Name: Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von peroxidativer und Oxidativer Hydroxylradikal Footprinting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Hydroxylradikal-Footprinting-Methode zur Quantifizierung der RNA-Tertiärstrukturbildung mit Mg(II)-Abhängigkeit. Dieses Protokoll nutzt Endmarkierung, Gelelektrophorese und Fenton-Reagenzien.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health RO1-GM085130 und National Science Foundation MCB0929394 unterstützt. Wir danken Dr. Marion Schmidt für ihre Gastfreundschaft und für die Erlaubnis zu filmen in ihrem Labor.

1. Vorbereitung der Reagenzien Footprinting <ol><li> Bereiten Sie einen 10x Reaktionspuffer mit 100 mM Natriumcacodylat, 1 mM EDTA und 1 M KCl. Den pH-Wert auf 7,4. Filtern Sie die Puffer unter Verwendung eines 0,2 uM Acetat-Filter-Gerät (Nalgene). Bemerkung: nicht pipet RNA direkt in 10x Puffer. </li><li> Bereiten Sie die Titrationsreaktion Mix für jede Reaktion, wie in Tabelle 1 angegeben. Das Volumen der Titration Mix (1x Puffer und Mg (II) in der gewünschten Konzentration) sollte 90 ul werden, bevor man 10 &amp;mgr; l des RNA in 1x Puffer. </li><li> Bereiten Sie eine RNAse T1 Verdauung Puffer 6.63M Urea, 20 mM Natriumcitrat, 1mM EDTA, 0,25 ug / ul tRNA, 0,025% Xylencyanol und 0,025% Bromphenolblau. Dieser Puffer kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 6 Monaten. </li><li> Die Fenton-Reaktion erfordert frisch zubereiteten wässrigen Lösungen von 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA und 500 mM Natrium-L-Ascorbat. Die Konzentrationen festgestellt in Kapitel 10,5 sind optimal für equilibrium-Experimente in Puffer wie Natriumcacodylat, die nicht abzufangen ist Radikalen und diverse zweiwertigen Ionen-Konzentrationen. </li><li> Reagenzien für die peroxidative (1.5.1) und oxidative (1.5.2) footprinting Reaktion. <ol><li> Die peroxidative Fenton Reaktion erfordert frisch zubereiteten wässrigen Lösungen von 100 mM Fe-EDTA-Lösung und 50 mM Natrium-L-Ascorbat und 1,5% H 2 O 2. Die Fe-EDTA-Lösung wird durch Mischen von Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 mit EDTA bereit, das 1,1-fache über EDTA über Eisen haben. </li><li> Kurz vor Eröffnung des oxidativen Spaltung (3.4.2), erstellen Sie die Fenton-Reaktion-Mix durch die Kombination von 2 ul Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mM), 2,2 ul EDTA (250 mM), 62,5 ul Natrium-L-Ascorbat (500 mM), 22,5 ul 10x Reaktionspuffer und 135,5 ul H 2 O auf die Endkonzentrationen im footprinting Reaktionsgemisch (3.4.2) von 0 zu erreichen.10 mM, 0,11 mM, und 6,61 mM. </li></ol></li></ol> 2. RNA-Präparation für Footprinting Experiment <ol><li> RNA kann durch Standard-in vitro-Transkription der DNA-Vorlagen 6 hergestellt werden oder, wenn kürzer als 50 Nukleotide, erworben (z. B. bei Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com) werden. Die empfohlenen Labor Sauberkeit Verfahren zur Probe Integrität der RNA während Footprinting Experimente zu erhalten. 7 </li><li> Dephosphorylierung 8 von in vitro transkribierte RNA ist notwendig, vor 32 P Kennzeichnung der 5 'Ende der RNA. 10 pmol RNA werden durch kinasing endmarkiert. 9 Die Lösung sollte nach erfolgter Inaktivierung der Phosphatase bewölkt. </li><li> Purify radioaktiv markierte RNA mit denaturierende Gelelektrophorese. Die RNA wird durch zwei anschließende Gel Extraktion mit 0,3 M Natriumacetat (pH 5,5) erholt. RNA wird durch Mischen von 0,5 ml wässrige Lösung mit 1 ml Ethanol und anschließender ausgefälltInkubation für 1 Minute auf Trockeneis. Spin Probe bei 4 ° C, 12500 rpm für 0,5 Stunden. Überstand verwerfen und waschen RNA-Pellet mit 70% Ethanol. Entfernen Sie nach dem zusätzlichen Zentrifugationsüberstand und trocken Pellet im Vakuum. </li><li> Lösen Sie die 32 P-markierten RNA-Proben in 330 ul 1x Buffer.Pipet 30 ul der RNA-Lösung in einem Reaktionsrohr, Niederschlag mit Ethanol und trockene RNA im Vakuum; halten dieses Rohr für die Erzeugung der Referenz Leiter (Schritt 3.5). Denaturieren gepuffert RNA-Lösung durch Erhitzen bei 95 ° C für 2 min. