Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

Da die Strukturen zur Erhöhung der Funktionalität supermolekularer Strukturen zunehmen, kann diese Methode des Einbaus von 1,2-Dithiolangruppen mit selbstorganisierenden Peptiden dazu beitragen, wichtige Fragen zur Reaktivität auf supermolekularen Oberflächen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kopplung und Entschützung des 1,2-Dithiolan-Vorläufermoleküls auf dem Harz mit nur einem einzigen Reinigungsschritt des endgültigen modifizierten Peptids erfolgt. Da die Zeit, die die Assemblierungen benötigen, um zu ihren endgültigen supermolekularen Strukturen zu reifen, unterschiedlich ist, ist eine visuelle Demonstration der Charakterisierungsmethoden und -ergebnisse für die supermolekularen Assemblierungen von entscheidender Bedeutung.

Zur Synthese des Dithiolan-Vorläufers löst man zunächst ein Gramm 3-Brom-2-proprionsäure in etwa vier Millilitern einmolarem Natriumhydroxid in einem 50-Milliliter-Reaktionskolben mit rundem Boden bei 55 Grad Celsius unter Rühren. Wenn das gesamte Reagenz in Lösung suspendiert wurde, wird der Reaktionskolben mit einer Septa verschlossen und der Kolben unter Stickstoffatmosphäre gestellt. Als nächstes fügen Sie 1,49 Gramm Kaliumthioacetat und drei Milliliter zweimolare Schwefelsäure zu vier Millilitern deionisiertem Wasser hinzu, um Thioessigsäure in situ herzustellen.

Die Thioessigsäurelösung wird in eine 10-Milliliter-Einwegspritze aus Kunststoff aspiriert und mit einer 18-Gauge-Nadel versehen, dann mit der Nadel die Septen durchstochen, um das Gemisch tropfenweise in den Reaktionskolben zu geben und die Reaktion über Nacht bei 55 Grad Celsius fortzusetzen. Überwachen Sie am nächsten Morgen die Reaktion durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten 60 F254 unter Verwendung einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan und visualisieren Sie den Reaktionsfortschritt durch Bromkresolgrünfärbung. Wenn die abgeschlossene Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wird das Gemisch mit zweimoliger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von eins angesäuert.

Ein gelbes Öl sollte sich aus der Lösung trennen, dann das Produkt mit drei 40-Milliliter-Zusätzen von kaltem Chloroform extrahieren und die organischen Schichten zum Trocknen über Magnesiumsulfat kombinieren, wobei das Chloroform unter reduziertem Druck entfernt wird. Das Produkt sollte ein gelbes Öl mit einer Gesamtausbeute von 83% sein und kann ohne weitere Reinigung verwendet werden. Um den Dithiolan-Vorläufer an den N-Terminus des on-Harz-Peptids zu koppeln, fügen Sie vier Äquivalente des Dithiolan-Vorläufers zu fünf Millilitern Dimethylformamid, vier Äquivalenten von HBTU und 10 Äquivalenten von DIPEA hinzu.

Lassen Sie das Kopplungsgemisch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur voraktivieren, bevor Sie die Probe in die N-Terminus-Harz-haltige Fritte-Spritze geben. Schütteln Sie die Kupplungsreaktion zwei Stunden lang, gefolgt von drei Fünf-Milliliter-Wäschen in frischem Dimethylformamid und wiederholen Sie die Kupplungsreaktion und das Schütteln über Nacht. Nach der zweiten Kopplung wird das Harz mit drei Fünf-Milliliter-Dimethylformamid-Waschvorgängen, gefolgt von drei Fünf-Milliliter-Dichlormethan-Harzwaschungen, gewaschen und das getrocknete Harz in ein 10-Milliliter-Mikrowellen-Reaktionsröhrchen überführt.

Um die Thioacetatgruppe vor dem N-Terminus-Dithiolan-Vorläufer zu schützen, geben Sie dann zwei Milliliter Dimethylformamid in das Röhrchen. Lassen Sie das Harz quellen, geben Sie einen kleinen magnetischen Rührstab in das Gefäß und resuspendieren Sie das Harz mit langsamem magnetischem Rühren. Geben Sie nach 15 Minuten zwei Milliliter konzentriertes Ammoniumhydroxid in das Röhrchen, verschließen Sie das Reaktionsgefäß mit einem Silikonseptum und stellen Sie das Gefäß für 45 Minuten bei 75 Grad Celsius unter Rühren in einen Mikrowellenreaktor.

