Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache und effiziente Methode zur Festphasen-Peptidsynthese und zur wässrigen Selbstorganisation von Peptiden zu hochgeordneten Nanoblättern zu beschreiben. Strukturell ähnlich wie Polypeptide befinden sich Peptide in substituierten Glycinpolymeren, bei denen die Seitenketten an den Stickstoff und nicht an den Alpha-Kohlenstoff gebunden sind. Der Prozess beginnt mit der Synthese einer spezifischen Peptidsequenz über eine andere Submonomermethode.

Die Submonomer-Methode besteht aus zwei einfachen chemischen Schritten, die jedes Monomer nacheinander in die Kette einführen. Zunächst wird ein Amin, das an einem festen Träger befestigt ist, mit Brom acetyliert. Zweitens wird das Bromid durch ein primäres Amin verdrängt.

Diese Schritte werden so lange wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist. Nach der Kettenverlängerung wird das Peptid von dem festen Träger abgespalten und das resultierende Rohpeptidöl wird durch HPLC gereinigt und charakterisiert, um die Selbstorganisation der Peptide zu Nanoblättern zu initiieren. Eine verdünnte wässrige Pufferlösung des Peptids wird in einem Glasfläschchen hergestellt und schonend gemischt. Als letzter Schritt.

Die Nanoblätter werden unter dem Mikroskop untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass ein iterativer Zyklus von zwei einfachen chemischen Schritten ein sequenzspezifisches Polymer ergeben kann, das sich spontan zu Nanoblättern zusammensetzt. Peptide sind eine neuartige Klasse von bioinspirierten Polymeren mit Eigenschaften, die zwischen denen von Proteinen und herkömmlichen Polymeren liegen.

Sie sind robust und synthetisch vielseitig wie herkömmliche Polymere, aber auch hochgradig abstimmbar und sequenzspezifisch wie Proteine und DNA-Peptide entwickeln sich zu einem fortschrittlichen Material, um Schlüsselprobleme in der Biomedizin und Materialwissenschaft zu lösen, wie z. B. die Identifizierung bioaktiver Medikamente oder das Design künstlicher Proteine. Zu den großen Vorteilen von Peptiden gehören die präzise Sequenzkontrolle, die Verfügbarkeit unglaublich vielfältiger Bausteine, die effiziente Synthese und die Stabilität der Protease. Die allgemeine Methode der manuellen Peptidsynthese mit Basisgeräten und kommerziell erhältlichen Reagenzien wird skizziert, so dass Peptide in den meisten Laboratorien leicht synthetisiert werden können.

Die visuelle Demonstration der Syntheseschritte ist von entscheidender Bedeutung und dient als wertvolle Referenz für Personen, die in das Gebiet der Festphasensynthese einsteigen. Zum ersten Mal wurde hier die Aufreinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptids 36 mers sowie dessen Selbstorganisation zu hochgeordneten Nanoblättern beschrieben. Beginnen Sie dieses Protokoll mit dem Aufbau der Versuchsapparatur, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Die folgenden Schritte werden aus Gründen der Übersichtlichkeit in einem Reaktionsgefäß aus Glas anstelle einer Einwegkartusche aus Polypropylen durchgeführt. Nach dem Aufstellen bei 100 mg R-Amidharz in ein frittiertes Reaktionsgefäß quillt das Harz durch Zugabe von zwei Millilitern Dimethylformamid oder DMF, rühren Sie durch Blasenbildung für 10 Minuten. Lassen Sie dann die Lösung durch Vakuum ab, um das aufgequollene Harz zu isolieren.

Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 20%iges Methylpyridin in DMF hinzu, um die FM O-Gruppe zu schützen. Zwei Minuten lang umrühren und abtropfen lassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 12 Minuten lang und spülen Sie dann das Harz aus, indem Sie zwei Milliliter DMF hinzufügen, 15 Sekunden lang rühren und abtropfen lassen.

Beginnen Sie mit dem Wachstum der Peptidkette mit dem ersten Submonomerzyklus, der eine Bromacetylierung und einen Verdrängungsschritt umfasst. Für die Bromacetylierung fügen Sie einen Milliliter 0,6 molare Bromessigsäure in DMF und 86 Mikroliter Diisopropylcarbomilbe hinzu. Nach 30-minütigem Rühren abtropfen lassen und mit zwei Millilitern DMF spülen.