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur für 15 min und geben einen schnellen Spin zur Senkung der Kondensate auf den Deckeln der Rohre wieder in Lösung. </li></ol> 3. Die Footprinting Experiment <ol><li> Die Elektrophorese Kamm bestimmt die maximale Anzahl der Datenpunkte pro analytischen Gel. Wir verwenden eine 30 gut kämmen. Die Referenz Leiter belegt 2 Brunnen und die ungespaltenen Kontrolle ein. Bereiten 27 Reaktionsgefäße. Die endgültige Mg (II) concentrations sollten gleichmäßig auf einer logarithmischen Skala Spanning Größenordnungen um die Titration Mittelpunkt angeordnet werden. </li><li> Separat inkubieren RNA und Mg (II)-Lösungen bei 50 ° C für 5 min. Mix 10 ul RNA-Lösung mit 90 ul der entsprechenden Menge an Mg (II) in 1x Puffer auf ein Endvolumen von 100 ul zu erreichen. Inkubieren Sie die Lösungen für 30 min bei 50 ° C. </li><li> Lassen Sie die Lösungen bei 25 ° C für 1 Stunde ausgleichen, während Faltung auftritt. </li><li> Peroxidativer (3.4.1) oder oxidative (3.4.2) Hydroxylradikal footprinting Reaktion. <ol><li> Starten Sie den peroxidative Reaktion, indem Tröpfchen von 2 ul Fe-EDTA (100 mM), 2 ul Natrium-L-Ascorbat (50 mM) und 2 ul H 2 O 2 (1,5%) von einander an der Spitze in der Reaktion abgetrennt Röhrchen mit der RNA-Lösung und starten Sie die footprinting Reaktion durch kräftiges Mischen. Stoppen der Reaktion nach 15 Sekunden durch Zugabe von 300 ul kaltem absolutem Ethanol. Drehen Sie den Rohren 3-5 mal. Niederschlag, Wasch-undtrockene Pellet, wie in Schritt 2.4. </li><li> Starten Sie die oxidative Hydroxylradikal footprintingreaction durch Zugabe von 5 ul der frisch zubereiteten Fenton-Reaktion-Mix (1,6). Inkubieren für 30 min bei 25 ° C. Add 300 pl kaltem absolutem Ethanol, um die Reaktion zugeben und durch Drehen der Rohre 3-5 mal stillen. Niederschlag, waschen und trocknen das Pellet wie in Schritt 2.4. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine RNase T1 verdauen Referenzprobe nach üblichen Verfahren 10 mit der Lösung in Schritt 1.3 vorbereitet. </li><li> Lösen RNA-Pellets in 8 ul Gel Loading Dye II (Ambion) und bestätigen RNA wird durch die Verwendung der Geiger-Zähler resuspendiert. </li><li> Bereiten Sie eine Denaturierung, 8% Polyacrylamid Sequenzierungsgel nach Standardprotokollen. 11 Legen Proben, darunter zwei Referenzen und eine Kontrollgruppe. Separate RNA-Fragmente bei 60 W - 75 W für 2,5 Stunden. Expose getrockneten Gel zu einer Speicherung Leuchtschirm über Nacht. Scan Leuchtschirm mit einem Imaging-System für filmlosen Autoradiographie, z. B.. Sturm 865 (GE Healthcare) oder Taifun (GE Healthcare). Transfer-Gel-Image-Datei auf Ihren Computer. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Das Hydroxyl-Radikal Reaktivität jedes Nukleotid ist durch Quantifizierung der Intensität jeder Band auf der analytischen Gel bestimmt. Downloaden, installieren und öffnen SAFA, ein einfach zu Open-Source-Software für Single-Band-Montage und Quantifizierung verwenden. 