Vorgehensweise für Lung Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lungengewebe in Kultur zu erzeugen, das morphologisch und physiologisch mit nativem Lungengewebe vergleichbar ist. Dies wird erreicht, indem zuerst das Herz und die Lunge einer erwachsenen Ratte entnommen werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Lungenarterie und die Luftröhre zu kanülieren und die kanülierte Lunge zur Dezellularisierung mit einem Bioreaktor zu verbinden.

Nach der Dezellularisierung und Spülung wird die Lunge in einen sterilen Kulturbioreaktor überführt und für die Sitzgelegenheit vorbereitet. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das gewünschte Kompartiment der Lunge mit einer vorbereiteten Zellpopulation zu bepflanzen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die dezellularisierte extrazelluläre Matrix durch Immunfluoreszenzmikroskopie effizient mit Zellen besiedelt wird, die regional spezifische Lungenmarker exprimieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Kultivierung von Lungenzellen in vitro besteht darin, dass die Zellen über einen längeren Zeitraum differenzierte Phänotypen beibehalten, so dass sie mehrere Wochen lang in einem dreidimensionalen, biologisch gewonnenen Substrat untersucht werden können. Bei der Dezellularisierung wird die Lunge über die Gefäßkanüle mit dem Bioreaktordeckel verbunden, und die Kappe wird mit dem Dezellularisierungsapparat verbunden. Die Glasflasche über der Lunge wird durch einen Ringständer und eine daran befestigte Klemme an Ort und Stelle gehalten.

An diesem Punkt kann zelluläres Material entfernt werden, um ein extrazelluläres Matrixgerüst herzustellen, das mit zellulärem Material wieder bestückt werden kann. In diesem Diagramm ist die Montage des Bioreaktors für die Aussaat und Kultivierung von künstlich hergestelltem Lungengewebe dargestellt. Der Lock-Konnektor der Trachealkanüle ist mit einer Atemschlaufe zwischen dem Luftröhrenreservoir und der Hauptkammer verbunden.

Der Atemschlaufe besteht aus zwei Einwegventilen. Positionen, bei denen das Medium einen anderen Weg in und aus der Lunge nimmt. Ein kleines Reservoir wird vorübergehend in die Perfusionslinie eingebaut, um die Aussaat von Endothelzellen zu ermöglichen.

Eine pulsierende Pumpe wird verwendet, um Zellen aus dem Reservoir in das Gefäßkompartiment der Lunge zu befördern. Die Gefäßperfusion erfolgt über eine Rollenpumpe. Das Medium wird über die angebrachte Kanüle in die Lungenarterie perfundiert, fließt durch das Lungengefäßsystem und aus der Lungenvene direkt in den Hauptbioreaktor, wo das Medium für die Perfusion aufgezogen wird.

Das Lungenepithel sitzt durch Injektion in der Atemschlaufe. Die Hauptkammer mit der Lunge und das Luftröhrenreservoir werden für die Langzeit-Lungenkultur verwendet. Wenn die Lunge extrahiert und die Arterie und die Luftröhre korrekt kanüliert wurden, sollte die frisch entnommene Lunge Luft halten, ohne auszulaufen.

Dies kann überprüft werden, indem sie mit Luft aufgeblasen werden, während sie in Flüssigkeit getaucht sind. Es sollten keine Blasen vorhanden sein, die auf Luftlecks hinweisen. Zu Beginn des Protokolls werden die Lungen mit PBS, das Natriumnitropress-Seite enthält, aufgeblasen, bis die Lungen voll, aber nicht überbläht sind, und sofort die Trachealkanüle verschließen, damit die Lunge aufgeblasen bleibt.

Als nächstes durchbluten Sie die Lunge mindestens 15 Minuten lang mit PBS und SNP bei 15 Millimeter Quecksilbersäule. Entfernen Sie danach den Stopfen von der Trachealkanüle, damit sich die Lungen entleeren können. Setzen Sie die Perfusion mit PBS und SNP bei Bedarf 15 bis 30 Minuten lang fort.

Füllen Sie PBS und SNP nach, um sicherzustellen, dass der Fülldruck bei 10 bis 15 Millimeter Quecksilbersäule gehalten wird. Um das Verfahren für die lange Dezellularisierung zu beginnen, wird die Bioreaktorkappe mit dem Dezellularisierungsapparat verbunden. Dann wird die Lunge mit der Kappe verbunden.

