionsereignis aufzuzeichnen und die Exozytose zu visualisieren.

Nachdem Sie das TIRF-Mikroskop und die Probe eingerichtet und eine neuronale Brennebene gemäß dem Textprotokoll gefunden haben, starten Sie die Lasersoftware und verbinden Sie sich mit der Lasersteuerungssoftware. Stellen Sie die Beleuchtung auf Weitfeld ein und wählen Sie das Objektiv aus. Stellen Sie dann den Brechungsindex der Probe ein und passen Sie die Laserintensität an, indem Sie TTL für den Laser 491 deaktivieren.

Die Optimierung der Bildgebungsparameter ist bei der Bildgebung von bodenintakten exozytären Vesikeln wichtig, um Fokusdrift und Phototoxizität zu vermeiden und gleichzeitig Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen, das für die Analyse ausreicht.

Stellen Sie den Schieberegler auf 100 ein, und verringern Sie ihn dann wieder auf einen Wert zwischen 20 und 40. Überprüfen Sie dann erneut die TTL. Fokussieren Sie anschließend erneut bei Durchlichtbeleuchtung auf die Probe.

Wählen Sie dann in der Bildgebungssoftware die Laserbeleuchtung 491 aus und öffnen Sie den Verschluss. Legen Sie den Kondensor kopfüber auf die optische Bank, um die Linse nicht zu zerkratzen. Stellen Sie den Brennpunkt des Lasers an der Decke fein ein.

Und wenn der Kondensator entfernt ist, zentrieren Sie den Punkt auf die Mitte der Membran mit geschlossenem Feld. Tauschen Sie dann den Kondensator aus. Und stellen Sie in der TIRF-Software die Eindringtiefe auf 110 Nanometer ein. Wechseln Sie dann für die Bildgebung von der Weitfeldbeleuchtung in den TIRF-Beleuchtungsmodus.

Mit Hilfe der Weitfeld-Epifluoreszenz können nun VAMP2-Florin-exprimierende Zellen durch die Augen gefunden werden. Um Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren, passen Sie dann die Bildgebungsparameter an, um das Signal-Rausch-Verhältnis und den Dynamikbereich bei minimaler Belichtungszeit und Laserintensität zu maximieren. Stellen Sie den kontinuierlichen Autofokus pro Zelle ein. Nehmen Sie dann ein Zeitrafferbild auf, das 5 Minuten lang alle 0,5 Sekunden aufgenommen wird.