Als nächstes führen Sie die Verdrängung durch, indem Sie einen Milliliter von ein bis zwei molaren Amin in das End-Methylpyro-Genon-Inkubat für 30 bis 120 Minuten nach der Inkubation geben, abtropfen lassen und mit zwei Millilitern DMF spülen. Auch hier gilt: Lass die Peptidkette weiter wachsen, indem du den Submonomerzyklus wiederholst. Nachdem die endgültige Verdrängung erfolgt ist, spülen Sie mit zwei Millilitern DMF nach.

Anschließend eine Diora-Methan-Waschkappe aufsetzen und das Reaktionsgefäß bis zur Spaltung aufbewahren. Um mit der Spaltung zu beginnen, geben Sie das gesamte getrocknete Harz in ein 20-Milliliter-Szintillationsglasfläschchen, das in einer Haube arbeitet und die geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet, fügen Sie vier Milliliter Trifluoressigsäure oder TFA-Spaltcocktail in das Szintillationsglasfläschchen und die Kappe hinzu. 10 Minuten bis zwei Stunden bei Raumtemperatur fest umrühren.

Alternativ können Sie die Lösung mit einem Rotationsschüttler mischen. Sammeln Sie die TFA-Spaltlösung, indem Sie das Harz durch eine Einwegkartusche aus Polypropylen in ein neues, vorgewogenes 20-Milliliter-Szintillationsglasfläschchen filtrieren. Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter frischen Dekolleté-Cocktail hinzu, um das Harz abzuspülen und eventuelle Peptidreste aufzufangen.

Wiederholen Sie dies, spülen Sie zweimal aus. Verdampfen Sie die TFA, indem Sie einen sanften Stickstoffstrom blasen oder eine Biot-Ladung verwenden. V 10 Verdampfer rot lösen das Rohöl in sechs Millilitern eins zu eins Acetonitril und Wasser.

Anschließend frieren Sie die Probe ein und lyophilisieren Sie sie. Dieser Vorgang sollte nach der zweiten Lyophilisation noch einmal wiederholt werden. Erfassen Sie das Gewicht des Rohprodukts, lagern Sie es als trockenes Pulver bei minus 20 Grad Celsius durch eine Kombination aus schimmeliger analytischer HPLC und/oder Elektrospray-LCMS.

Die Reinheit des Rohprodukts und ob das gewünschte Molekulargewicht vorhanden ist, kann nach den im Text beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Das rohe Peptidgemisch kann dann mit einer Umkehrphasenvorbereitungs-HPLC gemäß dem schriftlichen Verfahren gereinigt werden. Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll zur Bildung von Blättern aus einem Einzelkettensequenz-spezifischen amphiphilen 36-me-Peptid.

Nachdem der Peptidstrang synthetisiert, gereinigt und lyophilisiert wurde, wird das resultierende weiße Pulver in DMSO aufgelöst, um eine zwei millimolare Stammlösung herzustellen. Besorgen Sie sich als Nächstes eine Dr.Glass-Datei, um eine 20-mikromolare Peptidlösung herzustellen. Zuerst fügen Sie 445 Mikroliter Milli Q Wasser und 50 Mikroliter 10 x Blattbildungspuffer hinzu.

Drehen Sie das Fläschchen zum Mischen. Fügen Sie dann fünf Mikroliter einer zwei millimolaren Peptid-Stammlösung hinzu und quellen Sie vorsichtig auf. Die resultierenden Lösungsblätter werden durch das sanfte Rühren der verdünnten wässrigen Peptidlösung gebildet.

Kippen Sie das verschlossene Glasfläschchen langsam von der horizontalen Position in die aufrechte Position. Ergibt in Blechen sanftes Schütteln, ergibt auch Bleche. Allerdings sind die Bleche bei vielen hochwertigen Blechen tendenziell kleiner und haben weniger gerade Kanten.

Drehen Sie die Glasfläschchen einen Tag lang langsam um die horizontale Achse mit einem Röhrchenrotator oder einer speziell angefertigten Wippe für die Fluoreszenzfärbung von Nanoblättern, fügen Sie einen Mikroliter 100 mikromolare Nilrot zu 100 Mikrolitern der Nanoblattlösung hinzu, um eine Endkonzentration von einem mikromolaren Nil zu erhalten. Rot ist ein umweltempfindlicher Farbstoff, dessen Fluoreszenzintensität zunimmt, wenn er in hydrophoben Umgebungen lokalisiert wird. Als nächstes stellen Sie eine 1%aros-Lösung in heißem Wasser her und gießen sie in eine Plastik-Petrischale.

