Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Probenahme von frischem Gemüse mithilfe von Klebeband mit der molekularen Detektion von Salmonellen-Spezies in ganzen Zellen mittels schneller Fluoreszenz in der C-two-Hybridisierung, auch bekannt als FISH, zu koppeln. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Klebeband auf das gewünschte Material aufgebracht und daran gebundene Oberflächenzellen extrahiert werden. Die Zellbeladungs-Bändchen können direkt analysiert oder einer festen oder flüssigen Phasen-Anreicherung unterzogen werden.

Der zweite Schritt des Verfahrens erfolgt auf Band, Selbstfixierung und Dehydrierung in einer Ethanolreihe für in Bouillon suspendierte oder angereicherte Zellen. Der zweite Schritt umfasst die Fixierung der Zellen in Suspension, gefolgt von der Resuspension der Zellen in Puffer zur Lagerung. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine schnelle Hybridisierung auf Band unter Verwendung eines salmonellenspezifischen Oligonukleotid-Sonden-Cocktails durchzuführen, gefolgt von der Entfernung überschüssiger Sonde durch Spülen mit Waschpuffer. Für Proben, die per Fax analysiert werden, wird der FISH-Schritt in Suspension durchgeführt, und überschüssige Sonde kann vor der Analyse durch eine einfache Verdünnung entfernt werden.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die hybridisierten, auf dem Band fixierten Zellen mit DPI nachzufärben und mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Für Analysen auf Faktenbasis ist eine Nachfärbung nicht erforderlich. Letztendlich bietet diese Methode eine Möglichkeit zur visuellen oder zytometrischen Detektion von Salmonella-Arten, die auf beprobtem frischem Gemüse oder Obst vorhanden sein können.

Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als ich über eine italienische Arbeitsgruppe las, die einen ähnlichen Ansatz zur Untersuchung bakterieller Gemeinschaften auf römischen Aero-Steinreliefs verwendete. Doch r und ich leiteten eine Diskussion zu dieser Arbeit in einem Kurs, den ich über Schnellmethoden in der Lebensmittelmikrobiologie unterrichtete. Einige Wochen später begann ein mit frischem Gemüse in Verbindung gebrachter Salmonella-Ausbruch, der letztendlich fast 1500 Menschen in 43 verschiedenen Bundesstaaten erkranken ließ.

Obwohl unser experimenteller Ansatz eine zeitnahe und praktische Möglichkeit für den Nachweis spezifischer Bakterientypen auf frischem Gemüse bietet, ist er zudem portabel genug, um Tests vor Ort oder in einer Lebensmittelproduktionsumgebung zu ermöglichen. Beginnen Sie damit, ein Klebeband für die Probenahme auszuwählen. Zu den Optionen gehören im Handel erhältliches Pilz-Klebeband oder Kontaktplatten, die steril sind und ebenfalls zur einfachen Handhabung verpackt vorliegen.

Zeichnen Sie mit einem Permanentstift mithilfe einer sterilen Aluminiumschablone Quadrate von einem Zentimeter auf die nicht klebrige Seite eines 10 Zentimeter langen Klebebandstücks. Dies dient als visuelle Orientierung, um festzuhalten, welcher Bereich des Bandes zum Abtasten der Nahrungsmittel- oder Umgebungsfläche verwendet wurde, indem eine C-förmige Schleife aus dem Band gebildet wird, wobei die klebrige Seite der zu untersuchenden Oberfläche zugewandt ist. Halten Sie hierzu die klebrigen Enden mit Daumen und Mittelfinger fest und positionieren Sie den Zeigefinger auf dem eingezeichneten Quadrat auf der Rückseite des Bandes.

Legen Sie das Klebeband auf die zu untersuchende Oberfläche und drücken Sie den markierten Bereich vorsichtig gegen die Oberfläche, ohne die Ränder des Bandes loszulassen. Verwenden Sie den Zeigefinger, um sicherzustellen, dass die klebrige Seite des Bandes vollständig mit der Probenoberfläche in Kontakt kommt. Vermeiden Sie Blasen, indem Sie eine gleichmäßige Bewegung verwenden.

Ziehen Sie das Band langsam von der Probe ab. Um oberflächengebundene Mikroben physikalisch zu extrahieren, befestigen Sie die Zellprobe an der klebrigen Seite des Bandes. Legen Sie das Band mit der klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger. Verwenden Sie handelsübliches transparentes Büroklebeband und achten Sie darauf, dass das Band gleichmäßig gespannt und leicht gedehnt wird, um eine ebene, faltenfreie Oberfläche zu erzeugen.

Dies hilft, Probleme mit Verformung oder Wellenbildung des Klebebands während der anschließenden Erhitzung zu minimieren. Während der Hybridisierung das Band mit der Oberfläche nach unten auf Xylose-Schneid-Tertil-Vier- oder XLT-Vier-Agari-Platten legen, sodass die entnommenen Zellen direkt mit der Agari-Oberfläche in Kontakt stehen, um die einfache Entfernung des Bands von der Agari-Oberfläche zu ermöglichen.

Nach der Anreicherung wird der mit der Probe belegte Bereich des Klebebands bündig mit der Agaroberfläche platziert, und ein Ende des Bandes wird locker befestigt. Die Petrischalen werden umgedreht, um Kondensation an den Seitenwänden zu vermeiden, und bei 35 Grad Celsius inkubiert. Um ein ausreichendes Wachstum von Salmonellen-Arten zu ermöglichen, hängt die erforderliche Inkubationsdauer zur Anreicherung der Zellen auf nachweisbarem Niveau von der anfänglichen Kontaminationsmenge mit Salmonellen ab.

