Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Klebeband-basierte Probenahme von Frischprodukten mit dem molekularen Ganzzellnachweis von Salmonellenarten mittels schneller Fluoreszenz in der C-2-Hybridisierung, auch bekannt als Fische, zu koppeln. Dies wird erreicht, indem zunächst Klebeband auf das gewünschte Material aufgebracht und oberflächengebundene Zellen extrahiert werden. Zellladungsbänder können direkt analysiert oder einer Fest- oder Flüssigphasenanreicherung unterzogen werden.

Der zweite Schritt des Verfahrens ist das Tape, die Selbstfixierung und die Dehydratisierung in einer Ethanolserie für Zellen, die in Brühe angedeutet oder angereichert werden. Der zweite Schritt beinhaltet die Zellfixierung in Suspension, gefolgt von der Resus-Suspension der Zellen in Lagerpuffer. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen schnellen Hybridisierungsschritt unter Verwendung eines Salmonellen-spezifischen Oligonukleotid-Sondencocktails durchzuführen, gefolgt von der Entfernung der überschüssigen Sonde mit einer Waschpufferspülung für Proben, die per Fax analysiert wurden, wobei der Fischschritt in Suspension durchgeführt wird und die überschüssige Sonde unter Verwendung eines einfachen Verdünnungsschritts vor der Analyse entfernt werden kann.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die hybridisierten bandgebundenen Zellen mit DPI gegengefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Für faktenbasierte Analysen ist eine Gegenfärbung nicht erforderlich. Letztendlich bietet diese Methode ein Mittel zum visuellen oder zytometrischen Nachweis von Salmonellenarten, die auf beprobten Frischprodukten vorhanden sein können.

Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich von einer italienischen Gruppe las, die einen ähnlichen Ansatz verfolgte, um Bakteriengemeinschaften auf römischen Aerostein-Relikten zu untersuchen. Aber r und ich führten eine Diskussion über diese Arbeit in einem Kurs, den ich über schnelle Methoden in der Lebensmittelmikrobiologie unterrichtete. Ein paar Wochen später begann ein Salmonellenausbruch, der auf frische Produkte zurückzuführen war, schließlich fast 1500 Menschen in 43 verschiedenen Bundesstaaten krank zu machen.

Unser experimenteller Ansatz bietet zwar einen zeitnahen und praktischen Weg zum Nachweis der spezifischen Bakterientypen auf frischen Produkten, ist aber auch tragbar genug, um Tests im Feld oder in einer Lebensmittelproduktionsumgebung zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Auswahl eines Bandes, das für die Probenahme verwendet werden soll. Zu den Optionen gehören das im Handel erhältliche Pilzklebeband oder Kontakt, das steril und zur Vereinfachung der Anwendung auch verpackt ist.

Zeichnen Sie mit einem Permanentmarker mit einer sterilen Aluminiumschablone einen Zentimeter große Quadrate auf die nicht kranke Seite eines 10 Zentimeter großen Klebebands. Dies dient als visuelle Anleitung, um festzustellen, welcher Teil des Klebebands verwendet wurde, um die Lebensmittel- oder Umgebungsoberfläche zu beproben, und bildet eine CS-förmige Schleife aus Klebeband, wobei die klebrige Seite der zu beprobenden Oberfläche zugewandt ist. Halten Sie dazu die klebrigen Enden mit Daumen und Mittelfinger fest und positionieren Sie den Zeigefinger gegen das gezeichnete Quadrat auf der Rückseite des Tapes.

Legen Sie das Tape auf die zu beprobende Oberfläche und drücken Sie die markierte Stelle vorsichtig gegen die Oberfläche, ohne die Kanten des Tapes zu lösen. Stellen Sie mit dem Zeigefinger sicher, dass die klebrige Seite des Klebebandes in vollem Kontakt mit der Probenoberfläche kommt. Vermeiden Sie Blasen mit einer gleichmäßigen Bewegung.

Ziehen Sie das Klebeband langsam von der Probe weg. Die physikalische Extraktion von oberflächengebundenen Mikroben beschleunigt die Zellladung. Klebeband mit der klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger Mit generischem transparentem Büroklebeband sorgen Sie für die richtige Spannung und Dehnung des Klebebandes, so dass eine flache, nicht faltige Oberfläche entsteht.

Dies hilft, Probleme mit Verformungen oder Kräuseln des Bandes zu minimieren. Beim anschließenden Erhitzen. Während der Hybridisierung legen Sie das Klebeband mit der bedruckten Seite nach unten auf die Xylose-Schneideplatten von Tertil vier oder XLT vier Agri, so dass die beprobten Zellen in direktem Kontakt mit der Agri-Oberfläche stehen, um ein einfaches Entfernen des Tapes von der Agri-Oberfläche zu erleichtern.

Nach der Anreicherung wird der schablonierte Probenkontaktabschnitt des Bandes bündig mit der Agraroberfläche platziert, und ein Ende des Bandes wird locker aufgeklebt. Die Seitenwand der Petrischalenplatten ist umgedreht, um Kondensation zu vermeiden, und wird bei 35 Grad Celsius inkubiert. Um ein ausreichendes Wachstum der Salmonellenarten zu ermöglichen, hängt die Länge der Inkubationszeit, die erforderlich ist, um die Zellen auf ein nachweisbares Niveau anzureichern, von den anfänglichen Salmonellenkontaminationsgraden ab.

