Name: Facile Protokoll für die Synthese von selbst zusammenbauen Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) und der damit verbundenen Biomaterialien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Lernen Sie die Synthese von Polyamin-basierten Peptid-Amphiphilen (PPA) mit ungeschützten Bausteinen. Diese Methode vereinfacht die Herstellung selbstorganisierender Biomaterialien für Anwendungen in der Materialwissenschaft.

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Dieses Projekt wurde gefördert von der University of Nebraska Medical Center (Startkapital, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) und der American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. Allgemeines Protokoll für die Synthese von PPA
<ol><li>Das Ausmaß der Synthese (in der Regel Mmol) zu berechnen. Diese Skala basiert auf die Masse des PPA Zielbetrag. Denken Sie daran, die die Effizienz der Reaktion der SPPS mit einem Zuwachs von Aminosäure-Sequenz allmählich abnimmt. Daher ist die genaue Reaktion Effizienz schwer zu kalkulieren.</li>
	<li>Berechnen Sie das Gewicht des Harzes nach dem Laden des Harzes verwendet werden. Das Laden ist finden Sie auf den Container oder das Analyse-Protokoll des Harzes und ausgedrückt in Mmol/g. Die folgende Formel kann verwendet werden, für die Berechnung des Gewichts des Harzes:</li>
	<li>Sorgfältig abwägen, 2-Chlorotrityl-Chlorid-Harz (in unserem Fall ist das Laden ~0.85 Mmol)</li>
	<li>Legen Sie das Harz in einer fritted Synthese-Schiff mit den folgenden Spezifikationen: Kapazität – 50 mL, Fritted Disc – 25 mm, Porosität-Medium.</li>
	<li>Das Harz 15 mL Dichlormethan (DCM) hinzufügen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Synthese Schiff zu einem drehzahlgeregelten mechanische Shaker (Flasche Shaker/Rührer), und die Schiffe zu einem Winkel von 45° (oder horizontal) um Agitation zu maximieren.</li>
	<li>Die harzkügelchen anschwellen lassen für 15 min. Schwellung erhöht die Ausbeute der Reaktion denn es erleichtert die molekulare Diffusion und die Zugänglichkeit des aktiven Zentrums Kupplung Effizienzsteigerung.</li>
	<li>Das Harz 8 äquivalente (2 Mmol für eine 0,25 Mmol) der gewünschten Polyamin (Spermin, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-Diaminopropane, etc.) hinzu und lassen Sie es für 5 h reagieren. Hinweis: Eine geringere Reaktionszeit würde Ertrag reduzieren.</li>
	<li>Ein Kaiser Teste (siehe Tabelle der Materialien) um erfolgreiche Kopplung von Polyamin, das Harz zu bestätigen. Erfolgreiche Kopplung der primäre Amine ergibt eine violett/blauen Farbe, die das freie Amin entspricht.</li>
	<li>Schützen Sie die primäre Amingruppe mit 4 Entsprechungen der 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), aufgelöst in wasserfreiem Methanol (15 mL), durch Schütteln der Reaktion Mischung über Nacht11. Hinweis: Eine geringere Reaktionszeit verringert Ertrag.</li>
	<li>Durchführen Sie einen Kaiser-Test. Eine blaue Farbe aus der Harz-Wulst bestätigt erfolgreichen Schutz. Im Falle einer erfolglosen Schutz des primären Amins wiederholen Sie den vorherigen Schritt.</li>
	<li>Abtropfen Sie die DCM und waschen Sie die Harze zweimal mit einer Mischung aus DCM und DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>20 äquivalente (5 Mmol) von di-Tert Butyl di-Carbonat (Boc) in DCM (20 mL) auflösen und die Reaktion auf 3 h gehen lassen.</li>
	<li>Tun ein Chloranil test (siehe Tabelle der Materialien), um umfassenden Schutz des sekundären Amins zu bestätigen. Ein positives Testergebnis (Schutz) ergibt eine farblose oder helle gelbe Farbe. Kostenlose sekundäre Aminen geben eine dunkle Farbe grün/blau, während primäre Amine eine rote Farbe zu geben.</li>
	<li>Abtropfen Sie die Lösungsmittelgemisches und waschen Sie zweimal mit einer Mischung aus DCM und DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Hinzufügen einer 2 % igen Lösung von Hydrazin im DMF (10 mL) und 1 h schütteln.</li>
	<li>Teste ein Kaiser um erfolgreiche Deprotection des primären Amins zu bestätigen.</li>
	<li>
Fügen Sie die gewünschten Aminosäuren in umgekehrter Reihenfolge in dem Sie schreiben/sie ziehen würde. Peptide stammen aus der N-Termini, die C-Termini aber synthetisiert in die entgegengesetzte Richtung, C n. Zum Beispiel für ein PPA erfordern die folgende Peptid Kern - GLFD-, Asparaginsäure (D), gefolgt von Phenylalanin (F), Leucin (L), und schließlich Glycin (G) hinzufügen. Hinweis: Für die meisten Aminosäuren eignet sich der folgende Kupplung Cocktail zur Befestigung an den Harzen Polyamin geladen.<ol>
<li>4-äquivalente (1 Mmol) der Fmoc-geschützten Aminosäure, 3,95 Entsprechungen der 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexaﬂuorophosphate (HBTU) und 15 äquivalente Diisopropylethyl Amin (DIPEA) vermischen.</li>
		<li>In einer Mischung aus DCM und DMF (1:1, 15 mL) lösen Sie auf und Beschallen Sie den Cocktail für 2 min (bis zur vollständigen Auflösung).</li>