12, 13 Befolgen Sie die Bedienungsanleitung beachten. Kurz gesagt, laden Sie die RNA-Sequenz als. Txt-Datei, gefolgt von der Gel-Bild als. Gel-Datei. Passen Bandenintensitäten, definieren die Gassen, wählen Sie einen Anker Spur, und führen Sie ein Gel Ausrichtung. Zuordnung der Banden zu Nukleotiden tritt in Bezug auf RNase T1 Verdauung Leiter. Quantifizierung der Band Integrale und die Normalisierung / colorplot Funktion zu normalisieren und weisen potenziell invariant Rückstände. Speichern Sie die Ausgabe als. Txt-Datei. </li><li> SAFA gibt eine Tabelle mit Spalten repräsentieren Spuren auf dem Gel und Zeilen, die die inintegrierte Band Dichte der einzelnen Banden, die die RNA-Fragment. Zunächst identifizieren die Schutzgebiete, die eine merkliche Veränderung in Lösungsmittelzugänglichkeit Display durch einen Vergleich der Schutz-Profil aus der kein Mg (II)-Probe mit dem Profil des Endpunktes Mg (II)-Konzentration (50 mM in unserem Beispiel) abgeleitet. Je niedriger der Wert, desto mehr schützten die Nukleotid ist gegen den Angriff von Hydroxyl-Radikalen und umgekehrt. </li><li> Create Falten Isothermen aus den normalisierten Band Integrale von einzelnen oder Gruppen von Nukleotiden im Vergleich zu Mg (II)-Konzentration. Die Isothermen sind individuell auf fraktionelle Sättigung durch fi = L + (U - L) skaliert • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> wobei f die integrierte Dichte der Band (s) bezeichnet, die analysiert werden, stellen L-und U die untere und obere Grenzen für die Übergangs-und <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> ist fraktionelle Sättigung. 14 Die Daten sind fit mit einem nicht-linearen lOsten Quadrat-Analyse-Programm (Wir verwenden entweder Origin (OriginLab) oder GraphPad (GraphPad Software, Inc.).), um die Hill-Gleichung (1), <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> wo K d ist das Gleichgewicht Dissoziationskonstante, [M] entspricht der Konzentration der Variablen, die die Faltung Reaktion vermittelt, Mg (II) in diesem Beispiel, und n H ist der Hill-Koeffizient. Dieses Verfahren skaliert die Umstellung auf fraktionelle Sättigung bestimmt seinen Mittelpunkt und bietet eine phänomenologische Test, ob ein Übergang sigmoidal. Isothermen von Sequenziergelen (Abbildung 3A), die von SAFA (Abbildung 3B) wurden analysiert und fit wie oben beschrieben abgeleitet sind in Abbildung 3C gezeigt. Die fraktionelle Sättigung Isothermen in Abbildung 3 dargestellt wurden durch Skalierung in einer Tabellenkalkulation erstellt die Werte von SAFA gegen die besten passen Ober-und Untergrenzen (U-und L) mit der Gleichung Bruchteil generiert = value / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse aus P4-P6-RNA • OH Footprinting Experimente. Das Gel-Bild (links) zeigt an, dass a) Hintergrund Spaltung minimal ist (rechte Spur), b) single nucleotide Zuordnung ist möglich durch gut definierte Banden in den T1 Spur (RNase T1 spaltet bei jedem G), und c) das Hydroxyl-Radikal induzierten Fragmentierung der RNA ist weit über Hintergrund. Der Übergang von niedrigen zu hohen Mg (II) wird mit abnehmender integrierte Band Dichte der einzelnen und Gruppen von Bändern auf die Bildung von RNA Tertiärstruktur angeschlossen. Einzel-oder Gruppen von aufeinander folgenden Nukleotid deren Spaltung Änderungen mitverwendet werden als "Schutz" bezeichnet. Die • OH-Schutz Merkmal der Mg (II)-vermittelte Faltung der P4-P6-RNA in engem Zusammenhang mit dem Lösungsmittel unzugänglichen Regionen des Moleküls in seine Kristallstruktur beobachtet entsprechen. 