Öffnen Sie nach der gewünschten Anreicherungszeit die Agarplatte, das Klebeband behält während der Inkubation seine Klebrigkeit. Drücken Sie das Tape vorsichtig mit dem Zeigefinger gegen den Agar, um eine maximale Wiederherstellung der gebildeten Mikrokolonien zu gewährleisten. Fassen Sie an der Tape-Agar-Schnittstelle das Tape von der Kante, die an der Wand der Petrischale befestigt ist, und entfernen Sie es mit einer langsamen, gleichmäßigen Bewegung. Befestigen Sie das Zellenladungsband mit generischem transparentem Büroklebeband mit der klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger, so dass eine flache, nicht faltige Oberfläche entsteht.

Führen Sie eine 30-minütige Fixierung der Bandzellen bei 25 Grad Celsius durch, indem Sie die Kontaktfläche der Probe mit 500 Mikrolitern 10 % neutral gepuffertem Formin abdecken. Entsorgen Sie das Fixiermittel in einem verschließbaren Behälter unter einer Chemikalienhaube, um die Exposition gegenüber reizenden oder giftigen Dämpfen zu minimieren, waschen Sie das Band einmal in einer x phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS, indem Sie die Bandoberfläche vorsichtig mit PBS überfluten, um die Probe zu dehydrieren. Unter Verwendung einer progressiven Ethanolserie werden Hybridisierungs- und Waschpuffer vor der Hybridisierung mit dem kommerziellen molekularbiologischen Lösungsfilter mit einer 22-Mikrometer-Spritze hergestellt und die Hybridisierungs- und Waschpuffer auf 55 Grad Celsius vorgewärmt.

Geben Sie fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden zu einem vorgewärmten Hybridisierungspuffer für eine endgültige Sondenkonzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter, überlagern Sie die mit Schablone versehene Probenkontaktfläche des Bandes mit 300 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, der den Sondencocktail enthält, und hybridisierte bandgebundene Zellen in einer feuchten, versiegelten Inkubationskammer, die auf 55 Grad Celsius eingestellt ist, für einen Direktkontaktinkubator. wie zum Beispiel das Instrument im Slide-Modus, das 15 Minuten lang hybridisiert wurde. Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer-Overlay verworfen. Kurz und schonend mit vorgewärmtem Waschpuffer durch Pipettieren spülen.

Ein kleines Volumen Puffer über einem gekippten Objektträger ermöglicht das Trocknen der Objektträger an der Luft für den Nachweis von Salmonellenarten mittels Fluoreszenzmikroskopie. Überlagern Sie den Objektträger mit ca. 10 Mikrolitern Vektorschild H 1200, Einbettmedium mit dpi, inkubieren Sie den nuklearen Gegenfleck 10 Minuten lang im Dunkeln. Geben Sie Immersionsöl auf die Abdeckung, schieben Sie sie hinein und untersuchen Sie die Proben mit einem Ölobjektiv mit hoher Vergrößerung.

Der DPI-Filter wird verwendet, um die Probe in den Fokus zu bringen. Anschließend wird das Mikroskop auf den entsprechenden Filter umgeschaltet und die Salmonellenzellen werden visuell nach ihrer grünen oder roten Fluoreszenz bewertet, je nachdem, mit welchem Farbstoff die Sonden markiert werden. Die forzytrische Detektion überträgt PBS-suspendierte Proben in fünf Milliliter Probenahmeröhrchen mit rundem Boden und untersucht sie mit einem Durchflusszytometer mit Anregung bei 647 Nanometern.

Analysieren Sie Daten mit der FlowJo-Software. Die Klebebandprobenahme von Terica serovar, Ty Murium, von der Oberfläche einer künstlich kontaminierten Tomate ermöglicht die direkte Analyse nach dem Fisch mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie der Zellladung. Die Tapes wurden für eine schnelle Fluoreszenz in der C-2-Hybridisierung unter Verwendung einer Kombination von salmonellenspezifischen DNA-Sonden verarbeitet und mit Texas Red markiert, abhängig von der anfänglichen lokalen Konzentration von Salmonellenzellen auf dem Band.

Die Festphasenanreicherung führte zu Ergebnissen, die von isolierten Mikrokolonien bis hin zu konfluentem Wachstum reichten. Die vom Band entnommenen Zellen konnten mittels kombinierter Fisch- und Durchflusszytometrie analysiert werden, entweder unmittelbar nach der Probenahme oder nach einer fünfstündigen Flüssigkeitsoberfläche. Mini-Kulturanreicherung bei 35 Grad Celsius.

Obwohl wir die Anwendung der Tape-Fish-Technik für die Lebensmittelsicherheit beschrieben haben, hat die Methode auch ein gutes Potenzial für den Einsatz in anderen Disziplinen, einschließlich der Umweltmikrobiologie, der Pflanzenpathologie oder der klinischen Mikrobiologie. Parallel zu diesem Verfahren können zusätzliche Experimente wie biochemische Tests oder PCR an Fest- oder Flüssigphasenanreicherungen aus bandextrahierten Proben durchgeführt werden. Tests können verwendet werden, um Fragen zu einer Salmonelle zu beantworten, die möglicherweise vorhanden ist, Fragen, die über den Rahmen des Fischverfahrens hinausgehen.