Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, mithilfe bakterieller Konjugation eine Transposon-Einfüge-Bibliothek mit hoher Dichte in Escherichia coli oder Shigella flexneri zu erzeugen. Diese Technik ermöglicht die Erzeugung von Hunderttausenden einzigartiger bakterieller Mutanten durch zufällige genomische Insertion eines Tn10-Transposons. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Übertragung des das Transposon enthaltenden Plasmids über bakterielle Konjugation erfolgt, anstatt über weniger effiziente Methoden wie die Elektroporation.

Außerdem integriert sich das Tn10-Transposon selbst mit geringerer Bias in das Genom als andere Transposons. Unter sterilen Bedingungen ein Milliliter Übernachtkultur des Donorstamms in ein steriles Eppendorf-Röhrchen geben. Das Röhrchen sollte beispielsweise mit einem D für Donor gekennzeichnet sein.

Genau das Gleiche für den Empfängerstamm tun, indem man ein Milliliter der Übernachtkultur des Empfängerstamms in ein steriles Eppendorf-Röhrchen überführt. Zum Beispiel wieder mit „E“ für Empfänger beschriften. Beide Röhrchen eine Minute lang bei 14.000 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Dies kann an einer Tischzentrifuge durchgeführt werden. Während die Zentrifuge läuft, bereiten Sie die Filter für die Konjugation vor. Verwenden Sie sterile Pinzette, um einen Nitrocellulose-Filter auf eine beschriftete LB-Agarplatte ohne Antibiotika zu legen.

Alternativ kann anstelle eines Nitrocellulose-Filters steriles Abtupfpapier verwendet werden. Legen Sie jeden Filter auf eine separate LB-Agarplatte, um Kontaminationen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass jeder Filter auf einer entsprechend beschrifteten LB-Agarplatte platziert wird.

Stellen Sie drei Platten her, von denen jede einen Filter enthält: eine für den Donorstamm, eine für den Rezipientenstamm und eine für die Bibliothek. Entfernen Sie die Übernachtkulturen, sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist.

Entfernen Sie das gesamte Wachstumsmedium mit Antibiotika aus dem Eppendorf-Röhrchen und entsorgen Sie es. Achten Sie darauf, das Bakterienzell-Pellet nicht aufzuwirbeln, aber versuchen Sie, so viel wie möglich vom Wachstumsmedium zu entfernen. Arbeiten Sie sicher steril und wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen jeder Probe.

Zu jedem Eppendorf-Röhrchen 110 Mikroliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Kultur zu resuspendieren. Aseptisch arbeiten. Mehrmals auf- und abpipettieren, um sicherzustellen, dass keine Zellklumpen verbleiben.

Dieser Schritt dient dazu, die Bakterienkultur zu konzentrieren und verbleibende Antibiotika aus der Übernachtkultur zu entfernen. Geben Sie mithilfe einer Pipette 50 Mikroliter der konzentrierten Donatorkultur auf den mit „Donor“ beschrifteten Filter. Fügen Sie die 50 Mikroliter langsam tropfenweise dem Filter hinzu.

Verfahren Sie genauso mit dem Empfängerstamm und geben Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Kultur, der konzentrierten resuspendierten Kultur, tropfenweise auf den Filter mit dem Empfängerstamm. Damit die Konjugation stattfinden kann, werden sowohl der Empfängerstamm als auch der Spenderstamm auf denselben Filter gegeben, sodass sie in engem physischen Kontakt stehen. Um dies zu erreichen, geben Sie jeweils 50 Mikroliter des Spenderstamms und des Empfängerstamms auf denselben Filter auf der mit „Bibliothek“ beschrifteten Platte.

Stellen Sie diese Agarplatten mit den Filtern sechs Stunden lang bei 37 Grad ein. Der Konjugationsvorgang erfolgt über einen Zeitraum von sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Während der Konjugation gelangt das Plasmid pJA1 in den Empfängerstamm.

Nach der Konjugation werden die Bakterien durch Vortexen von dem Filter gelöst und mit einem Millimolar IPTG induziert. IPTG induziert die Transposase, und das Transposon, das das Gen für Kanamycinresistenz enthält, wird zufällig in das Genom des Empfängerstamms eingefügt. Die Bakterien werden auf LB-Agarplatten mit Kanamycin und einem weiteren Antibiotikum ausgestrichen, um die Stämme auszuwählen, die das Transposon enthalten.