15 Gefaltete RNA-Moleküle c ein sehr unterschiedlichem Ausmaß (dh, wie Hintergrund schließen die Band Dichten Rückgang) des tertiären Berührungsschutz, die nicht mit klaren Struktur-oder dynamisches Phänomen wurden korreliert. So werden einige RNA-Moleküle zeigen, gut definierte strukturelle Übergänge, wie in Abb. 3 gezeigt, und manche nicht. Band Intensitäten quantifiziert und durch SAFA 12 Analyse (Abbildung 3B) normiert. Die Ausgabe ist eine "thermische" Plot Visualisierung der relativen Schutz gegen • OH. Der Farbübergang beschreibt die Zugänglichkeit zu ändern, auf Mg (II) hinaus. Weiß auf Rot oder Blau zeigt mehr zugänglich oder mehrere geschützte Nukleotide, jeweils. Jedes Grad der Schattierung wird mit einem numerischen Wert, der als Schutz-Kurve (Abbildung 3C) aufgetragen werden können und von einem Binding-Modell wie der Hill-Gleichung (1) angeschlossen. Die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante mit Schutz 153-155 angegliedert ist etwa doppelt so hoch wie der entsprechende Wert des Schutzes 163-164. NHALT "&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Hydroxylradikal Produktions-und P4-P6 RNA-Faltung. A) Fe (II) katalysiert die Bildung von Hydroxylradikalen aus Wasserstoffperoxid. Ascorbat reduziert Fe (III) zurück zu Eisen-II. B) In Abwesenheit von Mg (II), ist kein P4-P6 Tertiärstruktur gebildet, so dass Hydroxyl-Radikale zu durchdringen und zu spalten alle zugänglich Backbone-Positionen. Die Zugabe der Mg (II) initiiert Faltung des P4-P6, so dass nur das Lösungsmittel zugänglich Rückgrat durch die Hydroxyl-Radikale gespalten werden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Für einen Hydroxyl-Radikal footprinting Experiment Outline. A) Dephophorylation und 32 P-5'-Ende Markierung von RNA. B) Reinigung von 32 RNA auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel P-markierte. C) Exzision von RNA-Band, anschließende RNA-Extraktion und Ethanolfällung. D) Vorfaltung undFaltung der RNA. E) Die Zugabe von frisch zubereiteten Fenton Reaktionsgemisch zur Erzeugung der Hydroxyl-Radikale. F) RNA-Fragment Trennung durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese. G) Quantifizierung von RNA-Fragmenten durch SAFA-Software. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Analyse von RNA-Fragmenten nach peroxidative Fenton footprinting Reaktion. (A) Die RNA wurde zu Hydroxyl-Radikalen ausgesetzt und die Spaltprodukte wurden gelöst mit denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Das Bild zeigt peroxidative Spaltprodukte mit zunehmender Konzentration von Mg (II). Reference und Kontrolle Gassen beschriftet sind. Diese Image-Datei ist der Eingang für das SAFA-Programm, das die Lautstärke der einzelnen Bänder quantifiziert. (B) Die "thermische" Verschwörung von SAFA generiert. (C) eine Tabelle mit Werten über integrierte Band Dichte an Nukleotid-Nummer Ausgabe von SAFA wird durch ein verbindliches Modell wie der Hill equati analysiertauf (1). Regionen des Schutzes wurden nach der Erhöhung der Band integralen Dichte als Funktion der Mg (II)-Konzentration gewählt. Die K d ist die Mg (II)-Konzentration bei der die Hälfte der RNA auf der Baustelle überwacht gefaltet ist. Der Hill-Koeffizient, n H, ist ein Maß für die Steigung der Kurve, die Auskunft über die Bindung Kooperativität und bietet eine niedrigere Schätzung für die Zahl der Magnesium-Ionen in Falten von diesem besonderen Ort beteiligt. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Repräsentativen Mengen zur Erzeugung von RNA Proben mit verschiedenen Mg (II)-Konzentrationen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hydroxyl-Radikal Footprinting ist ein wertvolles Instrument, um das Lösungsmittel zugängliche Oberfläche von Nukleinsäuren zu beurteilen. Qualitative und quantitative Bildung der Tertiärstruktur 14 kann als eine Funktion von Parametern wie Ionen-Art und Konzentration, pH, Temperatur, bindende Proteine ​​oder Falten Co-Faktoren zu beachten. Die überzeugende Kombination aus einem geradlinig und kostengünstige Protokoll und die daraus resultierende Lösungsmittel Zugänglichkeit und Falten Informationen auf einer ...

