Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von "peroxidativer" und "Oxidativer 'Hydroxylradikal Footprinting

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, anhand des Hydroxylradikal-Fußabdrucks zu ermitteln, wie sich RNA-Moleküle falten. Dies wird durch Endmarkierung, Gelreinigung und Vorfaltung der RNA erreicht, die die Bestätigung der Integrität der RNA vor der Magnesium-vermittelten Faltung gewährleistet. In einem folgenden Schritt werden die Fenton-Reagenzien gemischt, um Hydroxylradikale zu erzeugen, die anschließend das RNA-Rückgrat entsprechend seiner Lösungsmittelzugänglichkeit spalten können. Anschließend werden die RNA-Spaltungsprodukte durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Die Bandenintegrale werden durch eine halbautomatische Footprinting-Analysesoftware quantifiziert. Das ultimative Ziel ist es, Faltungsisothermen zu erzeugen, die die Tertiärstrukturbildung von RNA widerspiegeln. Dies wird erreicht, indem die normierten Bandintegrale auf die fraktionale Sättigung skaliert werden.

Die Isothermen können anschließend an die Hügelgleichung angepasst werden. Der Hauptvorteil des Hydroxy-Fußabdrucks besteht darin, dass Sie aufgrund der höheren Aktivität in kleinen Chemikalien Tertiärstrukturinformationen der RNA erhalten. Hydroxyradikale sind perfekte Sonden, um zwischen lösungsmittelzugänglichen und verborgenen Nukleotiden zu unterscheiden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Strukturbiologie zu beantworten.

Wie setzen Ribosomen zum Beispiel Metallionen ein, um ihre aktive Bestätigung zu erreichen? Der Fußabdruck von Hydroxyradikalen kann verwendet werden, um die Grundlagen der RNA-Spezifität und -Erkennung zu verstehen. Neben der Aufschluss über die Tertiärstruktur der RNA kann diese Methode auch zur Bestimmung der genauen Proteinbindungsstellen in RNA oder in DNA-Molekülen verwendet werden.

Die größten Herausforderungen dieser Methode bestehen darin, den Abbau der Probe durch Ribonuklease zu verhindern und die Eisenkonzentration zu optimieren, um die richtige Menge an RNA-Spaltung zu erhalten. Auch die Detailanalyse der Bandintervalle kann recht knifflig sein. Der Hauptvorteil dieses Videos besteht darin, dem Publikum zu helfen, die Planungsphasen und die erfolgreiche Durchführung des Hydroxyradikal-Fußabdruck-Experiments zu verstehen. Bereiten Sie vor Beginn dieses Protokolls alle Fußabdrücke in Reagenzien vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Begleitend zu diesem Video kann RNA hergestellt werden DFOs vier verwandt und enden markiert wie dort beschrieben. Aufreinigung der radioaktiv markierten RNA mit denaturierender Gel-Elektropherese. Die gereinigte RNA wird durch zwei aufeinanderfolgende Gelextraktionen mit 0,3 molaren Natriumacetat zurückgewonnen.

Dann fällt man die RNA aus, indem man 0,5 Milliliter der wässrigen Lösung mit einem Milliliter Ethanol mischt. Inkubieren Sie die Mischung eine Minute lang auf Trockeneis Nach dem Schleudern der Probe entsorgen Sie das Supinat. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 70% Ethanol.

Entfernen Sie das Supinat nach zusätzlicher Zentrifugation und trocknen Sie das Pellet im Vakuum. Als nächstes lösen Sie die aufgereinigten P32-markierten RNA-Proben auf. In 330 Mikroliter des einmaligen Reaktionspuffers pipettieren Sie 30 Mikroliter der RNA-Lösung in ein neues Reaktionsröhrchen.

Fältitieren Sie die RNA mit Ethanol und trocknen Sie dann das Pellet in einem Vakuum. Nach dem Trocknen kann dieses Pellet zur Erzeugung der Referenzleiter verwendet werden, wie in dem schriftlichen Verfahren zur Natur beschrieben, die verbleibende gepufferte RNA-Lösung durch Erhitzen bei 95 Grad Celsius für zwei Minuten zu erzeugen. Rufen Sie die Proben 15 Minuten lang auf Raumtemperatur und drehen Sie sie anschließend, um das Kondensat wieder in Lösung zu bringen. Um das Fußabdruck-Experiment zu beginnen, stellen Sie 27 Reaktionsröhrchen für genügend Proben auf, um ein 30-Well-Elektrophoresegel zu füllen.