Der Empfängerstamm ist Lambda pir-negativ, sodass das Plasmid pJA1 verloren geht. Nach sechs Stunden Wachstum bei 37 Grad Celsius ist die Konjugation abgeschlossen. Entfernen Sie die Platten mit den Filtern aus dem Inkubator.

Verwenden Sie sterile Pinzette, um den Filter mit der negativen Donor-Kontrolle von der LB-Agarplatte zu entfernen. Klopfen Sie das Gefäß leicht, um den Filter in den Boden des kegelförmigen Gefäßes zu befördern, und stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig in dem LB-Medium eingetaucht ist. Dieses Gefäß enthält zwei Milliliter LB-Medium mit IPTG und einer Endkonzentration von einem Millimolar.

Vortexen Sie das Gefäß eine Minute lang, um die Bakterien von dem Nitrocellulosefilter zu lösen. Das LB-Medium sollte sich mit Bakterienzellen trüben. Wiederholen Sie dies ebenfalls für die Empfängerkontrolle und die Bibliothek.

Nachdem die Filter mit den bakteriellen Zellen gründlich verwirbelt wurden, um die Bakterien vom Filter zu lösen, werden die bakteriellen Zellen auf ausgewählten Medien ausgestrichen. In diesem Schritt werden die Bakterien auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin und einem weiteren Antibiotikum wie Nalidixinsäure ausgestrichen. Kanamycin dient dazu, Empfängerzellen auszuwählen, in deren Genom der Transposon mit dem Kanamycin-Resistenzmarker erfolgreich integriert wurde.

Empfängerzellen, in deren Genom der Marker nicht integriert wurde, werden aussortiert. Ein weiteres Antibiotikum wie Nalidixinsäure wird verwendet, um gegen den Donorstamm zu selektieren. Der hier verwendete Donorstamm ist empfindlich gegenüber Nalidixinsäure, während der Empfängerstamm resistent gegen Nalidixinsäure ist.

Mithilfe dieses zweiten Antibiotikums ist es möglich, den Donorstamm zu entfernen. In diesem Schritt sollten mehrere Verdünnungen ausplattiert werden, um eine Verdünnung der Bibliothek zu bestimmen, die viele ausreichend voneinander beabstandete Kolonien ergibt. Nach dem Zählen und Aufzeichnen der Anzahl der Kolonien auf allen Platten, die die Transposonbibliothek enthalten, können einige Anwender die Bibliothek in einem Gefäß sammeln oder kombinieren.

Dies kann mit einem sterilen Glasstrich durchgeführt werden. Geben Sie ein Milliliter LB-Medium auf die LB-Agarplatte, die die Transposon-Bibliothek enthält. Sobald das Medium der Platte zugegeben wurde, verwenden Sie den sterilen Glasstrich, um die Bakterien von der Platte abzukratzen und zu dissoziieren.

Es ist oft nicht möglich, alle Bakterien von der Platte zu entfernen. Entfernen Sie die bakterielle Suspension und geben Sie sie in ein kegelförmiges Röhrchen mit 50 ml oder 15 ml. Wiederholen Sie dies für alle Platten.

Nachdem alle Platten abgestrichen wurden, den gepoolten Bakteriensuspension einen vollen Minute lang vortexen, um eventuelle Zellklumpen aufzubrechen. Dies stellt nun die gepoolte Bibliothek dar. Nach Wachstum bei 37 Grad für 18 Stunden sollte kein Wachstum auf den Donator- oder Rezipienten-Kontrollplatten vorhanden sein.

Die Platten mit der Mutantenbibliothek enthalten idealerweise viele Kolonien mit unterschiedlichen Größen. Verschiedene Koloniegrößen weisen auf Klone mit unterschiedlicher Fitness hin und sind ein gutes Zeichen dafür, dass das Protokoll erfolgreich war. Die Erstellung einer dichten Transposon-Mutagenese-Bibliothek in Bakterien kann für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen vorteilhaft sein, die von der Entdeckung von Virulenzgenen und bakteriellen Pathogenen über die Untersuchung essentieller Gene bis hin zur Identifizierung genetischer Interaktionsnetzwerke reichen.

Alle diese nachgeschalteten Anwendungen basieren auf dem Aufbau einer dichten Transposon-Einfügungsbibliothek. Die hier vorgestellte Methode bietet ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur Erstellung einer sehr dichten Transposon-Bibliothek in Enterobakterienstämmen wie E coli oder Shigella flexneri.