Stellen Sie sicher, dass die aros-Lösung etwa einen Achtel Zoll dick ist, und lassen Sie die Lösung ungestört auf einer ebenen Fläche abkühlen. Nachdem die Aros fest werden, schneiden Sie mit einem Spachtel einen Zentimeter mal einen Zentimeter große Quadrate aus. Übertragen Sie dann die geschnittenen Quadrate auf einen Objektträger, um die Platten in der gleichen Ebene zu sammeln, und legen Sie einen Mikroliter Blattlösung auf das Stück Aros.

Nach zwei Minuten sollten die Aros den Puffer absorbieren und die Bleche an der Oberfläche zurücklassen. Bilden Sie das Blatt innerhalb von 15 Minuten ab. Alternativ können zum Abbilden von Folien und Lösungen 15 Mikroliter in einer 0,12-Millimeter-Dichtung mit einem Durchmesser von 20 Millimetern auf einem Objektträger geladen werden.

Decken Sie die Probe innerhalb weniger Tage mit einem Deckglas und einem Bild ab, um die REM von Nanoblättern durchzuführen. Zuerst werden Siliziumchips mit Plasma geätzt, um die Absorption der Nanoblätter zu unterstützen. Lassen Sie dann 20 Mikroliter Peptidblattlösung auf ein plasmabehandeltes Silikonsubstrat fallen und lassen Sie die Lösung nach drei Minuten einwirken, entfernen Sie die überschüssige Lösung mit der Spitze einer Kim-Wischpipette, geben Sie 20 Mikroliter Wasser auf die Oberfläche und leiten Sie die überschüssige Lösung erneut ab, um Puffer und Salze zu entfernen.

Alternativ werden die Peptidblattlösungen gegen Wasser dialysiert, um Puffer und Salz zu entfernen. In diesem Fall können 20 Mikroliter der dialysierten Blechlösung auf die plasmabehandelten Silikonsubstrate getropft und an der Luft trocknen gelassen werden. Nachdem die Schichtlösung auf den plasmabehandelten Siliziumsubstraten getrocknet ist, kann die Folie mit REM unter Verwendung eines Linsendetektors bei Strahlenergien zwischen einem Kilovolt und fünf Kilovolt abgebildet werden.

Es wurde die Synthese, Charakterisierung und Aufreinigung eines sequenzspezifischen 36-me-Blockladungspeptids durchgeführt, das sich zu einem hochgeordneten zweidimensionalen Nanoblatt faltet. Die Amine, die die Synthese des 36-me-Blockladungspeptids verwenden, werden Ethylendiamin zu Phenethyl, Amin und t-Butyl-Beta-Alanin machen. Nach der Synthese wurde das Rohpeptid mit 95%igem wässrigem TFA vom Harz abgespalten.

Nachdem die TFA-Lösung aufgefangen und verdampft wurde. Das rohe 36-Me-Blockladungspeptid wurde mit Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Die Masse des gereinigten Blockladungspeptids wurde dann durch moldy bestätigt.

Die beobachtete Masse 4981,2 stimmt eng mit der berechneten Masse von 4981,74 überein. Das lyophilisierte Pulver wurde in DMSO aufgelöst, um eine zwei Millimolare Stammlösung herzustellen, und bei vier Grad Celsius gelagert. Die Blätter wurden mit dem oben genannten Protokoll präpariert und mit Fluoreszenz-Optikmikroskopie abgebildet.

Es wird eine Vielzahl von Formen mit Merkmalsgrößen von bis zu 300 Mikrometern beobachtet, wobei insbesondere gerade Kanten hervorstechen. REM wurde auch verwendet, um die Bleche abzubilden, wobei in ähnlicher Weise markante gerade Kanten zu sehen waren. Dieses Video beschreibt ein einfaches und effizientes Protokoll für die feste Gesichtssynthese von Peptiden und die wässrige Selbstorganisation von Peptiden zu Nanoblättern.

Da buchstäblich Hunderte von am-Mean-Bausteinen leicht verfügbar sind und in diesem Protokoll verwendet werden können, ist der mit Polypeptiden zugängliche Designraum praktisch unbegrenzt. Peptide sind aufgrund ihrer synthetischen Flexibilität, Robustheit und Ordnung vielversprechende Materialien für die biomedizinische und nanowissenschaftliche Forschung. Insbesondere auf atomarer Ebene dienen die Nanoblätter als potenzielle Plattform für zweidimensionale Display-Gerüste, Membranmimetika, biologische Sensoren, Proteinmimetika und die Herstellung von Bauelementen.

Die Arbeit mit korrosiven Reagenzien wie Trior, Essigsäure und Bromessigsäure ist äußerst gefährlich, um Verletzungen zu vermeiden, alle Reaktionen in einem Abzug durchzuführen und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen.