Name: Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von 1,2-Dithiolan-modifizierten Peptiden und deren Charakterisierung durch Selbstassemblierung. Diese Methode ermöglicht effiziente Kupplung auf Harz mit nur einem Reinigungsschritt.

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Die Autoren möchten Danke Dr. B. Ellen Scanley für ihre technische Ausbildung und hilf mit die TEM an der Connecticut State Colleges und University (CSCU) Zentrum für Nanotechnologie und Dr. Ishita Mukerji an der Wesleyan University für den Zugriff auf ihre CD Spektrophotometer. Die Arbeit berichtet wurde zum Teil durch das Science Institute an der Fairfield University, die NASA Connecticut Space Grant-Konsortium und der National Science Foundation unter Grant Anzahl CHE-1624774 unterstützt.

(1) Synthese und Reinigung von 1,2-Dithiolane geändert Peptid
<ol><li>Synthese von Dithiolane Vorstufe, 3-(Acetylthio) -2-(Acetylthiomethyl) Propanoic Säure19.
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 g 3-Bromo - 2-(Bromomethyl) Propionsäure (1 Äquiv) aufgelöst in minimaler Menge von 1 M NaOH (ca. 4 mL), einen 25-mL Rundboden Reaktionskolben unter Rühren bei 55 ° C. Versiegeln der Reaktionskolben mit einem Septen und unter Stickstoffatmosphäre statt.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung mit 1,49 g Kalium Thioacetate (3.2 Äquiv) in 4 mL entionisiertem Wasser und 3 mL 2 M Schwefelsäure (H2SO4), Thioacetic Säure in Situzu schaffen.</li>
		<li>Ziehen Sie die Thioacetic Säurelösung in eine Plastik Einweg-10 mL-Spritze und legen Sie eine Nadel auf die Spritze. Fügen Sie die Mischung tropfenweise zu den Reaktionskolben durch piercing durch die Septen mit der Nadel. Weiter die Reaktion über Nacht bei 55 ° C.</li>
		<li>Beobachten Sie die Reaktion durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel 60 F254 Platten mit einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan (1:9). Visualisieren Sie den Fortschritt der Reaktion von Bromocresol grünen Fleck. Das Produkt hat eine Rf = 0,57.</li>
		<li>Nachdem die Reaktion abgeschlossen und auf Raumtemperatur abgekühlt ist, Ansäuern der Mischung auf pH 1 mit 2 M H2SO4. Ein gelbes Öl trennt aus der Lösung.</li>
		<li>Extrahieren Sie das Produkt mit kalten Chloroform (40 mL x 3). Kombinieren Sie die organischen Schichten und Trocknen über Magnesium-Sulfat. Entfernen Sie das Chloroform unter vermindertem Druck.</li>
		<li>Bestätigen Sie die Identität des Messguts isoliert, 1, durch Kernresonanzspektroskopie (NMR), wie in den Figuren 1 b und Cdargestellt. Die folgenden Ergebnisse zu erwarten: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10,1 (b, 1 H), 3.2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H), 2.4 (s, 6 H); 13 C-NMR, CDCl3, 75 MHz: d = 195.1 (CH3COS-), 177.6 (-COOH), 45,1 (-CH2S-), 30,5 (CH), 29.2 (-SCOCH3). Hinweis: Das Produkt ist ein gelbes Öl und hat einen Gesamtertrag von 83 %. Verwenden Sie das Produkt ohne weitere Reinigung.</li>
	</ol></li>
	<li>SPPS und am Harz Kupplung Dithiolane Vorstufe Hinweis: Die Festphasen-Peptidsynthese beschrieben wurde auf eine automatisierte Peptid-Synthesizer, die empfohlenen Hersteller-Protokolle durchgeführt. Einstellungen und Reagenzien möglicherweise für andere kommerzielle Instrumente oder angepasst, bei Verwendung spezieller Aminosäuren.<ol>
<li>0,156 g Rink Amid 4-Methylbenzhydrylamine (MBHA) Harz (0,1 Mmol) abwiegen und in einem Reaktionsgefäß platzieren. Anschwellen des Harzes in Dimethylformamid (DMF) für mindestens 15 Minuten vor Beginn der Synthese.</li>
		<li>Wiegen, 4 Entsprechungen der einzelnen Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützten Aminosäure (0,4 Mmol) in der Sequenz und 0,152 g N, N, N', N'- Tetramethyl-O-(1H- Benotriazol-1-Yl) Uran Hexafluorophosphate (0,4 Mmol, HBTU) für jede Aminosäure in der Sequenz. Jede Patrone enthält die Fmoc-geschützten Aminosäure und HBTU.</li>
		<li>Nach dem ausführen alle Pre-Synthese prüft auf dem Synthesizer (Nachfüllen Reagenzien, Reagenz Leitungen gespült und unter Druck alle Flaschen Reagenz), legen die Aminosäure-Patronen in das Karussell in der C' n ' Endstation Richtung. Legen Sie eine leere Patrone nach der endgültigen Aminosäure-Position für den letzten Schritt der N-terminalen Fmoc Deprotection.</li>
		<li>Das Peptid mit den empfohlenen Standardeinstellungen zu synthetisieren.<ol>
<li>DEPROTECT der Fmoc-Gruppe aus dem Harz mit 5 mL der 20 % Piperidin in DMF (5 min x 2).</li>
			<li>Waschen Sie das Harz mit DMF (6 x 5 mL) vor der Kupplung Schritt.</li>
			<li>Für einen einzigen Kupplung Schritt hinzu kommen 4 mL 0,4 M N-Methylmorpholine im DMF die Fmoc-geschützten Aminosäure und HBTU. Aktivieren Sie die Fmoc-geschützten Aminosäure-Lösung für 30 s bevor Sie die Lösung auf das Reaktionsgefäß übertragen. Hinweis: Die automatisierte Peptid-Synthesizer mischt das Harz und die Lösung von sprudelnden N2 Gas alle 30 s für 20 min während der Koppelung Reaktion erfolgt. Legen Sie für manuelle Peptidsynthese den Reaktionsbehälter auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Drehzahl für die Dauer der Kupplung Schritt.</li>
			<li>Abtropfen Sie die Lösung und waschen Sie das Harz mit DMF (3 x 5 mL).</li>
			<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4.1. durch 1.2.4.4 für jede Fmoc-geschützten Aminosäure in der C' n '-Endstation Richtung synthetisieren das Peptid von Interesse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Übertragen Sie nach der letzten N-terminalen Deprotection Schritt das Harz in einer Einwegspritze fritted. Waschen Sie das Harz mit DMF (3 x 5 mL) und Dichlormethan (DCM, 3 x 5 mL). Hinweis: Das Harz kann nach DCM Waschen in einem Vakuum Exsikkator aufzubewahren. Wenn das Harz vor der Kupplung gelagert wurde, sicherstellen Sie, dass das Harz in DMF vor der Kupplung Reaktion anschwellen.</li>
		<li>Ein paar den Dithiolane Vorläufer (1) an den N-Terminus des Peptids auf Harz durch Zugabe von 4 Entsprechungen von 1, 5 mL DMF, 4 Entsprechungen von HBTU und 10 Entsprechungen von N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA). Pre-aktivieren Sie die Kupplung Mischung für 10 min vor der Zugabe in das Harz mit fritted Spritze.</li>
		<li>Schütteln Sie die Kupplung Reaktion für 2 h. Waschen Sie nach 2 h des Harzes mit DMF (3 x 5 mL) und wiederholen Sie die Koppelung Reaktion mit schütteln über Nacht.</li>
		<li>Nach der zweiten Kupplung Waschen des Harzes mit DMF (3 x 5 mL) und DCM (3 x 5 mL). Hinweis: Das Harz kann an dieser Stelle unter Vakuum bis Dekolleté gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Thioacetate Deprotection und Peptid Dekolleté aus Harz
	<ol>
<li>Um die Thioacetate-Gruppe aus der N-Terminus Dithiolane Vorläufer deprotect, übertragen Sie das getrocknete Harz auf einer 10 mL-Mikrowelle-Reaktionsgefäß und 2 mL DMF. Lassen Sie das Harz zu Schwellen, das Schiff eine kleine magnetische Stir Bar hinzu, und mit einer niedrigen Geschwindigkeit von magnetischen rühren 15 min. wieder auszusetzen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL konzentrierter Ammonium Hydroxid, Kappe das Reaktionsgefäß mit Silikon Septen und legen Sie den Reaktionsbehälter in eine Mikrowelle-Reaktor mit Hilfe der Mikrowelle Einstellungen von 75 ° C für 45 min. unter Rühren.</li>
		<li>Nachdem die Mikrowelle Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie das Harz in saubere Einwegspritze fritted. Waschen Sie mit DMF (2 x 5 mL) und Methanol (MeOH, 2 x 5 mL).</li>
		<li>Fügen Sie eine Lösung der konzentrierten Ammonium Hydroxid in Methanol (1:4), für ein Gesamtvolumen von 5 mL. Lassen Sie über Nacht zu erhöhen Intramolekulare Oxidation von Disulfid Bindung in Dithiolane Ring zu schütteln.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz mit MeOH (2 x 5 mL) und DCM (3 x 5 mL). Hinweis: Das getrocknete Harz kann in einem Vakuum Exsikkator zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden.</li>
		<li>Das Harz mit Spritze mit sanft Schütteln für 1,5 h fügen Sie den Spaltung Cocktail hinzu. Die Spaltung cocktail verwendet ist 95 % Trifluoroacetic Säure (TFA), 2,5 % Triisopropylsilane (Tipps) und 2,5 % Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5 mL. Achtung: Arbeiten Sie unter chemischen Dampfhaube nur. TFA ist flüchtig und ätzend. Hinweis: Für die Mehrheit der Peptid-Sequenzen und Aminosäure Sidechain Gruppen zu schützen, ist die oben genannte Spaltung cocktail Lösung ausreichend; Allerdings können alternative Spaltung Cocktails für bestimmte Aminosäure-Seitenkette schützen Gruppen (in bestimmten Peptide mit Met, Trp, Cys und Arg) oder andere Harz Chemie20benötigt.</li>
		<li>Überstürzen Sie sich Rohöl Peptids in 25 mL kalte Diethylether in einem 50 mL konische Röhrchen durch tropfenweise Zugabe aus der fritted Spritze. Das Peptid ausfällt als weißer Feststoff. Pellet das Peptid durch Zentrifugation bei 1300 X g für 10 min. Dekantieren sorgfältig die Diethylether in einen separaten Behälter für Abfallsammlung.</li>
		<li>Das konische Rohr eine weitere 25 mL Diethylether hinzufügen und erneut aussetzen des Niederschlags durch aufschütteln. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 1300 X g für 10 min und Dekantieren Sie der Diethylether wieder. Trocknen Sie die Pellets unter Vakuum.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung von 1,2-Dithiolane geändert Peptid Hinweis: Das rohe-Peptid durch reverse-Phase-HPLC zu reinigen. Sammeln Sie und kombinieren Sie die Peptid-Gipfel und bestätigen Sie die Masse durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie.<ol>
<li>Löst das Roh-Peptid Pellet in minimaler Menge von Acetonitril mit 0,1 % TFA. Erhitzen Sie durch das Peptid Hydrophobie und Aggregation Neigung sich die Probe bei 40 ° C um Löslichkeit zu unterstützen. Hinweis: Vermeiden Sie höhere Temperaturen und Beschallung des Peptids zur Vermeidung von möglichen Disulfid Austausch Reaktionen21,22,23.</li>
		<li>Um 1 mL der Roh-Peptid für HPLC-Reinigung vorzubereiten, fügen Sie 400 μl konzentrierte Peptid-Lager in Acetonitril 600 μL von H2O mit 0,1 % TFA und Filter durch einen 22 μm Spritze Filter in ein HPLC-Fläschchen hinzu. Eine zusätzliche 5 % Isopropanol kann hinzugefügt werden, um Peptid-Aggregation und Niederschlag zu verhindern.</li>
		<li>Reinigen Sie dem Peptid mit C-18 Semi-präparative Spalte mit einer Durchflussmenge von 3 mL/min über einen linearen Farbverlauf von 15-55 % Acetonitril in 20 min. Set UV-Detektoren zu 222 nm (Amid Backbone) und 330 nm (Disulfid Bindung). Sammle und kombiniere die Gipfel von Interesse (Abb. 2A).</li>
		<li>Bestätigen Sie die Peptid-Produkt-Masse von MALDI-TOF Massenspektrometer im reflektron Modus (Abb. 2 b). Für die Analyse, mischen 0,5 μL des gesammelten Peak auf der MALDI-Platte mit 0,5 μl 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Matrix (10 mg/mL DHB in 50 % Acetonitril, 0,1 % TFA). Hinweis: Gemeinsame Addukte im MALDI-TOF-Massenspektrometrie umfassen das Natrium und Kaliumsalz Addukt ([M + Na]+ und [M + K]+) Gipfeln. Entsalzung der Probe vor der Analyse wird empfohlen, wenn die Salz Addukt Gipfeln das Signal der Hauptgipfel [M + H]+ unterdrücken. Darüber hinaus ist ein oxidierter Höhepunkt [M + O]+ auch in das 1,2-Dithiolane geändert-Peptid erkannt. Ein Bericht über Laser-induzierter Oxidation von der MALDI-Ionisation mit DHB-Matrix legt nahe, dass Faktoren wie probenkonzentration, Lösungsmittel und Laserintensität geändert werden können, um die MALDI induzierte Oxidation Artefakt24zu begrenzen.</li>
		<li>Nach der Bestätigung der richtigen Masse MALDI-TOF lyophilize das Peptid nach flash einfrieren. Bewahren Sie die lyophilisierten Peptid-Pulver unter Vakuum bis Montage.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Charakterisierung der supramolekularen Strukturen Self-Assembly
<ol><li>
Bildung von Amyloid Fasern
	<ol>
<li>Zur Selbstmontage Vorbereitung Lösung 1 mg das Peptid-Pulver mit einer Analysenwaage abwiegen. Lösen sich in einer Mischung (pH 7,5) von 20 % Acetonitril und 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, eine Endkonzentration von 1 mg/mL-Peptid-Montage-Mischung. Wirbel der Montagelösung und lassen bei Raumtemperatur zu montieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spektroskopische Charakterisierung von Amyloid Fasern
	<ol>
<li>Folgen Sie der Peptid-Montage über Fourier-Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) alle paar Tage. Eine breite Spitze zentriert um 1670 cm-1 ist die IR-Signatur aus unmontiert Peptide in der Probe-17. Die Peptid-Montage-Proben finden in der Regel ein bis zwei Wochen für die Breite unmontiert Peak zu verschwinden und Reifung zu erreichen.<ol>
<li>Trocknen Sie ein Aliquot von 8-10 μL der Montage-Lösung als dünner Film auf der ATR-Diamant-Kristall. Das Verschwinden eines großen und breiten Wasser-Peaks von 1640 bis 1630 cm-1 als die trockenen Film Formen zu überwachen.</li>
			<li>Erwerben Sie IR-Spektren von 1500-1800 cm-1 im Durchschnitt 50 Scans mit einer 2 cm-1 Auflösung. Subtrahieren Sie die Hintergrund-Scans vor jeder Probe-Scan und erwerben. Die IR-Signatur für β-Bogenmontage ist eine scharfe Spitze zwischen 1625 und 1635 cm-1 (Abbildung 3A)25,26.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Charakterisieren Sie die Peptid-Montage in β-Sheet reichen supramolekularen Strukturen durch kreisförmigen Dichroismus (CD). Notieren Sie die Spektren, die mit einem CD-Spectropolarimeter mit einem Peltier Temperatur-Kontrollsystem.<ol>
<li>Die Montage-Lösung in eine 0,1 mm Weg Länge Küvette 30 μl Pipette. Hinweis: Eine Küvettenhalter wird benötigt zum Spannen und positionieren Sie die kurzen Weg Länge Zelle in das Instrument.</li>
			<li>Legen Sie für jedes Spektrum CD-Instrument auf die folgenden Parameter: Scannen Wellenlängen von 300 nm bis 180 nm, Abtastrate von 100/min, Bandbreite von 1 nm, 25 ° C, durchschnittlich drei Scans.</li>
			<li>Sammeln Sie ein Spektrum des Puffers (20 % Acetonitril/10 mM HEPES, pH 7,5) und ziehen Sie von jeder Probe-Scan als Kontrolle. Die CD-Signatur für β-Bettwäsche ist eine minimale Ellipticity rund 220 nm (Abb. 3 b)27zentriert.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikroskopie von Amyloid Fasern
	<ol>
<li>Lassen Sie zwei bis drei Wochen für das Peptid Proben in β-Sheet reichen supramolekularen Strukturen Reifen. Hinweis: Die Baugruppen können mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) in früheren Stadien des Montageprozesses sowie abgebildet werden.<ol>
<li>Pipette 10 μL der Peptid-Montagelösung auf die Oberfläche des TEM Kohlenstoff-Gitter. Hinweis: Achten Sie darauf, die PIPETTENSPITZE an die rasteroberfläche nicht berühren. Hohe Präzision, selbstschließende Pinzette werden verwendet, um TEM Netz während der Vorbereitung zu halten.</li>
			<li>Warten Sie 1-2 min damit die Assemblys, auf die rasteroberfläche adsorbieren kann. Entfernen Sie überschüssige Probe durch berühren Filterpapier an den Rand des Rasters.</li>
			<li>Bereiten Sie einen 2 %-Uranyl-Acetat-Fleck durch Zugabe von 100 μl deionisiertes Wasser, im Handel erhältlichen 4 % Uranyl-Acetat-Lösung. Pipette 10 μL der 2 % Uranyl Acetat Fleck auf der Oberfläche und 2-3 min inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation überschüssige Fleck indem Sie auf Filterpapier an den Rand des Rasters.</li>
			<li>Legen Sie die TEM-Raster in ein Vakuum Exsikkator über Nacht. Speichern Sie unter Vakuum bis Bildgebung.</li>
			<li>Bild der vorbereiteten Proben mit TEM (Abbildung 3). Typische Kennwerte zur Mikroskopie sind wie folgt: Bilder bei Vergrößerungen von 9.300 X bis hin zu 23, 000 X, Wolfram-Glühfaden mit einer Beschleunigungsspannung von 120 kV. Hinweis: ImageJ kann verwendet werden, um durchschnittliche Faser Breite der supramolekularen Strukturen der erworbenen TEM Bilder28messen. Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Verschiedene Chemikalien in der Synthese, Reinigung, und Charakterisierung der beschriebenen 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide sind ätzende oder giftige und sollte nur unter einem chemischen Abzug verwendet werden. Verwenden Sie stets geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung (einschließlich Schutzbrille, Kittel, voller Länge Hose, geschlossene Schuhe) bei der Arbeit im Labor.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieser Artikel beschreibt die Details der Synthese und Reinigung von einer N-terminalen 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptid und die Charakterisierung der daraus resultierenden supramolekularen Strukturen. Die Synthese von 1,2-Dithiolane Peptids hier berichtet hat die Vorteile, einschließlich einer einstufigen Synthesis um Dithiolane Vorstufe, 3-(Acetylthio)-2 zu produzieren-Propanoic Säure (Acetylthiomethyl) und das Harz Mikrowelle Deprotection Reaktion der Vorläufer Thioacetate Schutz der Gruppe, um die ...

Die robuste Peptidbindung bilden Chemie beteiligt Festphasen-Peptidsynthese und die Fähigkeit zur Steuerung der Reihenfolge Länge und Zusammensetzung machen die Peptide, die in supramolekularen Strukturen stark erforschten Bereich selbst zusammensetzen. Die Faktoren, die zu kontrollieren und zu stabilisieren, Peptid selbst-zusammengebauten Strukturen, einschließlich Side-Chain sterische und elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoff-Bindung und hydrophobe Effekte1, dienen als eine Reihe von Design-Regeln. Wie die Forschung zu diesen grundlegenden Designregeln schreitet weiter voran, geht der nächste logische Schritt in Peptid Selbstmontage erweitert die Vielfalt der Peptid-basierte Strukturen und Funktionen. Während der Montage selbst Peptide sind vielseitige Biomaterial, das für viele biomedizinische Anwendungen herangezogen wurden, durch tuning die Peptid-Sequenz oder einer Baugruppe Bedingungen2,3,4, die Entwicklung von Strategien für nach dem Zusammenbau Änderungen an Peptid Nanofasern5,6,7,8,9 bleibt ein relativ unerforschten Bereich.
Dynamische Disulfid-Austausch und Thiol-Chemie an der Oberfläche der supramolekularen Strukturen ist ein Bereich, der das Potenzial hat, neuen und funktionalen Biomaterialien ergeben. Die Einbeziehung von 1,2-Dithiolane Moieties (häufig ein Derivat von Liponsäure (la) oder asparagusic Säure (aa)) gemeldet wurden, in Liposomen Systeme10,11, Block-Copolymere12,13, sowie Organisation von Ankern an Oberflächen14,15. Hier berichten wir über die Synthese und Charakterisierung eines selbstorganisierenden Peptids, abgeleitet aus dem nukleierenden Kern der Aβ-Peptid Zusammenhang mit Alzheimer-Krankheit, die am N-Terminus mit einem 1,2-Dithiolane funktionelle Gruppe16geändert wird, 17. Die daraus resultierenden supramolekularen Fasern dienen nun als eine experimentelle Plattform die Disulfid-Austausch und Thiol Reaktivität an der supramolekularen Oberfläche des Amyloid Fasern18zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Eisbahnamid MBHA-Harz, hohe Belastung</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>RAM-5-HL</td><td>Kontakt mit Haut und Augen vermeiden;</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td> nicht einatmen <td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>Flüssigkeit und Dampf entzündbar; reizt Augen und Haut; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung; Von offener Flamme fernhalten</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-V</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen;</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH</td> nicht einatmen <td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-L</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen;</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH</td><td>nicht einatmen Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-KBC</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen; nicht einatmen</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-F</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen;</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH</td> nicht einatmen <td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-A</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen;</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH</td><td>nicht einatmen Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-QT</td><td>Persönliche Schutzausrüstung tragen; nicht einatmen</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorophosphat</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>26432</td><td>Verursacht Reizungen der Haut, der Augen und der Atemwege; nicht einatmen; unter der Motorhaube oder in gut belüfteten Räumen verwenden</td></tr><tr><td>0,4 M N-Methylmorpholin in DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-MM-L</td><td>leichtentzündlich; Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung; Von Hitze fernhalten und den Behälter fest verschlossen halten; Nicht einatmen oder schlucken; Waschen Sie die Haut gründlich nach dem Umgang mit</td></tr><tr><td>20% Piperidin in DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-PPR-L</td><td>Verursacht schwere Augen- und Hautverbrennungen; Entflammbare Flüssigkeit und Dampf; </td></tr><tr><td>Dichlormethan</td> nicht einatmen <td>Fisher Scientific</td><td>D37-4</td><td>Kann Krebs erzeugen; Nicht einatmen; Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung; Nur unter der Motorhaube verwenden; bei Kontakt mindestens 15 Minuten lang mit Wasser aufgehen und ärztliche Hilfe einholen</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Entzündlich; reizend für die Augen; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung; Nur unter einem Abzug verwenden; von offener Flamme oder heißer Oberfläche fernhalten; Bei Kontakt mindestens 15 Minuten lang mit Wasser spülen und einen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A116-50</td><td>Verursacht schwere Verbrennungen; nicht einatmen; schädlich für Wasserorganismen; persönliche Schutzausrüstung verwenden; nur unter Abzug verwenden; bei Berührung mindestens 15 Minuten mit Wasser spülen und sofort ärztliche Hilfe einsuchen</td></tr><tr><td>4% Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 22400-4</td><td>Nicht einatmen; gesundheitsschädlich für Wasserorganismen</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure</td><td>Acros Organics</td><td>AC172571000</td><td>Nicht einatmen; im Freien oder in gut belüfteten Räumen</td></tr><tr><td>verwenden Stickstoffgas</td><td>TechAir</td><td></td><td>Inhalt unter Druck, kann bei Erhitzung explodieren</td></tr><tr><td>3-Brom-2-(brommethyl)propionsäure</td><td>Alfa Aesar AAA1963014</td><td></td><td>Nicht einatmen; Reizt Haut und Augen; ätzend</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>Persönliche Schutzausrüstung verwenden; nur unter dem Abzug verwenden; bei Kontakt den Bereich mindestens 15 Minuten lang spülen und einen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>Kaliumthioacetat</td><td>Acros Organics</td><td>AC221300250</td><td>Verursacht Haut- und Augenreizungen; nicht einatmen; persönliche Schutzausrüstung</td></tr><tr><td>verwenden Schwefelsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA213</td><td>Verursacht Verbrennungen; von Wasser fernhalten; von brennbarem Material fernhalten; Nicht einatmen; persönliche Schutzausrüstung zu verwenden; bei Kontakt den Bereich mindestens 15 Minuten lang ausspülen und einen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>chloroform-d</td><td>Acros Organics AC320690075</td><td></td><td>mögliche Krebsgefahr; Reizung von Haut und Augen; nicht einatmen; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung; Nur unter Abzug verwenden; Bei Kontakt den Bereich mindestens 15 Minuten lang ausspülen und einen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td>Mögliche Krebsgefahr; reizt Haut und Augen; nicht einatmen; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung; Nur unter Abzug verwenden; Bei Kontakt den Bereich mindestens 15 Minuten lang ausspülen und ärztlichen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin</td><td>Acros Organics</td><td>AC367841000</td><td>Leicht entzündlich; schädlich für Wasserorganismen; persönliche Schutzausrüstung tragen;</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td> nicht schlucken <td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Ätzend; Methanol nicht einatmen</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Entzündbare Flüssigkeit und Dämpfe; persönliche Schutzausrüstung zu verwenden; Nicht einatmen; Bei Kontakt den Bereich mindestens 15 Minuten lang ausspülen und einen Arzt aufsuchen</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td>entzündlich; persönliche Schutzausrüstung verwenden; Behälter fest verschlossen halten</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>Extrem entzündlich; Reizt Haut und Augen; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung</td></tr><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoesäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39319-10x10MG-F</td> nicht <td>einatmen; reizt Haut und Augen</td></tr><tr><td>Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure Alfa</td><td>Aesar</td><td>AAJ67635EXK</td><td></td></tr><tr><td>c18 zip-tip</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)-phospinhydrochlorid</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel 60 F254 beschichtete DC-Platten mit Aluminiumrücken</td><td>EMD Millipore</td><td>1.05549.0001</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Präzisions-NMR-Röhren</td><td>Bel-Art</td><td>663000585</td><td>5mm AD</td></tr><tr><td>Norm-Ject-Vollkunststoffspritzen</td><td>Air Tite</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Einwegnadel</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>BD 305185</td><td>gebrauchte Nadeln werden in einem Abfallbehälter für scharfe Gegenstände entsorgt</td></tr><tr><td>Einweg-Frittenspritze</td><td>Torviq</td><td>SF1000LL</td><td>10 ml Frittenspritzen wurden in dem Bericht verwendet, aber größere Spritzen sind verfügbar, wenn sie für eine Synthese in größerem Maßstab benötigt werden.</td></tr><tr><td>Carbon-Gitter</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>CF200-CU</td><td>Stellen Sie sicher, dass Sie Proben und Färbungen auf der Seite des Kohlenstoffgitters vorbereiten, nicht auf der glänzenden Kupferseite des Gitters</td></tr><tr><td>selbstschließende Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>78318-3X</td><td>sehr scharfe Spitzen, Länge: 120 mm</td></tr><tr><td>0,1 mm kurze Weglänge Zelle</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>20/C-Q-0.1</td><td>Zerbrechliche</td></tr><tr><td>10-ml-Gefäßkappen</td><td>CEM</td><td>909210</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Druckbehälter</td><td>CEM</td><td>908035</td><td></td></tr><tr><td>Aeris Semi-Prep HPLC-Säule</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4632-N0</td><td>150 x 10 mm</td></tr><tr><td>Küvettenhalter</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>CH-2049</td><td>Benötigt bei Verwendung von Zellen mit kurzer Weglänge</td></tr><tr><td>PS3-Peptidsynthesizer</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiscoverSP Mikrowellenreaktor</td> CEM-Zentrifuge <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HERMLE</td><td>Z 206 A</td><td>verwendet einen festen 6x50 mL Rotor</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>UV-Detektor</td></tr><tr><td>Kernspinresonanzspektrometer</td><td>Avance, Bruker</td><td></td><td>300 MHz</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-Massenspektrometer</td><td>, Axima Confidence, Shimadzu-Gefriertrockner</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>Millrock Technology</td><td>BT85A</td><td></td></tr>, <tr><td>Fourier-Transform-Infrarotspektrometer</td><td>, Alpha-Tensor, Bruker-Transmissionselektronenmikroskop</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>Tecnai Spirit, FEI</td><td></td><td>Verwendet mit Gatan Orius, Faseroptische CCD-Digitalkamera. Abgerufen am CSCU Center for Nanotechnology</td></tr><tr><td>Circular Dichroism Spectropolarimeter</td><td>J-810, JASCO</td><td></td><td>Wird mit einem Peltier-Temperaturregler mit sechs Zellen verwendet. Abgerufen an der Wesleyan University.</td></tr></tbody></table>

synthese und charakterisierung von 1,2-dithiolane geändert selbstorganisierende peptide

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

Dieser Bericht konzentriert sich auf die Synthese von 1,2-Dithiolane ein N-Terminus selbstorganisierende Peptid und die Charakterisierung der resultierenden geändert selbst montiert supramolekulare Strukturen. Der Syntheseweg nutzt der Festphasen-Peptidsynthese mit der auf-Harz-Kopplung von Dithiolane Vorläufer Molekül, 3-(Acetylthio) -2-(Acetylthiomethyl) Propanoic Säure und die Mikrowellen-gestützte Thioacetate deprotection des Peptids N-Terminus vor dem endgültigen Spaltung aus dem Harz der 1,2-Dithiolane Ausbeute geändert Peptid. Nach der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Reinigung des 1,2-Dithiolane Peptids, abgeleitet aus dem nukleierenden Kern der Aβ-Peptid verbunden mit Krankheit Alzheimers zeigt das Peptid in Kreuz-β-Amyloid-Fasern selbst zusammensetzen. Protokolle zur Charakterisierung der Amyloid Fasern von Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie (CD) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden vorgestellt. Die Methoden von N-terminale Anpassung mit einem 1,2-Dithiolane Glyko-gut charakterisierten selbstorganisierende Peptide können jetzt erkundet werden, als Modellsysteme, Post-Montage Modifikation Strategien entwickeln und dynamische kovalente Chemie zu erkunden Supramolekulare Peptid Nanofaser Oberflächen.

Abgesehen von der ersten einstufigen Synthese von Dithiolane Vorläufer Molekül tritt auf der Rest der Peptid-Synthese von 1,2-Dithiolane geändert auf festen Unterlage (Abb. 1A). Die Umwandlung von 3-Bromo - 2-(Bromomethyl) Propionsäure, 3-(Acetylthio) -2-(Acetylthiomethyl) Propanoic Säure, die Dithiolane Vorläufer wird bestätigt von 1H und 13C-NMR (Abbildung 1 b und C) bevor es ist gekoppelt...