Wenn die Mikrowellenreaktion abgeschlossen ist, geben Sie das Harz in eine saubere, frittierte Einwegspritze und waschen Sie das Harz mit zwei Fünf-Milliliter-Dimethylformamid- und zwei Fünf-Milliliter-Methanol-Waschmitteln. Geben Sie nach der letzten Wäsche fünf Milliliter Dekolleté-Cocktail in die harzhaltige Spritze für eine 1 1/2-stündige Inkubation unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Um einen Milliliter Rohpeptid für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC-Reinigung herzustellen, fügen Sie 400 Mikroliter konzentriertes Peptidmaterial in Acetonitril zu 600 Mikrolitern Wasser hinzu, das mit 0,1 % Trifluoressigsäure ergänzt ist, und filtrieren Sie die Lösung durch einen 22-Mikrometer-Spritzenfilter in ein HPLC-Fläschchen.

Um das Peptid zu reinigen, verwenden Sie eine semi-präparative C18-Säule mit einer Flussrate von drei Millilitern pro Minute über einen linearen Gradienten von 15 bis 55 % Acetonitril in 20 Minuten, wobei die UV-Detektoren auf 222 Nanometer und 330 Nanometer eingestellt sind. Sammeln und kombinieren Sie dann die Peaks of Interest. Zur Bestätigung des Peptidprodukts durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationslaufzeit oder MALDI-TOF-Massenspektrometrie mischen Sie 0,5 Mikroliter des gesammelten Peaks auf eine matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisationsplatte, die 0,5 Mikroliter 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Matrix enthält.

Um eine Selbstorganisationslösung herzustellen, lösen Sie ein Milligramm des lyophilisierten Peptidpulvers in einer Mischung aus 20 % Acetonitril und 10 Millimolar HEPES in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, wirbeln Sie dann die Assemblierungslösung vor und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur zusammensetzen. Wenn die Peptidanordnung die Reifung erreicht, trocknen Sie acht bis 10 Mikroliter der Assemblierungslösung als dünnen Film auf dem abgeschwächten Totalreflexionsdiamantkristall und überwachen Sie das Verschwinden eines großen und breiten Wassergipfels von 1640 bis 1631 umgekehrten Zentimetern, wenn sich der Trockenfilm bildet. Erfassen Sie Hintergrund- und Infrarotspektren von 1500 bis 1800 inversen Zentimetern mit durchschnittlich 50 Scans mit einer Auflösung von zwei inversen Zentimetern, wobei die Hintergrundscans vor jedem Probenscan subtrahiert werden.

Die Infrarotsignatur für den Aufbau von Beta-Faltblättern sollte als scharfe Spitze zwischen 1625 und 1635 inversen Zentimetern beobachtet werden. Wenn die Peptidproben zu beta-faltblattreichen supermolekularen Strukturen gereift sind, laden Sie 10 Mikroliter der Peptidassemblierungslösung auf die Oberfläche eines Transmissionselektronenmikroskop-Kohlenstoffgitters und lassen Sie die Anordnungen ein bis zwei Minuten lang an der Oberfläche des Gitters adsorbieren. Berühren Sie das Filterpapier mit dem Rand des Gitters, um die überschüssige Probe zu entfernen, und geben Sie 10 Mikroliter frisch zubereiteten 2%-Uranylacetat-Fleck für eine zwei- bis dreiminütige Inkubation auf die Gitteroberfläche, entfernen Sie dann den überschüssigen Fleck mit Filterpapier und legen Sie das Gitter über Nacht in einen Vakuumexsikkator, bevor Sie am nächsten Tag mit der Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden.

Abgesehen von der anfänglichen einstufigen Synthese des Dithiolan-Vorläufermoleküls erfolgt der Rest der 1,2-Dithiolan-modifizierten Peptidsynthese auf festem Träger. Die Umwandlung von 3-Brom-2-proprionsäure in 3-2-Propansäure, den Dithiolan-Vorläufer, wird durch Proton und Kohlenstoff-13-Kernspinresonanz bestätigt, bevor sie an das freie N-Terminus-Amin eines Peptids gekoppelt wird, das sich noch auf dem Harz befindet. Nach der Entschützung wird das Rohpeptid durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und die Masse des Produkts durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestätigt.

Die Fourier-Transformations-Infrarot- und Zirkulardichroismus-Spektroskopie kann verwendet werden, um die Selbstorganisation des gereinigten 1,2-Dithiolan-Peptids in reifen Amyloidfasern zu überwachen und ihre erweiterte Beta-Faltblatt-Konformation zu charakterisieren. Anschließend können die Fasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Während diese Methoden verwendet werden können, um den N-Terminus jeder Peptidsequenz zu modifizieren, die sich noch auf dem Harz befindet, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Bedingungen für die Peptid-Selbstorganisation für jedes Peptid optimiert werden sollten.

Diese Techniken, bei denen selbstorganisierende Peptide um 1,2-Dithiolangruppen ergänzt werden, werden es Forschern auf dem Gebiet der Biomaterialien ermöglichen, die reaktive Oberfläche von Supermolekülen zu erforschen.