JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:21 Min. • July 8th, 2025
phiC31-Integrase ist ein aus Phagen gewonnenes Rekombinase-Enzym, das die ortsspezifische Rekombination eines Transgens, eines fremden Gens, in ein Wirtsgenom katalysiert. Für die transgene Integration in einen Anopheles-Wirt beginnen Sie mit einem Anopheles-Embryo in einem geeigneten Puffer.
Das Anopheles-Genom ist mit einer Anheftungsstelle für die Genintegration und einem cyan-fluoreszierenden Marker für die visuelle Selektion vorgefertigt. Als nächstes fügen Sie ein kleines Volumen eines Donorplasmids mit der gewünschten Transgenfracht, einer Bindungsstelle, einem rot fluoreszierenden Marker und Plasmidrückgratkomponenten in ein Fläschchen hinzu. Fügen Sie dann ein optimales Volumen eines Helferplasmids hinzu, das eine genkodierende Integrase trägt. Laden Sie nun das Plasmidgemisch in eine Mikrospritze.
Injizieren Sie die Plasmide vorsichtig in den hinteren Pol des Embryos, den Ursprungsort der Keimzellen, was zu einer leichten Bewegung des Zytoplasmas führt. Im Inneren des Embryos beginnt das Helferplasmid mit der Synthese von Integrase-Enzymen.
Das Integrase-Enzym vermittelt die ortsspezifische Rekombination zwischen dem Spenderplasmid und dem Wirtsgenom. Somit integrieren si
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