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Da die Strukturen zur Erhöhung der Funktionalität supermolekularer Strukturen zunehmen, kann diese Methode des Einbaus von 1,2-Dithiolangruppen mit selbstorganisierenden Peptiden dazu beitragen, wichtige Fragen zur Reaktivität auf supermolekularen Oberflächen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kopplung und Entschützung des 1,2-Dithiolan-Vorläufermoleküls auf dem Harz mit nur einem einzigen Reinigungsschritt des endgültigen modifizierten Peptids erfolgt. Da die Zeit, die die Assemblierungen benötigen, um zu ihren endgültigen supermolekularen Strukturen zu reifen, unterschiedlich ist, ist eine visuelle Demonstration der Charakterisierungsmethoden und -ergebnisse für die supermolekularen Assemblierungen von entscheidender Bedeutung.Zur Synthese des Dithiolan-Vorläufers löst man zunächst ein Gramm 3-Brom-2-proprionsäure in etwa vier Millilitern einmolarem Natriumhydroxid in einem 50-Milliliter-Reaktionskolben mit rundem Boden bei 55 Grad Celsius unter Rühren. Wenn das gesamte Reagenz in Lösung suspendiert wurde, wird der Reaktionskolben mit einer Septa verschlossen und der Kolben unter Stickstoffatmosphäre gestellt. Als nächstes fügen Sie 1,49 Gramm

synthesis-characterization-12-dithiolane-modified-self-assembling

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Eine einfache und allgemeine manuelle Peptoid Syntheseverfahren mit Grundausstattung und kommerziell erhältlichen Reagenzien beschrieben, so dass Peptoide problemlos in den meisten Labors synthetisiert werden. Die Synthese, Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptoid 36mer beschrieben, sowie deren Selbstorganisation zu hoch geordneten Nanoschichten.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Dieses Video demonstriert die Selbstorganisation von Amyloid-Peptiden zu einer Beta-Faltblatt-reichen supramolekularen Struktur mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie. Ein Infrarotstrahl wird durch einen Kristall mit hohem Brechungsindex geleitet, und die Energieabsorption über die Grenzfläche des Kristalls und der Probe wird aufgezeichnet. Die Sekundärstrukturen der Probenproteine werden durch die Analyse ihrer charakteristischen Absorptionsspitzen in bestimmten Bereichen des...

Eine Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Technik zur Untersuchung der Selbstorganisation von Peptiden

Dieses Papier beschreibt die Bildung von hochgeordnete Strukturen auf Peptid-Basis durch die spontane Prozeß der Selbstorganisation. Das Verfahren nutzt Handel befindlichen Peptiden und gemeinsame Laborgeräte. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Peptiden angewendet werden und kann auf die Entdeckung von neuen Peptid-basierten Anordnungen führen.

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode um eine Nanoemulsion eine Ölsäure acids-platinum(II) Konjugat mit einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Tripeptid stabilisiert zu synthetisieren. Die Nanoemulsion Formen unter milden synthetischen Bedingungen über Self-assembly von der KYF und das Konjugat.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

Ein Protokoll wird für die Synthese von informationscodierten Peptoid-Oligomeren und für die sequenzgesteuerte Selbstmontage dieser Peptoide in molekulare Leitern unter Verwendung von Ainen und Aldehyden als dynamische kovalente Reaktantenpaare und Lewis-saure Seltenerd- Metalltriflate als Mehrzweckreagenzien.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.

Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Dieses Protokoll stellt drei schnelle und einfache Präparationsmethoden vor, die Umweltbedingungen nutzen, um die Selbstorganisation von Peptiden zu Hydrogelen auszulösen. Zusätzlich wird die Charakterisierung von Peptidhydrogelen beschrieben, die zeigt, dass unter diesen einfachen Bedingungen mechanisch stabile Peptidhydrogele gebildet werden können.

Herstellung von mechanisch stabilen selbstorganisierten Peptiden, Hydrogelen

Peptid tertiäre Amide (PTA) sind eine Superfamilie von Peptidmimetika umfassen, sind aber nicht auf Peptide, Peptoide und N-methylierten Peptide beschränkt. Hier beschreiben wir eine Synthesemethode, die sowohl Split-and-Pool-und Sub-Monomer-Strategien kombiniert, um eine ein-Bead-one-Verbindung Bibliothek von PTAs synthetisieren.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Erfahren Sie die Synthese von 1,2-Dithiolan-modifizierten Peptiden und deren Charakterisierung durch Selbstassemblierung. Diese Methode ermöglicht effiziente Kupplung auf Harz mit nur einem Reinigungsschritt.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

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