Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, eine Transposon-Insertionsbibliothek mit hoher Dichte in Escherichia coli oder Shigella flexneri durch bakterielle Konjugation zu schaffen. Diese Technik ermöglicht die Erzeugung von Hunderttausenden einzigartiger bakterieller Mutanten durch die zufällige genomische Insertion eines Tn10-Transposons. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Übertragung des Plasmas am Sitz des Transposons durch bakterielle Konjugation anstelle anderer weniger effizienter Methoden, wie z. B. der Elektroporation, erfolgt.

Darüber hinaus fügt sich das Tn10-Transposon selbst mit weniger Verzerrung in das Genom ein als andere Transposons. Geben Sie bei steriler Technik einen Milliliter Übernachtkultur des Spenderstamms in ein steriles Eppendorf-Röhrchen. Das Röhrchen sollte zum Beispiel mit einem D für Spender gekennzeichnet sein.

Machen Sie dasselbe für den Empfängerstamm, indem Sie einen Milliliter der Übernachtkultur des Empfängerstamms in ein steriles Eppendorf-Röhrchen entfernen. Auch hier zum Beispiel, beschriftet mit R, für Empfänger. Beide Röhrchen werden eine Minute lang bei 14.000 μg bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Dies kann an einer Tischzentrifuge erfolgen. Während die Zentrifuge läuft, bereiten Sie die Filter für die Konjugation vor. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um einen Nitrozellulosefilter auf eine beschriftete LB-Agarplatte zu setzen, die keine Antibiotika enthält.

Alternativ kann anstelle des Nitrozellulosefilters steriles Löschpapier verwendet werden. Platzieren Sie jeden Filter auf einer separaten LB-Agarplatte, um die Kontamination zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass jeder Filter auf eine LB-Agarplatte gestellt wird, die entsprechend beschriftet ist.

Stelle drei Platten her, die jeweils einen Filter enthalten. Eine für den Spenderstamm, eine für den Empfängerstamm und eine für die Bibliothek. Sobald die Zentrifuge fertig ist, entfernen Sie die Übernachtkulturen.

Entfernen Sie alle antibiotikahaltigen Nährmedien aus dem Eppendorf-Röhrchen und entsorgen Sie sie. Achten Sie darauf, die Palette der Bakterienzellen nicht zu stören oder zu stören, versuchen Sie jedoch, alle Wachstumsmedien zu entfernen. Achten Sie darauf, aseptisch zu arbeiten und die Spitzen zwischen den einzelnen Proben zu wechseln.

Sie in jedes Eppendorf-Röhrchen 110 Mikroliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika und pipettieren Sie es auf und ab, um die Kultur wieder zu suspendieren. Achten Sie darauf, aseptisch zu arbeiten. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, um sicherzustellen, dass keine Zellklumpen zurückbleiben.

Dieser Schritt wird durchgeführt, um die Bakterienkultur zu konzentrieren und alle Antibiotika zu entfernen, die von der Übernachtkultur übrig geblieben sind. Geben Sie mit einer Pipette 50 Mikroliter der konzentrierten Spenderkultur auf den Filter mit der Aufschrift Donor. Geben Sie die 50 Mikroliter langsam tropfenweise in den Filter.

Machen Sie dasselbe für den Empfängerstamm, indem Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Kultur, die konzentrierte resuspendierte Kultur, tropfenweise auf den Empfängerfilter auffüllen. Damit die Konjugation stattfinden kann, werden sowohl der Empfängerstamm als auch der Donorstamm auf dasselbe Filterpapier gegeben, so dass sie in engem physischen Kontakt stehen. Um dies zu tun, fügen Sie 50 Mikroliter sowohl des Spenderstamms als auch des Empfängerstamms in denselben Filter auf der mit der Platte beschrifteten Bibliothek hinzu.

Stellen Sie diese Agarplatten mit den Filtern sechs Stunden lang bei 37 Grad auf. Der Prozess der Konjugation findet über sechs Stunden bei 37 Grad Celsius statt. Während der Konjugation wandert das pJA1-Plasmin in den Empfängerstamm.

Nach der Konjugation werden die Bakterien durch Vortexen vom Filter getrennt und mit einem millimolaren IPTG induziert. IPTG induziert die Transposase und das Transposon, das das Gen für Kanamycin-Resistenz enthält, wird zufällig in das Genom des Empfängerstammes eingefügt. Bakterien werden auf LB-Agarplatten plattiert, die Kanamycin und ein anderes Antibiotikum enthalten, um für den Empfängerstamm auszuwählen, der das Transposon enthält.