		<li>Warten Sie eine weitere 3 – 5 min um die Aktivierung der Carbonsäure auf die Aminosäure zu gewährleisten.</li>
		<li>Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf das Schiff. Führen Sie die Reaktion für 2-4 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Wir fanden folgende als effiziente Alternative zu HBTU (in der Regel erfordert geringere Mengen an Aminosäuren und der Haftvermittler): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.</li>
		<li>Teste ein Kaiser um erfolgreiche Kopplung zu bestätigen.</li>
		<li>De-schützen der Fmoc-Gruppe der Aminosäure durch Hinzufügen einer 20 % igen Lösung von 4-Methyl-Piperidin (10 mL) in DMF. Tun Sie es zweimal, jedes Mal, wenn das Reaktionsgemisch für 15 min schütteln. Hinweis: Eine effiziente Alternative für Fmoc-Entfernung ist Piperazin/DBU-12.<ol>
<li>Führen Sie eine DCM (15 mL) waschen zwischen Ergänzungen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Teste ein Kaiser um erfolgreiche de-Schutz der Aminosäure zu bestätigen.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz gründlich und entfernen Sie alle Spuren von 4-Methyl. Waschen Sie das Harz zweimal mit DMF (10 mL), jedem Waschgang dauert 5 min, und schließlich mit DCM (10 mL) für 10 Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie die restlichen Aminosäuren nacheinander wiederholen die Kupplung und de-Schutz Schritte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Endlich, nach Kupplung alle erforderlichen Aminosäuren, konjugieren der hydrophobe Heck die letzten Aminosäure des Konstrukts Polyamin-Peptid:
	<ol>
<li>Fügen Sie 10 Entsprechungen für die gewünschte Carbonsäure Funktionalität 9,5 Entsprechungen von HBTU und 12 äquivalente DIPEA in DCM und DMF-Gemisch (1:1, 20 mL) gelöst. Hinweis: Denken Sie daran als einige Schwänzen einen unterschiedlichen Anteil an Lösungsmittel (in der Regel eine größere % von DCM) oder der Zusatz oder einem anderen Lösungsmittel wie N-Methylpyrrolidon (NMP) brauchen können.</li>
		<li>Beschallen den Cocktail für 5 – 10 min bis zur Auflösung (wir haben gesehen, es dauert länger, bis das Heck vollständig auflösen) und fügen Sie zum Schiff. Hinweis: Für die Endstücke mit mehreren reaktiven Zentren, müssen sie vor der Kupplung sie geschützt werden.</li>
		<li>Führen Sie diese Reaktion (Kopplung der hydrophoben Tail) für mindestens 5 h, obwohl es ratsam ist, sie über Nacht für den höchsten Ertrag durchführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) PPA Spaltung von solide Unterstützung
Das Ziel dieses Schrittes ist die Spaltung des PPA aus dem Harz und die Boc-Schutzgruppen aus Aminosäuren und Polyamin Rückstände zu entfernen.
<ol><li>Waschen Sie das Harz mit DMF (8 mL für 2 min) und zweimal mit DCM (8 mL, jedes Mal für 5 min). Lassen Sie vor jeder Zugabe das Lösungsmittel aus dem Gefäß ab. Nach die letzten Wäsche durchgeführt wird, Trocknen des Harzes unter Vakuum für 15 Minuten.</li>
	<li>Bereiten Sie die Dekolleté-Lösung unter Verwendung der folgenden Mischungsverhältnis: 28:1:1 Trifluoroacetic Säure (TFA): H2O: Triisopropyl Silan (Tipps). Zu 15 mL der Spaltung cocktail 14 mL von TFA, 0,5 mL H2O und 0,5 mL Tipps hinzufügen.</li>
	<li>Das Harz dieser Spaltung-Lösung hinzu und schütteln Sie für 2 – 4 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sammeln Sie die Lösung in einer 25 oder 50 mL Runde untere Kolben.</li>
	<li>Konzentrieren der TFA im Vakuum bis 1 – 2 mL mit einem drehverdampfer bei vermindertem Druck beim Erhitzen der Mischung bei 40 ° C (55 ° C zur Vermeidung von Zersetzung des PPA nicht überschreiten).</li>
	<li>Fügen Sie nach der Verdunstung die erhaltenen TFA-Lösung hinzu (tropfenweise) ein Rundboden-Fläschchen mit wasserfreiem kalten Äther (15 mL). Dies wird sofort der PPA auszufällen.</li>
	<li>Darüber hinaus fügen Sie wasserfreie kalten Äther (5 mL hinzu) in den original Kolben, wo die TFA konzentriert war.</li>
	<li>Beschallen Sie dieses Fläschchen um zusätzliche Feststoffe zu erholen und zu kombinieren mit der Äther-Lösung von Schritt 2,6. Hinweis: Die Übertragung von Pipette kann mit einem kleinen Volumen von DCM gewaschen werden. Vermeiden Sie DMF während des Prozesses eingeführt, weil es dazu neigt, eine gelartige Substanz bilden.</li>
	<li>Legen Sie die Flasche (überdacht) im Inneren des Kühlschrankes und Niederschlag zu maximieren über Nacht stehen lassen.</li>
	<li>Sammeln Sie die ausgefällte Material durch Vakuumfiltration mit einem gesinterten Scheibe Filter Trichter. Die ideale Porengrößen sind fein oder Mittel.</li>
	<li>Waschen Sie das Präzipitat zweimal mit kalten Äther (5 – 10 mL) zu jeder verbleibende organische Stoffe zu entfernen.</li>
</ol>3. Identifizierung von das Rohprodukt mit Hilfe der MALDI-getrocknet-Drop-Methode
<ol><li>
Matrix-Vorbereitung für die Analyse im positiven Modus:
	<ol>