<table><tbody><tr><td>Name</td><td>Firma</td><td>Artikelnummer</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacaodylat (Vorsicht! Toxisch)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-ascorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung equilibrium veränderungen im rna-struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;oxidativer &#39;hydroxylradikal footprinting

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA-Moleküle spielen eine wesentliche Rolle in der Biologie. Neben der Übertragung genetischer Information, kann RNA in einzigartige Tertiärstrukturen Erfüllung einer bestimmten biologischen Rolle als Regulierer, Bindemittel oder Katalysator zu falten. Informationen über tertiäre Bildung Kontakt ist unerlässlich, um die Funktion von RNA-Molekülen zu verstehen. Hydroxyl-Radikale (• OH) sind einzigartig Sonden der Struktur von Nukleinsäuren aufgrund ihrer hohen Reaktivität und geringen Größe. 1 Wenn ein footprinting Sonde verwendet, map Hydroxylradikale das Lösungsmittel zugängliche Oberfläche des Phosphodiester-Rückgrat der DNA 1 und RNA 2 mit so fein wie single nucleotide Auflösung. Hydroxyl-Radikal footprinting können die Nukleotide innerhalb einer intermolekularen Kontaktfläche, in DNA-Protein-1 und RNA-Protein-Komplexe z. B. zu identifizieren. Equilibrium 3 und 4 kinetische Übergänge können durch die Durchführung Hydroxylradikal Footprinting als Funktion einer Lö bestimmt werdenauf variable oder Zeit, bzw.. Ein wesentliches Merkmal des Fußabdrucks ist, dass eine begrenzte Exposition mit der Sonde (zB &quot;Single-Hit-Kinetik&quot;) führt in die einheitliche Probenahme jedes Nukleotid des Polymers. 5 In diesem Video-Artikel verwenden wir die P4-P6-Domäne des Tetrahymena Ribozym RNA Probenvorbereitung und die Bestimmung eines Mg (II)-vermittelte Faltung Isothermen zeigen. Wir beschreiben die Verwendung der bekannten Hydroxyl-Radikal footprinting Protokoll, das H 2 O 2 (wir nennen dies den &quot;peroxidative&quot;-Protokoll) und eine wertvolle, aber nicht allgemein bekannt, dass alternative natürlich gelösten O 2 verwendet (wir nennen so bedarf dies der &#39; oxidative &#39;Protokoll). Eine Übersicht über die Datenreduktion, Transformation und Analyse-Verfahren vorgestellt.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Mg (II)-abhängige Bildung von RNA Tertiärstruktur durch zwei Methoden der Hydroxyl-Radikal footprinting quantifizieren.

Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;Oxidativer &#39;Hydroxylradikal Footprinting

RNA-Moleküle spielen eine wesentliche Rolle in der Biologie. Neben der Übertragung genetischer Informationen kann RNA einzigartige Tertiärstrukturen ausbilden, die ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Faltung von RNA-Molekülen mithilfe eines Hydroxyl-Radikal-Footprints zu untersuchen. Dazu wird die RNA zunächst an einem Ende markiert, durch Gelelektrophorese gereinigt und vorgefaltet, um die konformationelle Integrität der RNA vor dem anschließenden, magnesiumvermittelten Faltungsprozess sicherzustellen. Danach werden Fenton-Reagenzien gemischt, um Hydroxylradikale zu erzeugen, die die RNA-Backbone entsprechend ihrer Lösungsmittelzugänglichkeit schneiden können. Anschließend werden die RNA-Spaltprodukte mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Bandintegrale werden mithilfe einer halbautomatischen Footprinting-Analyse-Software quantifiziert. Das endgültige Ziel besteht darin, Faltungs-Isothermen zu erzeugen, die die Ausbildung der tertiären Struktur von RNA widerspiegeln. Dies wird erreicht, indem die normalisierten Bandintegrale auf die fraktionale Sättigung skaliert werden.Die Isothermen können anschließend an die Hill-Gleichung angepasst werden. Der Hauptvorteil der Hydroxy-Footprinting-Methode besteht darin, dass man mithilfe kostengünstiger Chemikalien Informationen über die tertiäre Struktur von RNA erhält, da kleine Hydroxylradikale aufgrund ihrer hohen Aktivität ideale Sonden darstellen, um zwischen lösungsmittelzugänglichen und vergrabenen Nukleotiden zu unterscheiden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Strukturbiologie zu beantworten.Beispielsweise, wie nutzen Ribosomen Metallionen, um ihre aktive Konformation zu erreichen? Der Hydroxyl-Radikal-Footprint kann verwendet werden, um die Grundlagen der RNA-Spezifität und -Erkennung zu verstehen. Neben der Aufklärung von Informationen über die tertiäre RNA-Struktur kann diese Methode dazu dienen, die genauen Bindungsstellen von Proteinen an RNA- oder DNA-Molekülen zu bestimmen.Die Hauptprobleme dieser Methode bestehen darin, eine Probenabbaustörung durch Ribonuklease zu verhindern und die Eisenzugabe zu optimieren, um die geeignete Menge an RNA-Spaltung zu erzielen. Außerdem kann die detaillierte Analyse der Bandabstände recht schwierig sein. Der wesentliche Vorteil dieses Videos liegt darin, dem Betrachter die Planungsphase und die erfolgreiche Durchführung eines Hydroxyl-Radikal-Footprint-Experiments verständlich zu machen. Vor Beginn dieses Protokolls bereiten Sie alle im schriftlichen Protokoll beschriebenen Footprint-Reagenzien vor.Begleitend zu diesem Video kann RNA hergestellt werden, wobei DFOs vier verwandte und endmarkierte Moleküle enthalten, wie dort beschrieben. Reinigen Sie die radioaktiv markierte RNA mittels denaturierender Gelelektrophorese. Gewinnen Sie die gereinigte RNA durch zwei aufeinanderfolgende Gelextraktionen unter Verwendung von 0,3 molarer Natriumacetatlösung zurück.Präzipitieren Sie dann die RNA, indem Sie 0,5 Milliliter der wässrigen Lösung mit einem Milliliter Ethanol mischen. Inkubieren Sie die Mischung für eine Minute auf Trockeneis. Nach dem Zentrifugieren des Probenmaterials entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol.Entfernen Sie das Überstand nach einer zusätzlichen Zentrifugation und trocknen Sie das Pellet im Vakuum. Lösen Sie anschließend die gereinigten mit P 32 markierten RNA-Proben. Pipettieren Sie 30 Mikroliter der RNA-Lösung in 330 Mikroliter einesmaligen Reaktionspuffer in ein neues Reaktionsröhrchen.Fällen Sie die RNA mit Ethanol und trocknen Sie das Pellet anschließend im Vakuum. Sobald das Pellet getrocknet ist, kann es zur Erstellung der Referenzladder verwendet werden, wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben. Denaturieren Sie die verbleibende gepufferte RNA-Lösung durch Erhitzen auf 95 Grad Celsius für zwei Minuten. Kühlen Sie die Proben 15 Minuten lang auf Raumtemperatur ab und zentrifugieren Sie sie kurz, um den Kondensat wieder in Lösung zu bringen. Um das Footprint-Experiment zu beginnen, richten Sie 27 Reaktionsgefäße ein, um genügend Proben für ein 30-Vertiefungen-Elektrophoresegel vorzubereiten.Nachdem die Längenskalen und die gespaltene Kontrolle hinzugefügt wurden, die endgültigen Eisenmagnesium-Konzentrationen so bestimmen, dass sie über mehrere Größenordnungen hinweg um den Titrationsmittelpunkt gleichmäßig auf einer logarithmischen Skala verteilt sind. Die Herstellung der Magnesiumionen in einermal Reaktionspuffer wird im Text separat beschrieben. Die RNA- und die Magnesiumionen-Lösungen bei 50 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Anschließend 10 Mikroliter der RNA-Lösung mit 90 Mikrolitern der entsprechenden Menge an Eisenmagnesium-Lösung mischen.Um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen, jede Mischung 30 Minuten bei 50 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Lösungen eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius äquilibrieren lassen, während die RNA-Faltung stattfindet. In der Zwischenzeit, unmittelbar vor dem Start der Hydroxylradikalfußabdruckreaktion, die Phantomreaktionsmischung wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben vorbereiten.Bereiten Sie die Peroxidationsreaktion vor, indem Sie jeweils zwei Mikroliter-Tropfen Eisen-EDTA-Natriumascorbat und Wasserstoffperoxid an der Innenseite des Reaktionsrohrs oberhalb der RNA-Lösung abpipettieren, sodass sich die Tropfen nicht berühren. Starten Sie die Footprinting-Reaktion durch kräftiges Mischen. Stoppen Sie die Reaktion nach 15 Sekunden durch Zugabe von 300 Mikroliter reinem kalten Ethanol.Drehen Sie die Röhrchen drei bis fünfmal. Abschließend das Pellet ausfällen, waschen und trocknen, wie zuvor beschrieben. Als Alternative zur peroxidativen Reaktion würde die oxidative Hydroxylreaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern der frisch zubereiteten Fenton-Reaktionsmischung zu den Proben durchgeführt. Inkubieren Sie die oxidative Reaktion 30 Minuten bei 25 Grad Celsius.Anschießend 300 µL reines kaltes Ethanol hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen, und durch Vorsichtiges Umkippen der Röhrchen mischen. Die Probe erneut ausfällen. Den Pellet nach Abschluss entweder der peroxidativen oder oxidativen Reaktion waschen und trocknen. Lösen Sie die getrockneten RNA-Pellets in acht Mikrolitern Gel-Ladepuffer zwei auf. Überprüfen Sie mithilfe eines Geigerzählers, ob die mit P-32 markierte RNA resuspendiert ist, und bereiten Sie gemäß Standardprotokollen ein denaturierendes 8 %ige Polyacrylamid-Sequenziergel vor. Laden Sie die Proben, einschließlich zwei Referenzen und einer gespaltenen Kontrolle, unter Verwendung eines Kamms mit 30 Vertiefungen auf das Gel auf.Trennen Sie die RNA-Fragmente zwei Stunden und eine halbe Stunde lang bei 60 bis 75 Watt. Belichten Sie das getrocknete Gel über Nacht auf einem Speicher-Phosphor-Screen. Scannen Sie den Phosphor-Screen mit einem Bildgebungssystem für die filmlose Autora diographie.Übertragen Sie anschließend die Gel-Bilddatei auf den Computer zur Analyse. Öffnen Sie zur Durchführung der Datenanalyse Safa, eine Open-Source-Software zur Anpassung und Quantifizierung einzelner Banden. Laden Sie die RNA-Sequenz als TXT-Datei, gefolgt vom Gel-Bild als GEL-Datei.Definieren Sie die Bahnen und passen Sie die Bandenintensitäten an. Wählen Sie dann eine Referenz-Bahn aus, und führen Sie eine Gelelektrophorese-Zuordnung der Banden zu den Nukleotiden anhand der RNA T1-Digestionsleiter durch. Quantifizieren Sie die Bandenintensitäten und verwenden Sie die Normalisierungs-/Farbdiagramm-Funktion, um die Daten zu normalisieren und potenziell invariante Reste zuzuweisen.Speichern Sie die Ausgabe als TXT-Datei. SFA gibt eine Tabelle aus, die Spalten enthält, die für die Gelläufe stehen, und Zeilen, die den einzelnen Bandenintegralen entsprechen, die dem RNA-Fragment zuzuordnen sind. Zunächst müssen die Schutzstellen