Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verwendung eines Lateral-Flow-Geräts für den schnellen Nachweis des diagnostischen Aspergillus-Antigens in humanem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Serum oder die BAL-Probe auf die Freisetzungsöffnung des Lateral-Flow-Geräts aufgetragen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Lösung entlang der Membran wandern zu lassen.

Der nächste Schritt besteht darin, durch Untersuchung der internen Kontrolllinie festzustellen, ob der Test gültig ist. Der letzte Schritt besteht darin, das Testergebnis zu interpretieren, indem die Testlinie untersucht wird. Letztendlich wird das Lateral-Flow-Gerät verwendet, um das Vorhandensein von Aspergillus-Diagnoseantigen in Serum- oder BAL-Flüssigkeiten nachzuweisen.

Der Aspergillus LFD kann als Zusatztest zur Diagnose der invasiven pulmonalen Aspergillose eingesetzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Aspergillus, Galacto, Manan-Enzymimmunoassay, Panf, Fundal, Beta-Glucan-Assay und Aspergillus-PCR-Test besteht darin, dass es sich um einen schnellen diagnostischen Point-of-Care-Test handelt, der nur minimale Laboreinrichtungen und Schulungen erfordert. Obwohl die LFD für den Nachweis von Aspergillus-Spezies entwickelt wurde, kann die Lateral-Flow-Technologie auch für den Nachweis anderer infektiöser Krankheitserreger wie Cetosporium, Fusarium und Riser-Spezies eingesetzt werden.

Durch die Einbeziehung monoklonaler Antikörper, die für diese Organismen spezifisch sind, ist die visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung. Da die Interpretation der LFD-Ergebnisse eine Vertrautheit mit dem Assay-Format erfordert, um Serum aus unbehandelten Blutproben zu gewinnen, lassen Sie das Blut bei vier Grad Celsius gerinnen und Serum und bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeiten sollten vor der Verwendung als Aliquote bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, da die Lagerung als Aliquote das Potenzial für den Abbau des Zielantigens durch wiederholte freie Lagerung von Proben während der Wiederholungsprüfung zur Vorbereitung von Serum- und BAL-Proben für die Prüfung begrenzt, Tauen Sie die Proben bei Raumtemperatur auf und bewahren Sie sie dann auf Eis auf. Mischen Sie sie gründlich durch Vortexen und zentrifugieren Sie sie dann eine Minute lang bei 14.000 U/min. Für Routinetests an menschlichen Proben verdünnen Sie das Serum eins zu eins mit Gewebekulturmedium und trennen Sie das Zielantigen von den Serumimmunkomplexen. Verdünnen Sie das Serum eins bis zwei mit PBS mit 4 % EDTA, erhitzen Sie es drei Minuten lang in einem kochenden Wasserbad und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang mit 14.000 U/min.

Humane BAL-Flüssigkeiten erfordern keine Vorbehandlungen. Eine BAL-Probe wurde mit einem Wirbel aufgetaut und eine Zentrifuge ist eine saubere Probe, die direkt auf das Lateral-Flow-Gerät aufgetragen werden kann. Zu Testzwecken werden die Lateral-Flow-Geräte (LFD) bei Raumtemperatur oder 23 Grad Celsius gelagert, bei denen sie 12 Monate lang stabil sind.

Um mit dem Assay zu beginnen, nehmen Sie die Geräte aus ihren Beuteln und legen Sie sie auf eine ebene Fläche. Tragen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze innerhalb von Sekunden 100 Mikroliter vorbehandeltes Serum auf die Ablassöffnung des Geräts auf. Die Flüssigkeit sollte durch Kapillarwirkung entlang der Lachzellulosemembran im Beobachtungsfenster wandern.

Tragen Sie auf die gleiche Weise 100 Mikroliter einer sauberen BAL-Probe auf die Entnahmeöffnung des Geräts auf. Lassen Sie den Test 15 Minuten lang bei Raumtemperatur laufen, wobei die Ergebnisse des Tests aufgezeichnet werden sollten. Der Test sollte nicht länger als 15 Minuten vor der Aufzeichnung der Ergebnisse aufbewahrt werden.