<li>Um Molekulargewicht Analyse mittels Massenspektrometrie Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) zu starten, fügen Sie 10 bis 20 mg α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Hinzufügen einer Lösung von Wasser/Acetonitril (1:1, 1,0 mL) mit 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA). Mischen Sie gründlich durch aufschütteln. Hinweis: Diese Matrix sollte für die positiv geladenen Peptide verwendet werden. MALDI-negativ-Modus ist ähnlich aber erfordert eine Matrix mit 9-Aminoacridine mit 0,1 % Ammoniak als lösemittelzusatz.</li>
		<li>Die Edelstahl-Zieltafel für MALDI 1 – 2 µL der Probe hinzu und trocknen Sie die Probe in Luft. Fügen Sie 1 – 2 µL der Matrix und trocknen Sie es erneut. Hinweis: Die Platten sind kreisförmige Markierungen gerasterten entlang der Zieltafel, um die Stelle zu finden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben in MALDI-Instrument, um ihre Identität zu verifizieren. Electrospray Ionisierung (ESI) ist eine gültige Alternative zur Bestätigung der Identität der PPA.</li>
</ol>4. Reinigung des PPA mit präparativen Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Reinigung
<ol><li>
Den PPA Niederschlag in einen Mindestbetrag von Acetonitril und Wasser auflösen.
	<ol>
<li>Als Faustregel gilt lösen Sie 100 mg von trockenen rohen PPA in weniger als 5 mL Acetonitril und Wasser auf. Mehr hydrophobe PPA erfordern einen größeren Prozentsatz von Acetonitril aufzulösen und erfordern möglicherweise auch ein größeres Volumen des Lösungsmittels in der Regel abhängig von der Nettoladung der PPA (Tabelle 1).</li>
		<li>Wenn vollständige Auflösung nicht stattfindet, fügen Sie 1 % TFA (ACN oder H2O). Es ist auch möglich, fügen Sie Spuren von anderen kompatiblen Lösungsmittel, einschließlich Dimethylsulfoxide, Methanol oder Isopropanol (begrenzen ihre Inhalte auf 5 %).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösungsmittel</td>
			<td colspan="2">Positiv geladene PPA</td>
			<td colspan="2">Negativ geladene PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1 % TFA in Wasser</td>
			<td colspan="2">0,1 % NH3 in Wasser</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1 % TFA in ACN</td>
			<td colspan="2">0,1 % NH3 ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lösungsmittel Systeme. Vorgeschlagenen Lösungsmittelsystem für positiv und negativ aufgeladen PPA.
<ol start="2"><li>Das PPA mit einem Horn-sonikator für 20 min bei 10 s-Pulse mit Amp1 von 48 % oder für 2-3 h in ein Ultraschallbad zu beschallen.</li>
	<li>
Anschließend Filtern Sie mit einem 0,45 μm Spritze Filter gefolgt durch Filtration mit einem 0,20 μm Polytetrafluorethylen (PTFE) Spritze Filter. Die PPA-Lösung sollte klar und frei von allen partikulärer Materialien.
	<ol>
<li>Wenn die Filtration zu schwierig ist, für einen längeren Zeitraum hinweg beschallen. Es wird dringend empfohlen, dass die PPA Lösung gereinigten sofort nach der Spritze Filtration als längerer Lagerung verursachen dürfte es zu aggregieren oder gelate, die erneute Beschallung und vielleicht Re Filtration erfordern wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während und nach der Reinigung verwenden Sie HPLC Grade Lösungsmittel oder diejenigen, die durch eine 0,25 μm Spritze Filter/Membran gefiltert werden. Hinweis: Die am häufigsten verwendeten Lösungsmittel Bedingungen PPA zu reinigen bestehen in einem Farbverlauf von H2O und ACN.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Standardinstrument der Reverse-Phase-HPLC für dieses Protokoll. Es sollte eine Elution gradient Programmierer, eine binäre solvent-Delivery-System, ein UV-Detektor erkennt bei 220 und 254 nm und eine programmierbare Fraktionssammler umfassen. Die maximale Durchflussmenge sollte 50 mL/min sein.</li>
	<li>Verwendung einer C-18 umgekehrt Phase Spalte für die Trennung. Spalten mit folgenden Abmessungen verwendet werden, abhängig von der Masse der solide, geläutert und das Netz Aufladen des PPA (Tabelle 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PPA-kostenlos</td>
			<td>Partikelgröße</td>
			<td>Spaltengröße</td>
			<td>Masse des rohen PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ Ve geladenen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-Ve geladenen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ Ve geladenen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-Ve geladenen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Spalten vorgeschlagen: Spalte Dimensionen, Partikelgrößen und die maximale Belastbarkeit pro Injektion für C18 reverse Phase HPLC-Säulen
<ol start="7"><li>Injizieren Sie PPA mit einem Volumen durch beide die Kapazität der Spalte und das Volumen der Probenschleife von der HPLC bestimmt. Führen Sie die Gradienten HPLC-Methode gemäß den Einstellungen, die in Tabelle 3 (Elution Zeit von 40 Minuten) gesehen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zeit</td>