identifiziert werden, die eine erkennbare Änderung der Lösungsmittelzugänglichkeit aufweisen, indem man das Schutzprofil der Probe ohne Magnesiumionen mit dem Profil der Endkonzentration an Magnesiumionen vergleicht.Je niedriger der Wert, desto stärker ist das Nukleotid vor Angriffen durch Hydroxylradikale geschützt, und umgekehrt. Erstellen Sie anschließend Übergangskurven der Bandenintensitäten einzelner oder Gruppen von Nukleotiden in Abhängigkeit von der Magnesiumeisenkonzentration, indem Sie jedes Übergangsverhalten im Tabellenformat individuell an die Funktion der fraktionalen Sättigung anpassen, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben. Als letzten Schritt passen Sie die Daten an die Hill-Gleichung an.Diese Analyse skaliert den Übergang zur fraktionalen Sättigung, bestimmt den Übergangsmittelpunkt und liefert einen phänomenologischen Test dafür, ob ein Übergang sigmoidal verläuft. Hier sind repräsentative Ergebnisse aus P vier P sechs rRNA-Hydroxylradikal-Footprint-Experimenten. Isothermen wurden aus Sequenziergelen abgeleitet, die mit Safa analysiert und anschließend wie im Analyseabschnitt beschrieben angepasst wurden.Das Gelelektrophoresebild zeigt, dass die Hintergrundspaltung minimal ist und eine Zuordnung auf einzelne Nukleotide möglich ist, da im T-Einzelband gut definierte Banden sichtbar sind. Die durch Hydroxylradikale hervorgerufene Fragmentierung der RNA liegt deutlich über dem Hintergrund. Der Übergang von niedrigen zu hohen Magnesiumionenkonzentrationen ist selektiv mit einer Abnahme der Intensität einzelner und Gruppen von Banden verbunden, was auf die Ausbildung von RNA hinweist. Der Schutz der tertiären Struktur bezieht sich auf einzelne oder Gruppen benachbarter Nukleotide, deren Spaltung gleichzeitig erfolgt. Die Bandenintensitäten werden mittels Saffer-Analyse quantifiziert und normalisiert. Das Ergebnis ist eine Wärmekarte, die das Ausmaß des Schutzes gegenüber Hydroxylradikalen veranschaulicht. Der Farbverlauf beschreibt die Änderung der Zugänglichkeit nach Zugabe von Magnesiumionen: Weiß nach Rot zeigt zugänglichere Nukleotide an, während Weiß nach Blau stärker geschützte Nukleotide anzeigt.Jedem Grauabstufungsgrad ist ein numerischer Wert zugeordnet, der als Schutzkurve dargestellt und mit einem Bindungsmodell wie der Hill-Gleichung analysiert werden kann. In diesem Beispiel ist die Gleichgewichtsdissociationskonstante, die mit dem Schutz von 1 5 3 bis 1 5 5 verbunden ist, ungefähr doppelt so hoch wie der entsprechende Wert für den Schutz von 1 6 3 bis 1 6 4. Dieses Hydroxy-Radikal-Footprint-Experiment kann bei sachgemäßer Durchführung in eineinhalb Tagen durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, um jegliche RNA-Kontaminationen zu vermeiden. Außerdem hängt die endgültige Eisenkonzentration vom experimentellen System ab. Daher empfehlen wir, vor der Durchführung des Footprinting-Verfahrens gemäß dieser Anleitung ein Dosis-Wirkungs-Experiment durchzuführen.Andere Methoden, wie beispielsweise die zeitaufgelöste Hydroxylradikalfußabdruck-Analyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Zum Beispiel: Zu welchem kritischen Zeitpunkt erreichen RNA-Moleküle nach ihrer Entstehung eine fehlgefaltete oder aktive Konformation? Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Strukturbiologie, inter- sowie interimäre molekulare tertiäre Wechselwirkungen von Nukleinsäuren zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Ausbildung der tertiären Struktur von RNA-Molekülen bestimmt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass caate und Phosphor Stufe zwei gefährlich sind; Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille sowie die Verwendung einer Plexiglasschutzvorrichtung werden empfohlen, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen

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Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von "peroxidativer" und "Oxidativer 'Hydroxylradikal Footprinting

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