Mit den Köderverschlussverbindungen, die mit der YS-förmigen Kanüle verbunden sind, sollte die Lungenarterienkanüle mit der Perfusionsleitung verbunden werden und die Trachealkanüle frei schwimmen. Um eine vollständige Dezellularisierung des Gewebes zu gewährleisten, ist es entscheidend, Luft aus dem System fernzuhalten. Die Einwegventile in der arteriellen und trachealen Kanüle helfen, Luftblasen im Schlauch zu entfernen, indem sie einen Umkehrfluss im Schlauch ermöglichen.

Lassen Sie daher die Luftblasen mit der Spritze entfernen und stellen Sie sicher, dass alle Leitungen frei von Luft sind. Beginnen Sie die Perfusion mit einer Dezellularisierungslösung. Perfundiert mit Dezellularisierungslösung.

Bis 500 Milliliter Lösung durch die Lunge durchdrungen sind, liegt der optimale Druck bei weniger als 15 Millimeter Quecksilbersäule. Dies dauert in der Regel 2,5 Stunden. Die Durchflussraten sind in der Regel anfangs sehr langsam und steigen in der zweiten Stunde schnell auf etwa einen Milliliter pro Minute oder mehr an.

Während der Perfusion wird regelmäßig die verwendete Dezellularisierungsflüssigkeit aus dem Bioreaktor entfernt, wobei sichergestellt wird, dass genügend Flüssigkeit übrig bleibt, um die Lungen- und Trachealkanüle zu stützen. Wenn die Perfusion mit der Dezellularisierungsflüssigkeit abgeschlossen ist, werden die Lunge und der Bioreaktor in eine Gewebekulturhaube überführt. Um mit der Organspülung zu beginnen, entfernen Sie das 500-Milliliter-Gefäß, das die Dezellularisierungsflüssigkeit enthält, und ersetzen Sie es durch ein steriles Gefäß, das bis zu einem Liter steriles PBS enthält.

Verwenden Sie eine Vakuumabsaugung oder eine Spritze, um sicherzustellen, dass die Leitungen frei von Luft sind. Perfundierte PBS durch das Gefäßsystem bei 10 bis 15 Millimeter Quecksilber auf die gleiche Weise. Was die Dezellularisierung betrifft, so wird mit sterilen Techniken periodisch PBS-Abfall aus dem Bioreaktor entfernt und das PBS-Gefäß ausgetauscht oder neu gefüllt. Bei frischem, sterilem PBS spülen Sie so lange weiter, bis mindestens 2,5 Liter steriles PBS die Lunge durchblutet haben.

Dies dauert in der Regel zwei Tage ab Beginn des Dezellularisierungsprozesses, wenn die Spülung abgeschlossen ist. Überführen Sie die Lunge in ein neues steriles Bioreaktorsystem, das frisches PBS plus 10 % FBS plus 10 % Pen Streptokokken enthält, um sicherzustellen, dass sowohl der gesamte Perfusionskreislauf als auch die gesamten Atemwege mit Flüssigkeit gefüllt sind. Von hier an wird die Lunge mit einer pulsierenden Pumpe mit fünf Millimetern pro Minute durchblutet.

Sterilisieren Sie das Gerüst der extrazellulären Matrix der Lunge durch Perfusion über Nacht mit PBS, das 10 % FBS und 10 % Penicillin-Streptomycin enthält. Nachdem Sie diesen Schritt abgeschlossen haben, stellen Sie die Lunge für eine Stunde oder bis zum Temperaturausgleich in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Zur Vorbereitung auf die Behandlung mit Ben Nase ist der nächste Schritt die Behandlung der Lunge mit Ben Nase.

Um DNA-Reste für jede Lunge zu entfernen, füllen Sie zuerst eine 10-Milliliter-Spritze nur mit Prewarm-Ben-Nasen-Puffer und eine 10-Milliliter-Spritze mit 90 Einheiten pro Milliliter. Ben Nase in Ben Nase Puffer verdünnt. Stoppen Sie die Durchblutung der Lunge.

Blasen Sie dann die Atemwege mit Ben-Nasen-Puffer auf, ohne dass Luft in die Lunge injiziert wird. Lassen Sie die Lunge eine Minute lang entleeren. Blasen Sie dann die Lunge mit der Ben-Nase-Lösung auf.

Achten Sie auch hier darauf, nach dem Aufblasen mit Ben Nase keine Luft in die Lunge einzuführen. Lassen Sie die Lunge eine Stunde lang ohne Durchblutung oder Beatmung bei 37 Grad Celsius ruhen. Am Ende der einstündigen Phase setzen Sie die Perfusion mit dem PBS plus 10%FBS 10%Penicillin-Streptomycin, das sich bereits im Bioreaktor befindet, fort und setzen Sie die Perfusion über Nacht am folgenden Tag fort.