			<td>Lösungsmittel (Acetonitril)</td>
			<td>Lösungsmittel B (Wasser)</td>
			<td>Durchfluss (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5 %</td>
			<td>95 %</td>
			<td rowspan="5">Förderleistung hängt die Spalte Verpackung und seine Größe.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5 %</td>
			<td>95 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95 %</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100 %</td>
			<td>0 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5 %</td>
			<td>95 %</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Empfohlene Steigung: Vorgeschlagene umgekehrter Phase Farbverlauf zeigen die relative Zusammensetzung des Wasser Vs Acetonitril über einen Zeitraum von Zeit. Die Durchflussmenge wird über die Spalte Spezifikationen abhängen.
<ol start="8"><li>
Analysieren Sie die Fraktionen gesammelt auf die verschiedenen Reagenzgläser mit MALDI und ermitteln Sie, welche Röhre (oder Rohre) der PPA enthält. Dies wird durch das Studium des Molekulargewichtes gefunden in jedem Röhrchen beurteilt.
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die Reinheit der Fraktionen auf eine analytische HPLC. Verwenden Sie ein HPLC-Gradient-System ausgestattet mit einem UV-Detektor am 220 nm.</li>
		<li>Andernfalls gibt es Verunreinigungen, einen zusätzliche Zyklus der Reinigung mittels HPLC. Der oben genannten Farbverlauf für präparative HPLC verwendet kann verkleinert werden, mit der analytischen HPLC mit Online-Spalte-Konverter-Software zu verwenden. Jede Fraktion sein viel ≥95 % rein physikalische Charakterisierung oder biologische Bewertung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Fraktionen in einer großen Runde Talsohle Kolben oder verdampfungskolben zu sammeln und alle Acetonitril und das meiste Wasser entfernen. Die endgültige PPA-Lösung sollte nicht mehr als 10 mL betragen.</li>
	<li>Übertragen Sie dieses Konzentrat auf ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Beachten Sie, dass PPA Waschmittel-ähnliche Substanzen; So entstehen Bläschen beim Verdampfen des Lösungsmittels. Wir haben festgestellt, dass die Zugabe von Äthylalkohol Blasenbildung vermindert.</li>
	<li>Vakuum-Konzentrat das Konzentrat. Während die Vakuumverdampfung kann eine große Menge des PPA an den Wänden des Behälters halten. Dies durch wiederholt spülen der Flasche Wand mit HPLC Wasser zu erholen. Das Gesamtvolumen der konzentrierten PPA und die rinsate sollte nicht mehr als 30 mL betragen.</li>
	<li>Legen Sie die wässerige Lösung innerhalb einer 50 mL-Tube.</li>
	<li>
Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff diese PPA-Lösung: Hinweis: Flash Einfrieren Ergebnisse in kleinere Eiskristalle, die schneller in den Gefriertrockner erhaben werden. Langsameren Einfrieren kann zudem die Bildung von selbst-zusammengebauten supramolekularen Strukturen erlauben. Eine weitere Alternative (aber weniger wünschenswert) ist, nach und nach in einem-80 ° C Gefrierschrank einzufrieren oder zu frieren mit einer Trockeneis + Aceton Mischung<ol>
<li>Vor dem Einlegen die Zentrifugenröhrchen in den Gefriertrockner, Perforieren Sie oder lösen Sie die Kappe des Rohres zu Feuchtigkeit in der Probe zu entkommen und erhalten in dem Kühlaggregat gesammelt. Stellen Sie die Lyophilisation Einheit bis-54 ° C und 0,016 Mbar eingestellt. Hinweis: Eine weitere Möglichkeit ist die Kappe entfernen und legen Sie ein Tuch (mit einem Gummiband) auf die Öffnung. Außerdem haben wir festgestellt, dass Proben in einem Winkel Einfrieren oder brechen des Eises in kleine Portionen für eine schnellere und bessere Lyophilisierung Zunahme der Fläche erlaubt.</li>
		<li>Wenn das fest beginnt zu schmelzen, kann dies darauf hindeuten, Spuren von einem organischen Lösungsmittel (in der Regel Acetonitril) vorhanden sind. Wiederholen Sie die Schritt, Einfrieren und bewerten Sie den Zustand der Gefriertrocknung.</li>
		<li>Wenn das Schmelzen anhält, gibt es zwei mögliche Lösungen:<ol>
<li>Split, die Probe in zwei Portionen (in Rohren platziert werden), mit Wasser verdünnen und wieder einfrieren. Verwenden Sie nicht diese Lösung oft weil große Mengen an organischen Lösungsmitteln können das Gerät beschädigen.</li>
			<li>Alternativ legen Sie die Probe in einen Kolben und weitere verdunsten Sie der organische Lösemittel unter Vakuum. Lyophilizing ein Beispiel, das in flüssiger Form ist in der Regel führt zu stoßen und Verlust des PPA Compounds.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Speicherung der PPA
<ol><li>PPA mit den Kappen angezogen und auf ein Rohr mit einem entsprechenden Etikett mit Parafilm versiegelt in einer-20 ° C aufbewahren.</li>
	<li>Vor dem Gebrauch bring das PPA Umgebungstemperatur in einer Vakuumkammer zur Vermeidung von Kondensation von Wasserdampf auf der PPA.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären

Die hier beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu synthetisieren PPA Brunnen als PAs sowie im Zusammenhang mit Peptid-basierte Moleküle (z. B. Hybrid PA-Peptoids). Obwohl die Synthese von Peptiden mit SPPS ein einfaches Verfahren ist, kann die Synthese von Peptiden mit biologischen homing Moleküle besonders schwierig sein. Polyamine wie Spermin, Spermidine, Diethyelenetriamine, etc., können als homing Moleküle für die Zielgruppenadressierung Krebs Zellen13fungieren. PPA können...

Selbstorganisierende Peptid amphiphilen (PAs) sind eine Klasse von Biomaterialien, die in der Regel bestehend aus folgenden Segmenten: (a) hydrophilen Kopf, (b) Linker-Region und (c) hydrophobe Endstück. Die meisten PAs in der Literatur beschriebene besitzen einen hydrophilen Kopf bestehend aus geladenen oder polaren Aminosäure Rückstände1,2,3,4. PAs haben ein breites Anwendungsspektrum in der Biomedizin einschließlich Drug-Delivery, Krankheit Diagnostik, regenerative Medizin, etc.5gefunden. Basierend auf ihrer Aminosäuresequenz, können PAs eine Vielzahl von Nanostrukturen einschließlich kugelförmige Micellen und Nano-Filamente bilden. Vor kurzem haben wir eine Klasse von Hybrid Polyamin-basierte Peptid amphiphilen, genannt PPA6berichtet. Die Morphologien, selbstorganisierende Kinetik und metabolischen Abbau von diesen Biomaterialien, fanden sich auf ihre solubilizing Kopfgruppe bezogen werden. Darüber hinaus zeigte die PPA-Nanostrukturen nicht Toxizität gegenüber Säugerzellen (MiaPaCa2 und HeLa-Zelle Linien) in den geprüften Konzentrationen. PPA-basierte darin sind attraktive Drug Delivery Fahrzeuge, weil: (1) Polyamin Aufnahme und Stoffwechsel hat gezeigt, dass Krebszellen erhöht werden, (2) kationische Nanostrukturen erreichen Endosomal Flucht7,8, Das führt zu höheren Durchblutung und Wohnsitz innerhalb einer Zelle, und (3) sie haben ein unterschiedliches metabolische Profil im Vergleich zu PA; zum Beispiel werden sie stabiler gegenüber Proteasen im menschlichen Körper gefunden (obwohl sie vielleicht empfindlich auf andere Enzyme, wie z. B. Amin oxidasen)9,10. Darüber hinaus wurden PPA haben unterschiedliche Morphologien, physikalisch-chemischen Eigenschaften, Nanopartikel Steifigkeit und Montage Kinetik je nach Länge und Ladung der einzelnen PPA Molekül6gefunden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Synthese, die Identifikation und die Reinigung des PPA, die auch zur Vorbereitung des PAs oder ähnlichen Hybrid-Peptid-Molekülen angewendet werden können.
Weil Polyamine nicht häufig in ihren geschützten Formen im Handel erhältlich sind, und weil die primäre und sekundäre Amine Polyamine zu schützen ist von größter Bedeutung für diese Konjugation mit Aminosäuren und anderen Molekülen, wir haben skizziert die synthetische Schritte um ihren Schutz zu gewährleisten. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache Methode zur Konjugation Polyamine zu Aminosäuren zur Verfügung zu stellen. Polyamine fehlt eine carboxylic Gruppe; Daher können nicht sie Rink Amid oder Wang Harze gekoppelt werden. Stattdessen sollten Harze wie 2-Chlorotrityl-Chlorid für das synthetische Protokoll. Die größte Herausforderung für die PPA-Synthese ist die Anwesenheit der primären und sekundären Amin funktionellen Gruppen. Für unsere Zwecke geschützt wir alle sekundären Aminen in der Polyamin unter Beibehaltung der primären Aminogruppe auf das Polyamin frei, um die Kupplung Reaktion ermöglichen. Die Reaktion erfolgte auf einer festen Unterlage, die nach den Prinzipien der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) um die Aufarbeitung nach jedem Kupplung und Deprotection Schritt zu erleichtern. Das folgende Protokoll ist für die manuelle und automatisierte Synthese von PPA (obwohl die Überprüfung der einige Schritte in ein automatisiertes System schwierig sein wird). Die Synthese dieser Moleküle kann auch durchgeführt werden auf eine automatisierte Synthesizer oder mit Hilfe eines Mikrowellen-Reaktors (automatisierte oder halbautomatisierte). Das Reaktionsschema wurde in Abbildung 1zusammengefasst.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> Abbildung 1: (A) A allgemeine Reaktionsschema für die Synthese von PPA. (B) repräsentative Polyamine, die benutzt werden können synthetisiert PPA hier beschrieben. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>2-Chlortritylchlorid-Harz</td><td>AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM Synthesegefäß&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Acros</td><td>AC406920250</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Handgelenkschüttler</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Testkit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethylamino]-ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Methanol</td><td>Acros</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Chloranil-Testkit</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>VWR Katalog #</td></tr><tr><td>Di-tert Butyldicarbonat&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazin</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>FIsher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylpiperidin&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>FIsher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-Aminoacridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Spritzenvorsatzfilter: PTFE-Membran</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