Nach Einbeziehung der Leitern und der gespaltenen Kontrolle sind die endgültigen Magnesium-Eisen-Konzentrationen so zu bestimmen, dass sie auf einer logarithmischen Skala über mehrere Größenordnungen gleichmäßig um den Titrationsmittelpunkt verteilt sind. Die Vorbereitung der Magnesiumionen in einem Mal Reaktionspuffer wird im Text gesondert beschrieben. Inkubieren Sie die RNA und die Magnesiumionenlösungen fünf Minuten lang bei 50 Grad Celsius. Mischen Sie dann 10 Mikroliter der RNA-Lösung mit 90 Mikrolitern der entsprechenden Menge Magnesium-Eisen-Lösung.

Um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen, inkubieren Sie jede Mischung 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius. Lassen Sie die Lösungen anschließend eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius äquilibrieren, während die RNA-Faltung stattfindet. In der Zwischenzeit ist unmittelbar vor der Initiierung des Hydroxylradikal-Fußabdrucks in Reaktion das Phantomreaktionsgemisch wie im schriftlichen Protokoll beschrieben vorzubereiten.

Bereiten Sie die Peroxidationsreaktion vor, indem Sie jeweils zwei Mikroliter Tröpfchen Eisen, EDTA, Natriumascorbat und Wasserstoffperoxid an der oberen Innenseite des Reaktionsröhrchens mit der RNA-Lösung pipettieren, so dass sich die Tröpfchen nicht berühren. Starten Sie die Fußabdruckreaktion durch kräftiges Mischen. Stoppen Sie die Reaktion nach 15 Sekunden, indem Sie 300 Mikroliter reines kaltes Ethanol hinzufügen.

Drehen Sie die Röhren drei- bis fünfmal. Schließlich fällt, waschen und trocknen Sie das Pellet, wie es zuvor als Alternative zur peroxidativen Reaktion durchgeführt wurde, die oxidative Hydroxylreaktion würde durch Zugabe von fünf Mikrolitern des frisch zubereiteten Fenton-Reaktionsgemisches zu den Proben durchgeführt werden. Inkubieren Sie die oxidative Reaktion 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius.

Fügen Sie dann 300 Mikroliter reines kaltes Ethanol hinzu, um die Reaktion zu löschen, und mischen Sie durch Drehen der Röhrchen. Nochmals, Niederschlag. Waschen und trocknen Sie das Pellet nach Abschluss der oxidativen oder oxidativen Reaktion.

Lösen Sie die getrockneten RNA-Pellets in acht Mikrolitern Gelladefarbe zwei auf. Bestätigen Sie, dass die P32-markierte RNA resuspendiert ist, indem Sie mit einem Geer-Zähler ein denaturierendes 8%Polyacrylamid-Sequenziergel gemäß den Standardprotokollen vorbereiten. Mit einem 30-Well-Kamm werden die Proben, einschließlich zweier Referenzen und einer gespaltenen Kontrolle, geladen.

Trennen Sie die RNA-Fragmente bei 60 bis 75 Watt für zweieinhalb Stunden. Setzen Sie das getrocknete Gel über Nacht einem Phospho-Sieb aus. Scannen Sie den Phospho-Bildschirm mit einem Bildgebungssystem für die filmlose Autoradiographie.

Übertragen Sie dann die Gelbilddatei zur Analyse auf den Computer. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie Safa und Open-Source-Software für die Anpassung und Quantifizierung von Einzelbanden. Laden Sie die RNA-Sequenz als Punkt-TXT-Datei, gefolgt von dem Gelbild als Punkt-Gel-Datei.

Definieren Sie die Lanes und passen Sie die Bandintensitäten an. Wählen Sie dann eine Ankerbahn und führen Sie eine Gelausrichtungszuordnung von Banden zu Nukleotiden in Bezug auf die RNAs T eine Verdauungsleiter durch. Quantifizieren Sie die Bandenintensitäten und verwenden Sie die Funktion "Normalization Slash Color Plot", um potenziell invariante Reste zu normalisieren und zuzuweisen.