Nach dem gewünschten Anreicherungszeitraum die Agarplatte öffnen, wobei das Klebeband während der Inkubation seine Klebrigkeit behält. Das Band vorsichtig mit dem Zeigefinger gegen das Agar drücken, um eine maximale Rückgewinnung der an der Grenzfläche zwischen Band und Agar entstandenen Mikrokolonien sicherzustellen. Das Band an der Kante ergreifen, die am Rand der Petrischale befestigt ist, und mit einer langsamen, gleichmäßigen Bewegung abziehen. Mit handelsüblichem transparentem Büroklebeband das Zellladungsband mit der klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger montieren, sodass eine flache, faltenfreie Oberfläche entsteht.

Führen Sie eine Zellfixierung auf dem Tape für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius durch, indem Sie den Probenkontaktbereich mit 500 µL 10 % neutral gepuffertem Formalin bedecken. Entsorgen Sie das Fixativ in einem verschließbaren Behälter unter einer Abzugshaube, um die Exposition gegenüber reizenden oder toxischen Dämpfen zu minimieren. Waschen Sie das Tape einmal mit 1× Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS, indem Sie die Tape-Oberfläche vorsichtig mit PBS überfluten, um die Probe zu dehydrieren. Bereiten Sie mithilfe einer progressiven Ethanolreihe die Puffer für die Prähybridisierung, Hybridisierung und die Waschschritte unter Verwendung kommerzieller, molekularbiologischer Qualität vor, filtrieren Sie diese mit einer 0,22-µm-Spritze und erwärmen Sie die Hybridisierungs- und Waschpuffer auf 55 Grad Celsius.

Fügen Sie fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden dem vorgewärmten Hybridisierungspuffer hinzu, um eine endgültige Sondenkonzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Überdecken Sie den kontaktbasierten Probeneinsatzbereich des Tapes mit 300 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, der das Sonden-Cocktail enthält, und hybridisieren Sie die auf dem Tape gebundenen Zellen in einer feuchten, verschlossenen Inkubationskammer, die auf 55 Grad Celsius eingestellt ist. Bei einem direkten Kontakt-Inkubator, wie beispielsweise einem Gerät im Objektträgermodus, 15 Minuten lang hybridisieren. Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und der Hybridisierungspuffer mit den Sonden wird abdekantiert. Spülen Sie kurz und vorsichtig mit vorgewärmtem Waschpuffer durch Pipettieren.

Eine kleine Puffermenge über einem geneigten Objektträger ermöglicht es, die Objektträger zur Detektion von Salmonellen-Spezies mittels Fluoreszenzmikroskopie an der Luft trocknen zu lassen. Überdecken Sie den Objektträger mit etwa 10 Mikrolitern Vector Shield H 1200, einem Einbettmedium, das DPI, den nuklearen Gegengegenfärbungsfarbstoff, enthält, und inkubieren Sie ihn 10 Minuten im Dunkeln. Geben Sie Immersionsöl auf das Deckglas und untersuchen Sie die Proben mit einem Öl-Immersionobjektiv bei hoher Vergrößerung.

Der DPI-Filter wird verwendet, um die Probe scharfzustellen. Anschließend wird das Mikroskop auf den entsprechenden Filter umgestellt, und die Salmonellen-Zellen werden visuell anhand ihrer grünen oder roten Fluoreszenz ausgewertet, je nachdem, welcher Farbstoff zur Markierung der Sonden verwendet wurde. Für die zytrische Detektion überführen Sie die in PBS suspendierten Proben in 5-Milliliter-Rundbodenzentrifugenröhrchen und untersuchen sie mittels Durchflusszytometrie mit einer Anregung bei 647 Nanometern.

Analysieren Sie die Daten mithilfe der FlowJo-Software. Die Klebebandprobennahme von Terica-Serovar, Ty Murium, von der Oberfläche einer künstlich kontaminierten Tomate ermöglicht eine direkte Nachfischanalyse mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie-Zellladung. Die Bänder wurden für eine schnelle Fluoreszenz in der C-zwei-Hybridisierung unter Verwendung einer Kombination aus Salmonella-spezifischen DNA-Sonden, die mit Texas Red markiert waren, verarbeitet, abhängig von der anfänglichen lokalen Konzentration von Salmonella-Zellen auf dem Band.

Die Anreicherung in der festen Phase ergab Ergebnisse, die von isolierten Mikrokolonien bis hin zu zusammenhängendem Wachstum reichten. Zellen, die mittels Klebeband entnommen wurden, konnten entweder unmittelbar nach der Probenahme oder nach einer fünf Stunden dauernden Flüssigoberflächen-Enrichment-Kultur bei 35 Grad Celsius mittels kombinierter FISH- und Durchflusszytometrie analysiert werden.

Obwohl wir die Anwendung der Tape-Fish-Technik im Bereich der Lebensmittelsicherheit beschrieben haben, bietet die Methode auch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten in anderen Disziplinen wie der Umweltmikrobiologie, der Pflanzenpathologie oder der klinischen Mikrobiologie. Parallel zu diesem Verfahren können zusätzliche Experimente wie biochemische Tests oder PCR an Anreicherungen aus festen oder flüssigen Phasen von abgeklebten Proben durchgeführt werden. Mithilfe dieser Tests lassen sich Fragen zu eventuell vorhandenen Salmonellen beantworten, die über den Anwendungsbereich des Fish-Verfahrens hinausgehen.