facile protokoll für die synthese von selbst zusammenbauen polyamin-basierte peptid amphiphilen (ppa) und der damit verbundenen biomaterialien

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) sind eine neue Klasse von selbstorganisierenden AMPHIPHILE Biomaterialien im Zusammenhang mit dem Peptid amphiphilen (PAs). Traditionelle PAs besitzen geladenen Aminosäuren als Gefäss-Gruppen (Lysin, Arginin), die direkt zu einem Lipid-Segment verbunden sind oder eine Linker-Region, die aus der neutralen Aminosäuren enthalten können. Tuning der Peptidsequenz PAs kann unterschiedliche Morphologien erzielt werden. Ebenso PPA besitzen eine hydrophobe Segment und neutralen Aminosäuren, aber auch Polyamin Moleküle wie Wasser Gefäss-(hydrophile) Gruppen enthalten. Wie der Fall mit PAs, können PPA auch selbst in verschiedenen Morphologien, einschließlich kleine Stäbchen, verdrehte Nano-Bänder und fusionierte Nano-Blätter, wenn er im Wasser aufgelöst zusammensetzen. Das Vorhandensein von primären und sekundären Aminen auf einem einzigen Polyamin-Molekül stellt jedoch eine große Herausforderung bei der PPA zu synthetisieren. In diesem Beitrag zeigen wir ein einfaches Protokoll, anhand der Literatur Präzedenzfälle, eine einfache Synthese von PPA mit Festphasen-Peptidsynthese (SPPS). Dieses Protokoll kann zur Synthese von PAs und andere ähnliche Systeme erweitert werden. Wir zeigen auch die Schritte, die zur Spaltung von der Harz, Identifikation und Reinigung benötigt werden.