Der Empfängerstamm ist Lambda pir negativ, so dass das pJA1-Plasmin verloren geht. Nach sechs Stunden Wachstum bei 37 Grad Celsius ist die Konjugation abgeschlossen. Entfernen Sie die Platten mit den Filtern aus dem Inkubator.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Filter mit der negativen Donorkontrolle von der LB-Agarplatte zu entfernen. Klopfen Sie auf das Rohr, um das Filterpapier an den Boden des konischen Fläschchens zu bringen, und stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig in das LB-Medium eingetaucht ist. Dieses Röhrchen enthält zwei Milliliter LB-Medium mit IPTG und einer Endkonzentration von einem Millimolar.

Wirbeln Sie das Rohr eine Minute lang vor, um die Bakterien vom Nitrozellulosefilter zu lösen. Das LB-Medium sollte mit Bakterienzellen trüb werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang auch für das Empfängersteuerelement und die Bibliothek.

Nachdem die Filter, die die Bakterienzellen enthalten, gründlich verwirbelt wurden, um die Bakterien vom Filter zu trennen, werden die Bakterienzellen auf ausgewählten Medien plattiert. Bei diesem Schritt werden Bakterien in LB-Agarplatten plattiert, die Kanamycin und ein anderes Antibiotikum wie Nalidixinsäure enthalten. Kanamycin wird verwendet, um Empfängerzellen zu selektieren, bei denen das Transposon mit dem Kanamycin-Resistenzmarker erfolgreich in das Genom integriert wurde.

Es werden Empfängerzellen selektiert, bei denen der Marker nicht in das Genom integriert wurde. Ein anderes Antibiotikum wie Nalidixinsäure wird verwendet, um gegen den Spenderstamm zu selektieren. Der hier verwendete Donorstamm ist empfindlich gegenüber Nalidixinsäure, während der Empfängerstamm resistent gegen Nalidixinsäure ist.

Mit diesem zweiten Antibiotikum ist es möglich, den Spenderstamm zu entfernen. In diesem Schritt sollten mehrere Verdünnungen plattiert werden, um eine Verdünnung der Bibliothek zu bestimmen, die viele Kolonien mit ausreichendem Abstand ergibt. Nach dem Zählen und Aufzeichnen der Anzahl der Kolonien auf allen Platten, die die Transposon-Bibliothek enthalten, möchten einige Benutzer die Bibliothek möglicherweise in einem Röhrchen zusammenfassen oder kombinieren.

Dies kann mit einem sterilen Spreizer erfolgen. Geben Sie einen Milliliter LB-Medium in die LB-Agarplatte, die die Transposonbibliothek enthält. Nachdem das Medium auf die Platte gegeben wurde, verwenden Sie den sterilen Spreader, um die Bakterien von der Platte abzukratzen und zu entfernen.

Oft ist es nicht möglich, alle Bakterien von der Platte zu bekommen. Entfernen Sie die Bakteriensuspension und geben Sie sie in eine konische Brühe von 50 mil oder 15 mil. Wiederholen Sie dies für alle Platten.

Sobald alle Platten abgekratzt wurden, wirbeln Sie die gepoolte Bakteriensuspension eine volle Minute lang ein, um alle Zellklumpen aufzubrechen. Diese bildet nun die gepoolte Bibliothek. Nach 18 Stunden Wachstum bei 37 Grad sollte es kein Wachstum auf den Kontrollplatten des Spenders oder Empfängers geben.

Die Platten, die die Mutantenbibliothek enthalten, enthalten idealerweise viele Kolonien mit unterschiedlichen Größen. Unterschiedliche Koloniegrößen deuteten auf Klone unterschiedlicher Fitness hin und sind ein gutes Zeichen dafür, dass das Protokoll funktioniert hat. Die Schaffung einer dichten Transposon-Mutagenese-Bibliothek in Bakterien ist potenziell vorteilhaft für viele nachgelagerte Anwendungen, die von der Entdeckung von Virulenzgenen und bakteriellen Krankheitserregern über die Untersuchung essentieller Gene bis hin zur Identifizierung genetischer Interaktionsnetzwerke reichen.

Alle diese Downstream-Anwendungen beruhen auf dem Aufbau einer dichten Transposon-Insertionsbibliothek. Das hier vorgestellte Verfahren bietet ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung einer sehr dichten Transposon-Bibliothek in enterobakteriellen Stämmen wie E coli oder Shigella flexneri.