Facile Protokoll für die Synthese von selbst zusammenbauen Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) und der damit verbundenen Biomaterialien

Diese Methode kann Schlüsselfragen beantworten, wie man Peptid-Amphiphile zu Polyaminen dekoriert und wie man achteckige Schutzgruppen verwendet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie hybride Peptid-Amphiphile mit ungeschützten chemischen Bausteinen erzeugen können, die mehrere reaktive Seiten enthalten. Das Verfahren wird von Mehdi, Nathalia und Krishnaiah, Laborstudenten des Conda Sheridan Labors, vorgeführt. Wiegen Sie zunächst 2-Chlorotritylchlorid-Harz vorsichtig ab und geben Sie das Harz in ein frittiertes Synthesegefäß mit mittlerer Porosität und einem Fassungsvermögen von 50 Millilitern.

Befestigen Sie als Nächstes das Synethesegefäß an einem mechanischen Schüttler mit variabler Geschwindigkeit und drehen Sie das Gefäß in einen 45-Grad-Winkel, um die Bewegung zu maximieren. Geben Sie dann 15 Milliliter DCM zum Harz. Nachdem Sie die Harzkügelchen 15 Minuten lang quellen gelassen haben, fügen Sie dem Harz acht Äquivalente des gewünschten Polyamins hinzu und lassen Sie es fünf Stunden lang reagieren.

Nach fünf Stunden wird ein Kaisertest durchgeführt, um eine erfolgreiche Reaktion des Polyamins mit dem Harz zu bestätigen. Schützen Sie anschließend die primäre Amingruppe, indem Sie vier DDE-Äquivalente in wasserfreies Methanol geben und das Reaktionsgemisch über Nacht schütteln. Führen Sie am nächsten Tag einen Kaisertest durch, um den erfolgreichen Schutz durch das Fehlen von blauer Farbe auf der Harzraupe zu bestätigen.

Lassen Sie dann das DCM ab und waschen Sie das Harz zweimal mit einer Mischung aus DCM und DMF von zwei zu eins. Fügen Sie nun dem Harz 20 Äquivalente Boc-Anhydrid in DCM hinzu und lassen Sie die Reaktion drei Stunden lang ablaufen. Nachdem Sie einen Chloranil-Test durchgeführt haben, um den Schutz des sekundären Amins zu bestätigen, lassen Sie das Lösungsmittelgemisch ab und waschen Sie das Harz zweimal mit einer Zwei-zu-Eins-Mischung aus DCM und DMF.

Fügen Sie anschließend 10 Milliliter einer 2%igen Lösung von Hydrazin in DMF zum Harz hinzu. Nach einstündigem Schütteln ist ein Kaisertest durchzuführen, um eine erfolgreiche Entschützung des primären Amins zu bestätigen. Mischen Sie als Nächstes vier Äquivalente der Fmoc-geschützten Aminosäure, 3,95 Äquivalente von HBTU und 15 Äquivalente von DIPEA.

Fügen Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus DCM und DMF hinzu und beschallen Sie den Cocktail bis zur vollständigen Auflösung. Stellen Sie sicher, dass die Aminosäure, das Haftvermittler und DIPEA wirklich gemischt und aktiviert sind, bevor Sie die Mischung zum Harz hinzufügen. Nachdem Sie drei bis fünf Minuten gewartet haben, um die Aktivierung der Carbonsäure sicherzustellen, geben Sie das Reaktionsgemisch in das Gefäß mit dem Harz und lassen Sie die Reaktion zwei bis vier Stunden lang bei Umgebungstemperatur ablaufen.

Führen Sie bei jedem Schritt einen Kaiser- oder Chloraniltest durch, um eine erfolgreiche Kopplung zu bestätigen. Nach Durchführung eines Kaiser-Tests zur Bestätigung der erfolgreichen Kopplung ist die Fmoc-Gruppe von der Aminosäure zu schützen, indem 10 Milliliter einer 20%igen Lösung von 4-Methylpyridin in DMF hinzugefügt werden. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, führen Sie einen Kaisertest durch, um eine erfolgreiche Entschützung der Aminosäure zu bestätigen.