Nach der Synthese und Reinigung und vor der physikalisch-chemischen oder biologischen Auswertung empfiehlt es sich die Massen der PPA sind erneut geprüft und die Reinheit mittels analytischen HPLC ermittelt. Für die Materialcharakterisierung oder biologische Bewertung, PPA müssen eine Reinheit von &gt; 95 %. Abbildung 2 zeigt die HPLC Spur (oben) und MALDI-Spektren (unten) bestätigt die Präsenz des Produkts. Analytische HPLC-Anlagen werden die Fläche unter de...

Die Synthese von amphiphilen Polyamin-basierte Peptid (PPA) ist eine große Herausforderung aufgrund der Anwesenheit von mehreren Amin Stickstoffe, die vernünftige Nutzung des Schutzes von Gruppen, um diese reaktive Funktionalitäten Maske erfordert. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode für die Vorbereitung dieser neuen Klasse von selbstorganisierenden Molekülen.

Facile Protokoll für die Synthese von selbst zusammenbauen Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) und der damit verbundenen Biomaterialien

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Diese Methode kann Schlüsselfragen beantworten, wie man Peptid-Amphiphile zu Polyaminen dekoriert und wie man achteckige Schutzgruppen verwendet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie hybride Peptid-Amphiphile mit ungeschützten chemischen Bausteinen erzeugen können, die mehrere reaktive Seiten enthalten. Das Verfahren wird von Mehdi, Nathalia und Krishnaiah, Laborstudenten des Conda Sheridan Labors, vorgeführt. Wiegen Sie zunächst 2-Chlorotritylchlorid-Harz vorsichtig ab und geben Sie das Harz in ein frittiertes Synthesegefäß mit mittlerer Porosität und einem Fassungsvermögen von 50 Millilitern.Befestigen Sie als Nächstes das Synethesegefäß an einem mechanischen Schüttler mit variabler Geschwindigkeit und drehen Sie das Gefäß in einen 45-Grad-Winkel, um die Bewegung zu maximieren. Geben Sie dann 15 Milliliter DCM zum Harz. Nachdem Sie die Harzkügelchen 15 Minuten lang quellen gelassen haben, fügen Sie dem Harz acht Äquivalente des gewünschten Polyamins hinzu und lassen Sie es fünf Stunden lang reagieren.Nach fünf Stunden wird ein Kaisertest durchgeführt, um eine erfolgreiche Reaktion des Polyamins mit dem Harz zu bestätigen. Schützen Sie anschließend die primäre A