Nach dem Spülen und Sterilisieren kann das lange extrazelluläre Matrixgerüst für die Wiederbesiedlung der Zellen vorbereitet werden. Ersetzen Sie die P-B-S-F-B-S Benzoa-Lösung durch 250 Milliliter Kultur. Vor dem Einbringen der Zellen mindestens eine Stunde lang Medium perfuieren und direkt vor dem Aussäen der Zellen durch frisches Kulturmedium ersetzen.

Viele Zellquellen können für den Organabbau genutzt werden. Hier wird das Sitzen mit einer epithelialen Zellpopulation demonstriert. Bereiten Sie zunächst eine Spritze vor, die 15 Milliliter einer Zellsuspension der gewünschten Epithelzellpopulation enthält.

Füllen Sie anschließend das Atemwegsreservoir mit 80 Millilitern Nährmedium und stellen Sie sicher, dass alle Beatmungsleitungen frei von Luft sind. Stellen Sie dann den Bioreaktor in einen 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator und schließen Sie die Spritzenpumpe zur Beatmung an. Säen Sie die Zellen mit einem einzigen schnellen Bolus in die Lunge ein, indem Sie die 15-Milliliter-Zellsuspension in die Trachealkanüle injizieren.

Stellen Sie sicher, dass die Luftfilter am Hauptbioreaktor verschlossen sind. Beginnen Sie dann sofort mit einem einzigen langsamen Atemzug, indem Sie mit der Spritzenpumpe 60 Milliliter Luft mit drei Millilitern pro Minute aus dem Hauptbioreaktor entnehmen. Dies dauert ca. 20 Minuten.

A Lassen Sie die Lunge danach etwa 18 Stunden lang statisch sitzen. Beginnen Sie mit einer langsamen Gefäßperfusion bei etwa 0,5 Millilitern pro Minute. Während der Organkultur wird die Perfusion in der Regel mit ein bis drei Millilitern pro Minute durchgeführt.

Bei Verwendung einer Rollenpumpe während der Epithelkultur erfolgt die Beatmung in der Regel mit einer kontinuierlichen Rate von einem Atemzug pro Minute und einem Atemzugvolumen von fünf bis 10 Millilitern. Mit Hilfe einer Spritzenpumpe wird zyklisch Luft abgesaugt und in den Bioreaktor injiziert, um die Atmung durch Wechsel zwischen Unterdruck und Atmosphärendruck in der Hauptkammer zu beeinflussen. Aufgrund der Notwendigkeit, den Bioreaktor während der Belüftung luftdicht zu halten, sollte die Belüftung täglich pausiert und die Luft in der Hauptkammer ausgetauscht werden.

Außerdem sollte das Medium etwa alle drei bis vier Tage gewechselt werden. Während der Kultur sollte jedes Mal etwa die Hälfte des Gesamtvolumens durch Kultivierung des Lungenepithels und des Gefäßendothels ausgetauscht werden. Innerhalb des Bioreaktor-Gerüsts sind wir in der Lage, Lungengewebe zu erzeugen, das in der Lage ist, für kurze Zeitintervalle am Gasaustausch teilzunehmen.

Eine Standard-Hämat-, Toin- und Eoin-Färbung einer nativen Rattenlunge wird hier zum Vergleich mit einer H- und E-Färbung einer dezellularisierten Rattenlunge gezeigt. Die endgültige dezellularisierte extrazelluläre Matrix sollte vollständig frei von zellulärem Material sein und die groben, mikroskopischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der nativen Lunge beibehalten. Die H- und E-Färbung ermöglicht die Visualisierung von DNA-Resten, die aufgrund unzureichender Dezellularisierung oder Spülung am Gerüst haften bleiben, um optimale Bedingungen für die Zellaussaat und die anschließende Kultivierung der Lunge

Und der Bioreaktor sollte gut verteilte Zellen in allen fünf Lungenlappen liefern und eine Abdeckung von etwa 70 % des extrazellulären Matrixgerüsts bieten. Diese Bilder vergleichen die native Lunge mit der wiederbevölkerten Lunge, wenn sie durch Immunfluoreszenz gefärbt wurde. Bei wichtigen Lungenmarkern ist die kultivierte Zellpopulation positiv für das sekretorische Protein der Clara-Zellen, das pro-sekretorische Protein C und das Aquaporin fünf.

Die interessierenden Marker sind rot dargestellt und die DAPI-gefärbten Zellkerne sind in allen Panels blau dargestellt. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren von der Dezellularisierung bis zum Rückzug in vier bis fünf Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.