Da dies die Interpretation des Ergebnisses verzerren kann, wird eine Wochenreaktion durch eine Verlängerung der Inkubationszeit nicht verbessert. Die LFD besteht aus einer internen Kontrolllinie, die durch den Buchstaben C auf dem Kunststoffgehäuse gekennzeichnet ist, und einer Testlinie, die mit dem Buchstaben T gekennzeichnet ist.Die Kontrolllinie sollte immer unabhängig vom Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe erscheinen. Dies zeigt, dass der Assay korrekt abgelaufen ist, wenn das Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe vorhanden ist.

Die Testlinie erscheint ebenfalls innerhalb von 15 Minuten nach der Probenapplikation. Die Intensitäten der Lyme-Borreliose-Reaktionen sind proportional zu den Konzentrationen des Zielantigens in den Serum- und VAL-Proben. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist die Interpretation der Testergebnisse.

Die LFD-Ergebnisse sollten nach 15 Minuten abgelesen und das Testergebnis mit dem hier gezeigten repräsentativen Beispiel verglichen werden. In dieser Abbildung sind repräsentative Beispiele für schwache, positive, mäßig positive und stark positive LFD-Ergebnisse mit BAL- und Serumproben dargestellt. Jede positive Testlinie in der Serumprobe, unabhängig von ihrer Intensität, würde aufgrund des Vorhandenseins von zirkulierendem Aspergillus-Antigen im Blutkreislauf auf eine invasive Parary-Aspergillose oder IPA-Erkrankung hinweisen. Positive BAL-Reaktionen, unabhängig von der Intensität, würden auf die Keimung von Sporen und die Entwicklung einer potenziell pathogenen Hyphy in der Lunge hinweisen.

In Abwesenheit des Aspergillus-Antigens erscheint keine Testlinie und das Ergebnis wird als negativ aufgezeichnet. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von LFD-Tests mit BAL-Flüssigkeiten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder ML, die nach den diagnostischen Kriterien der Europäischen Organisation für die Erforschung und Behandlung von Krebs und der Studiengruppe des National Institute of Allergy and Infectious Diseases diagnostiziert wurden. In dieser Tabelle sind die entsprechenden klinischen und psychologischen Daten sowie die Ergebnisse eines ASPERIA-spezifischen PCR-Tests für jeden Patienten enthalten.

Gemäß den E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2002 wurde bei den Patienten 12, 13 und 16 auf der Grundlage von Wirtsfaktoren und klinischen Kriterien oder GM-Positivität eine mögliche IPA diagnostiziert. Gemäß den überarbeiteten E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2008 würden Wirtsfaktoren und GM-Positivität allein oder Wirtsfaktoren und klinische Kriterien allein nicht auf eine mögliche invasive Pilzinfektion hinweisen, es sei denn, sie werden von unterstützenden Nachweisen aus klinischen Daten bzw. der Mykologie begleitet. Patient sechs wurde sowohl nach den Richtlinien von 2002 als auch von 2008 mit wahrscheinlicher IPA diagnostiziert, und zwar aufgrund von Wirtsfaktoren, Haupt- und Nebenmerkmalen und GM-Positivität.

Abschließend ist zu beachten, dass, obwohl weder der LFD-Assay noch der PCR-Assay derzeit in den E-O-R-T-C-M-S-G-Richtlinien für die BAL-Proben der Patienten sechs und 12 enthalten sind, eine starke Übereinstimmung zwischen den beiden Assays und dem kommerziellen Gala-Manin-Test besteht, die auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und Nukleinsäure nach diesem Verfahren hinweist. Andere Methoden wie der Pella Glactomannan Enzym-Amino-Assay, panf, pilzlicher Beta-Glucan-Test oder Aspergillus-PCR-Tests können parallel durchgeführt werden, um eine invasive Pilzerkrankung zu bestätigen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blutserum und BAL-Flüssigkeiten äußerst gefährlich sein kann und Bediener des Geräts immer gegen Krankheiten wie Hepatitis B und Tuberkulose geimpft sein sollten.