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Eine einfache und allgemeine manuelle Peptoid Syntheseverfahren mit Grundausstattung und kommerziell erhältlichen Reagenzien beschrieben, so dass Peptoide problemlos in den meisten Labors synthetisiert werden. Die Synthese, Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptoid 36mer beschrieben, sowie deren Selbstorganisation zu hoch geordneten Nanoschichten.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Dieses Papier beschreibt die Bildung von hochgeordnete Strukturen auf Peptid-Basis durch die spontane Prozeß der Selbstorganisation. Das Verfahren nutzt Handel befindlichen Peptiden und gemeinsame Laborgeräte. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Peptiden angewendet werden und kann auf die Entdeckung von neuen Peptid-basierten Anordnungen führen.

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

Wir präsentieren ein neues Polyacrylamid-Hydrogel, genannt Hydroxy-PAAm, die mit minimalen Kosten oder Know-how eine direkte Bindung von ECM-Proteine ​​ermöglicht. Die Kombination von Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Mikrokontaktdruck erleichtert eine unabhängige Steuerung der vielen Hinweise des natürlichen Zellmikroumgebung für die Untersuchung zellulärer mechanostransduction.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Peptid tertiäre Amide (PTA) sind eine Superfamilie von Peptidmimetika umfassen, sind aber nicht auf Peptide, Peptoide und N-methylierten Peptide beschränkt. Hier beschreiben wir eine Synthesemethode, die sowohl Split-and-Pool-und Sub-Monomer-Strategien kombiniert, um eine ein-Bead-one-Verbindung Bibliothek von PTAs synthetisieren.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Es wird ein Protokoll zur Synthese von Peptoiden mit gemischter kationischer Funktionalität in der gleichen Sequenz vorgestellt (Lysin- und Arginin-Typ-Monomere). Anschließende Tests dieser Verbindungen gegen Leishmania mexicana, die protozoischen Parasiten, die kutane Leishmaniose verursachen, werden ebenfalls beschrieben.

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode um eine Nanoemulsion eine Ölsäure acids-platinum(II) Konjugat mit einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Tripeptid stabilisiert zu synthetisieren. Die Nanoemulsion Formen unter milden synthetischen Bedingungen über Self-assembly von der KYF und das Konjugat.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

Ein Protokoll wird für die Synthese von informationscodierten Peptoid-Oligomeren und für die sequenzgesteuerte Selbstmontage dieser Peptoide in molekulare Leitern unter Verwendung von Ainen und Aldehyden als dynamische kovalente Reaktantenpaare und Lewis-saure Seltenerd- Metalltriflate als Mehrzweckreagenzien.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

Dieser Artikel enthält Protokolle für die Konstruktion und Selbstmontage von Nanostrukturen aus gammamodifizierten Peptidnukleinsäure-Oligomeren in organischen Lösungsmittelmischungen.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Dieses Protokoll stellt drei schnelle und einfache Präparationsmethoden vor, die Umweltbedingungen nutzen, um die Selbstorganisation von Peptiden zu Hydrogelen auszulösen. Zusätzlich wird die Charakterisierung von Peptidhydrogelen beschrieben, die zeigt, dass unter diesen einfachen Bedingungen mechanisch stabile Peptidhydrogele gebildet werden können.

Herstellung von mechanisch stabilen selbstorganisierten Peptiden, Hydrogelen

Lernen Sie die Synthese von Polyamin-basierten Peptid-Amphiphilen (PPA) mit ungeschützten Bausteinen. Diese Methode vereinfacht die Herstellung selbstorganisierender Biomaterialien für Anwendungen in der Materialwissenschaft.

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Facile Protokoll für die Synthese von selbst zusammenbauen Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) und der damit verbundenen Biomaterialien

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