phiC31-Integrase-vermittelte ortsgerichtete Transgenintegration: Eine Mikroinjektionstechnik zur ortsspezifischen Transgenintegration in einen Anopheles-Vektor

phiC31-Integrase ist ein aus Phagen gewonnenes Rekombinase-Enzym, das die ortsspezifische Rekombination eines Transgens, eines fremden Gens, in ein Wirtsgenom katalysiert. Für die transgene Integration in einen Anopheles-Wirt beginnen Sie mit einem Anopheles-Embryo in einem geeigneten Puffer.

Das Anopheles-Genom ist mit einer Anheftungsstelle für die Genintegration und einem cyan-fluoreszierenden Marker für die visuelle Selektion vorgefertigt. Als nächstes fügen Sie ein kleines Volumen eines Donorplasmids mit der gewünschten Transgenfracht, einer Bindungsstelle, einem rot fluoreszierenden Marker und Plasmidrückgratkomponenten in ein Fläschchen hinzu. Fügen Sie dann ein optimales Volumen eines Helferplasmids hinzu, das eine genkodierende Integrase trägt. Laden Sie nun das Plasmidgemisch in eine Mikrospritze.

Injizieren Sie die Plasmide vorsichtig in den hinteren Pol des Embryos, den Ursprungsort der Keimzellen, was zu einer leichten Bewegung des Zytoplasmas führt. Im Inneren des Embryos beginnt das Helferplasmid mit der Synthese von Integrase-Enzymen.

Das Integrase-Enzym vermittelt die ortsspezifische Rekombination zwischen dem Spenderplasmid und dem Wirtsgenom. Somit integrieren sich das Transgen und der rot fluoreszierende Marker aus dem Donorplasmid in die rekombinanten Anheftungsstellen im Anopheles-Genom. Danach wird der injizierte Embryo unter physiologischen Bedingungen für das Schlüpfen mit intermittierendem Schwenken inkubiert.

Innerhalb weniger Tage schlüpft aus dem Embryo eine Larve. Unter einem Fluoreszenzmikroskop exprimiert die Anopheles-Larve mit erfolgreich integrierten Genen sowohl Cyan-Fluoreszenz, die das Wirtsgenom markiert, als auch rote Fluoreszenz, die das Transgen aus dem Donorplasmid markiert.

Reinigen Sie Spender- und Helferplasmide mit einem endotoxinfreien Aufreinigungskit. Kombinieren Sie das attB-markierte Donorplasmid, das das interessierende Transgen trägt, und das Helferplasmid, das die Integrase trägt, um eine Mischung mit einer Endkonzentration von 350 Nanogramm pro Mikroliter des Donorplasmids und 150 Nanogramm pro Mikroliter des Helferplasmids zu erhalten.

Fältitieren Sie die DNA, indem Sie 0,1 Volumen 3 molare Natriumacetate in 2,5 Volumen eiskaltes 100%iges Ethanol hinzufügen. Dann, Vortex. Ein weißer Niederschlag sollte sofort sichtbar sein. Waschen Sie das Pellet und resuspendieren Sie es in einem Injektionspuffer, um eine Gesamtendkonzentration von 500 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Bereiten Sie dann Aliquots von jeweils 10 bis 15 Mikrolitern vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.

Blut füttern 4 bis 7 Tage alte Mücken aus der gewünschten Andocklinie und ihre Wildtyp-Artgenossen 72 Stunden vor der Mikroinjektion. Führen Sie Mikroinjektionen von Anopheles gambiae-Embryonen in 25 millimolares Natriumchlorid durch, indem Sie den hinteren Pol des Embryos in einem 45-Grad-Winkel anvisieren.

Führen Sie Mikroinjektionen von Anopheles stephensi-Embryonen in Halogenkohlenwasserstofföl durch, indem Sie den hinteren Pol in einem Winkel von 30 Grad anvisieren. Unmittelbar nach der Injektion werden die Eier in eine mit sterilem destilliertem Wasser gefüllte Petrischale gegeben und wieder in einen insektenartigen Zustand versetzt. Nach dem Schlüpfen werden die G 0-Larven täglich in eine Schale mit gesalzenem destilliertem Wasser umgefüllt und zu den Puppen aufgezogen.