Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, peptidbasierte Anordnungen in Form von biomolekularen Halsketten zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Stammlösungen hergestellt werden, indem das Diphenylalanin und sein Bach-geschütztes Analogon getrennt in der entsprechenden Menge HFP auf eine Endkonzentration von 100 Milligramm pro Milliliter gelöst werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Peptidstammlösungen in einem Verhältnis von fünf zu drei zu mischen, indem 10 Mikroliter der Diphenylalanin-Peptidlösung mit sechs Mikrolitern der Bach-geschützten Diphenylalanin-Peptidlösung gemischt werden.

Als nächstes wird die gemischte Peptid-Stammlösung zu frisch zubereitetem 50%igem Ethanol hinzugefügt, um eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter Diphenylalanin bzw. drei Milligramm pro Milliliter für Bach-geschütztes Diphenylalanin zu erhalten. Letztendlich wird die Rasterelektronenmikroskopie eingesetzt, um die biomolekularen Halsketten zu zeigen, die von den beiden Peptiden gemeinsam zusammengesetzt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von Prozessen der Selbstorganisation, wie sie hier gezeigt werden, besteht darin, dass es durch spontane Abfolge möglich ist, komplexe Strukturen zu erzeugen.

In vitro stellen hier die Selbstorganisation von Peptiden dar, insbesondere die Co-Assemblierung von Dipeptiden, die dieses Verfahren demonstrieren, wird Nuran, ein Doktorand ehemaliges Labor, sein. Um das Verfahren zur Selbstorganisation von Diphenylalanin in röhrenförmige Strukturen zu beginnen, bereiten Sie 100 Milligramm pro Milliliter Peptidstammlösung vor, indem Sie das Diphenylalaninpeptid in HFP auflösen. Um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten, mischen Sie sie einige Sekunden lang mit einem Wirbelmischer und stellen Sie sie einige Minuten lang auf die Bank, bis das Peptid vollständig aufgelöst und die Lösung klar ist.

Die Peptid-Stammlösung wird in dreifach destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter verdünnt. Bewahren Sie die Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf. Für das Co-Assemblierungsverfahren lösten zwei Milligramm Diphenylalaninpeptid und ein Milligramm Bach-geschütztes Diphenylalaninpeptid getrennt in HFP bis zu einer Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter.

Mischen Sie dann die Lösungen mit einem Wirbelmischer für einige Sekunden und stellen Sie sie für einige Minuten auf der Bank beiseite, bis sich die Peptide vollständig aufgelöst haben und die Lösungen klar sind. Mischen Sie die Peptidstammlösungen in einem Verhältnis von fünf zu drei, indem Sie 10 Mikroliter der Diphenylalanin-Peptidlösung mit sechs Mikrolitern der durch Bach geschützten Diphenylalanin-Peptidlösung mischen. Mischen Sie dann die Lösung mit einem Vortex-Mischer.

Anschließend fügen Sie acht Mikroliter der gemischten Peptid-Stammlösung zu 92 Mikrolitern frisch zubereitetem 50%igem Ethanol hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter für Diphenylalanin und drei Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Für Bach geschütztes Diphenylalanin. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vorsichtig zu mischen.

Nach 24-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur einen 10-Mikroliter-Tropfen der Peptidlösung auf ein Glasdeckglas auftragen und bei Raumtemperatur trocknen lassen. Beschichten Sie die Probe auf dem Glasdeckglas 90 Sekunden lang mit einer dünnen Goldschicht mit einem Sputterter. Wenn Sie fertig sind, bilden Sie die Baugruppen mit REM ab, das mit 10 bis 20 Kilovolt arbeitet.

Für die TEM-Analyse geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Peptidlösung auf ein 200-Mesh-Kupfergitter, das mit Kohlenstoff bedeckt und durch einen Polymerfilmträger stabilisiert ist. Entfernen Sie nach einer Minute die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier. Füllen Sie anschließend eine 2%ige Urinalacetatlösung in eine Spritze und filtern Sie sie mit einer Nullpunkt-22-Mikrometer-Filtereinheit.

Um in der Probe zu bleiben, geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Urinalacetatlösung auf das Gitter. Entfernen Sie nach 30 Sekunden überschüssige Flüssigkeit mit Hilfe von Filterpapier und bilden Sie die Probe auf dem Gitter ab, indem Sie TEM bei 120 Kilovolt betreiben. Für die FTIR-Analyse tragen Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen der Peptidlösung auf ein Calciumfluoridfenster auf.

Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur trocknen, um das Wassersignal im FTIR-Spektrum zu unterdrücken. Geben Sie einen Tropfen Deuteriumoxid auf die trockene Peptidprobe. Wiederholen Sie nach dem Trocknen der Probe in einem Trockenmittel unter Vakuum die vorherigen Schritte zweimal, um einen maximalen Wasserstoff-Deuterium-Austausch zu gewährleisten.

Nehmen Sie abschließend die FTIR-Spektren mit einem deuterierten Triglycinsulfat-Detektor auf. Bestimmen Sie die minimalen Transmissionswerte mit der mit dem Gerät gelieferten Software, um die Bildung geordneter Strukturen durch Selbstorganisation von Peptiden zu demonstrieren. Die Co-Assemblierung von zwei einfachen aromatischen Peptiden wurde mittels REM- und TEM-Analyse präpariert und charakterisiert.

Die gemischten Peptide bildeten eine Architektur aus kugelförmigen Anordnungen mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern, die durch längliche Strukturen mit einem Durchmesser von einigen hundert Nanometern verbunden sind, da die Morphologie sehr ähnlich ist, um ihre Fäden zu schlagen. Diese Strukturen werden als molekulare Halsketten bezeichnet. Eine FM-Analyse dieser Strukturen zeigt deutlich ihre dreidimensionale Anordnung.

Darüber hinaus deutet die REM-Analyse verschiedener Regionen verschiedener Proben darauf hin, dass dieser Prozess mit hoher Ausbeute ablief. Die FTIR-Analyse gibt Aufschluss über die Sekundärstruktur der Peptidanordnungen. Das absorbierende Spektrum des Amids.

Eine Bande der sphärischen Anordnungen, die durch das Bach-geschützte Diphenylalanin-Peptid in Ethanol gebildet werden, zeigte einen einzelnen Amid-Peak bei 1.657 reziproken Zentimetern, was auf eine Bestätigung der Alpha-Helix hinweist. Die röhrenförmigen Strukturen, die durch das Diphenylalaninpeptid in Ethanol gebildet werden, zeigten zwei ausgeprägte Peaks bei 1.613 reziproken Zentimetern und 1.682 reziproken Zentimetern, die mit einer Beta-Faltblatt-Sekundärstruktur korrelieren. Das FTIR-Spektrum der biomolekularen Halsketten, das durch die Co-Assemblierung der beiden Peptide gebildet wird, wird von der Peakzuordnung für jedes einzelne Peptid verschoben.

Der erste Peak bei 1.653 reziproken Zentimetern entspricht einer Alpha-Helix-Struktur und der zweite Peak bei 1.684 reziproken Zentimetern bezieht sich auf eine Beta-Turn-Bestätigung. Die Differenz zwischen den verschiedenen Spektren deutet auf eine einzigartige Struktur für biomolekulare Halsketten hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine peptidbasierte Assemblierung durch Farbstoffpeptid erzeugt.

Diese Methode kann leicht auf andere Biomoleküle angewendet werden, um eine komplexe Struktur zu bilden. Vergessen Sie nicht, dass das Gehen mit organischen Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann. Handschuhe. Der Laborkittel und die Schutzbrille sollten bei diesem Eingriff immer getragen werden.