Waschen Sie das Harz dann zweimal mit 10 Millilitern DMF, wobei jede Wäsche 5 Minuten dauert, und schließlich 10 Minuten lang mit 10 Millilitern DCM. Nachdem Sie alle erforderlichen Aminosäuren gekoppelt haben, konjugieren Sie den hydrophoben Schwanz an die letzte Aminosäure, indem Sie 10 Äquivalente der gewünschten Carbonsäurefunktionalität zu 9,5 Äquivalenten HBTU und 12 Äquivalenten DIPEA hinzufügen. Beschallen Sie den Cocktail bis zur vollständigen Auflösung, dann geben Sie den Cocktail in das Gefäß.

Führe die Reaktion mindestens fünf Stunden lang durch, obwohl es ratsam ist, sie über Nacht durchzuführen, um die höchste Ausbeute zu erzielen. Waschen Sie das Harz zwei Minuten lang mit acht Millilitern DMF und zweimal fünf Minuten lang mit acht Millilitern DCM. Lassen Sie vor jeder Zugabe das Lösungsmittel aus dem Gefäß ab.

Sobald die letzte Wäsche durchgeführt wurde, trocknen Sie das Harz 15 Minuten lang unter Vakuum. Um 15 Milliliter Spaltcocktail zuzubereiten, fügen Sie 14 Milliliter TFA zu 0,5 Millilitern Wasser und 0,5 Milliliter Triisopropylsilan hinzu. Geben Sie diesen Dekolleté-Cocktail zum Harz und schütteln Sie ihn zwei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Nachdem die Spaltreaktion abgeschlossen ist, wird die Lösung in einem 50-Milliliter-Rundkolben aufgefangen. Dann wird das TFA im Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei reduziertem Druck auf ein bis zwei Milliliter konzentriert, während das Gemisch auf 40 Grad Celsius erhitzt wird. Nach dem Verdampfen wird die erhaltene TFA-Lösung tropfenweise in einen Rundkolben gegeben, der 15 Milliliter wasserfreien kalten Äther enthält, um das PPA auszufällen. Anschließend werden 5 Milliliter wasserfreier kalter Äther in den Originalkolben gegeben, der die konzentrierte TFA-Lösung enthält.

Beschallung, um zusätzliche Feststoffe zurückzugewinnen. Kombinieren Sie dann mit der Ätherlösung aus dem vorherigen Schritt. Decken Sie den Kolben ab und stellen Sie ihn über Nacht in den Kühlschrank, um den Niederschlag zu maximieren.

Am nächsten Tag wird das gefällte Material durch Vakuumfiltration mit einem feinen oder mittleren Tellerfiltertrichter in der Mitte aufgefangen. Zum Schluss waschen Sie den Niederschlag zweimal mit fünf bis zehn Millilitern kaltem Äther, um eventuelle organische Reststoffe zu entfernen. Die HPLC-Spur und das MALDI-Spektrum bestätigen das Vorhandensein des PPA-Produkts, das für die Materialcharakterisierung oder biologische Bewertung eine Reinheit von mehr als 95 % aufweisen sollte.

In der UV-basierten HPLC-Spur wird ein einzelner scharfer Peak beobachtet und das MALDI-Spektrum entspricht dem des berechneten Molekulargewichts des PPA innerhalb von plus oder minus einem Dalton. Die Selbstorganisation der PPAs kann durch Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie, Kleinwinkel-Röntgenstreuung, Rasterelektronenmikroskopie und dynamische Lichtstreuung sichtbar gemacht und analysiert werden. Eine erfolgreiche Selbstorganisation führt zu gut definierten Nanostrukturen, sowohl in der Transmissionselektronenmikroskopie als auch in der Rasterkraftmikroskopie.

Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in drei Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Denken Sie bei diesem Verfahren daran, die Produkte zu reinigen und ihre Reinheit zu bewerten, bevor Sie nachfolgende Studien durchführen. Nach diesem Verfahren können andere Moleküle, wie Peptid-Amphiphile, Peptide und Peptid-Polyamin-Hybride, hergestellt werden.

Nach ihrer Entwicklung hilft diese Technik bei der Forschung auf dem Gebiet der selbstorganisierenden Peptid-Amphiphile, um den Einfluss von Polyamin-Nanostrukturen in Bereichen wie der Wirkstoffabgabe, der Bildgebung oder der Katalyse zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Synthese von Polyamin-basierten Peptid-Amphiphilen und verwandten Peptid-Amphiphilen durchgeführt wird. Trifluoressigsäure und 4-Methylpyridin können gefährlich sein, und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Arbeiten im Abzug getroffen werden.