Speichern Sie die Ausgabe als txt-Datei. SFA gibt eine Tabelle mit Spalten aus, die die Lanes auf dem Gel darstellen, und Zeilen, die die einzelnen Bandenintegrale darstellen, die dem RNA-Fragment entsprechen. Zunächst müssen die Schutzstellen, die eine merkliche Veränderung der Zugänglichkeit des Lösungsmittels aufweisen, identifiziert werden, indem das Schutzprofil, das aus der Probe ohne Magnesiumionen abgeleitet wurde, mit dem Profil der Endpunkt-Magnesiumionenkonzentration verglichen wird.

Je niedriger der Wert, desto besser ist das Nukleotid gegen den Angriff der Hydroxylradikale geschützt und umgekehrt. Als nächstes erstellen Sie Übergangskurven der Bande, der Intensitäten einzelner oder Gruppen von Nukleotiden im Vergleich zur Magnesiumeisenkonzentration unter Verwendung eines Tabellenkalkulationsformats und skalieren Sie diese Übergänge individuell auf die fraktionale Sättigungsfunktion, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben. Passen Sie die Daten als letzten Schritt an die Hügelgleichung an.

Diese Analyse skaliert den Übergang zur fraktionalen Sättigung, bestimmt den Übergangsmittelpunkt und liefert einen phänomenologischen Test, ob ein Übergang sigmoidal dargestellt wird. Hier sind repräsentative Ergebnisse von P vier P sechs RRNA Hydroxyl Radical Footprint Experimenten. Die Isothermen wurden aus Sequenziergelen abgeleitet, die von Safa analysiert wurden, und passten dann wie im Analyseabschnitt beschrieben an.

Das Gelbild zeigt, dass die Hintergrundspaltung minimal ist und dass eine Einzelnukleotidzuordnung aufgrund gut definierter Banden in der ersten T-Spur möglich ist. Die durch Hydroxylradikale induzierte Fragmentierung der RNA liegt deutlich über dem Hintergrund. Der Übergang von niedrigen zu hohen Magnesiumionen ist selektiv mit abnehmender Intensität einzelner und Gruppen von Banden verbunden, was auf die Bildung von RNA hinweist.

Der Schutz der Tertiärstruktur bezieht sich auf einzelne oder Gruppen zusammenhängender Nukleotide, deren Spaltungsänderungen gleichzeitig mit Bandenintensitäten durch Safferanalyse quantifiziert und normiert werden. Das Ergebnis ist ein thermisches Diagramm, das den Grad des Schutzes gegen Hydroxylradikale visualisiert. Der Farbübergang beschreibt die Änderung der Zugänglichkeit bei Zugabe von Magnesiumeisen: Weiß zu Rot zeigt besser zugängliche Nukleotide, während Weiß zu Blau besser geschützte Nukleotide zeigt.

Jeder Grad der Verschattung ist mit einem numerischen Wert verknüpft, der als Schutzkurve dargestellt und durch ein Bindungsmodell wie die Hügelgleichung analysiert werden kann. In diesem Beispiel ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante des Schutzes 1 5 3 bis 1 5 5 etwa doppelt so groß wie der entsprechende Wert des Schutzes 1 6 3 bis 1 6 4. Dieses Experiment zum Fußabdruck von Hydroxyradikalen kann in eineinhalb Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, um eine Kontamination mit RNAs zu vermeiden. Auch die endgültige Eisenkonzentration hängt vom Versuchssystem ab. Daher empfehlen wir, vor dem Footprinting nach diesem Verfahren ein Dosis-Wirkungs-Experiment durchzuführen.

Andere Methoden, wie z.B. der zeitaufgelöste Hydroxyradikal-Fußabdruck, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zu welchem kritischen Zeitpunkt erreichen RNA-Moleküle beispielsweise nach ihrer Entwicklung eine fehlgefaltete oder aktive Bestätigung? Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Strukturbiologie den Weg, um sowohl inter- als auch zwischenzeitliche molekulare tertiäre Wechselwirkungen von Nukleinsäuren zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Tertiärstrukturbildung von RNA-Molekülen bestimmt. Vergessen Sie nicht, dass Caat und Phosphor Stufe zwei gefährliche Vorsichtsmaßnahmen sind, wie z. B. das Tragen von Handschuhen und Schutzbrillen sowie die Verwendung von Plexiglasabschirmungen, die bei der Durchführung dieses Verfahrens empfohlen werden.