Name: Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur schnellen Salmonellen-Detektion auf frischem Gemüse mittels Klebeband-Sampling und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Diese Technik ermöglicht effiziente Lebensmittelsicherheitskontrollen.

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Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Grow Iowa Werte Fund Award an BFBS zur Verfügung gestellt.

1. Oberflächenproben mit Sterile Klebeband <ol><li> Wählen Sie ein Band für die Probenahme zu verwenden. Die im Handel erhältlichen Fungi-Tape oder Con-Tact-It Probenahme Bänder sind steril und speziell verpackte für Benutzerfreundlichkeit. Allerdings haben wir festgestellt, dass transparent (optisch klar) generische Büro Band kann ebenfalls verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie einen Permanent-Marker auf 1 cm 2 Plätze auf der nicht-klebrige Seite eines 10 cm Stück Klebeband (ein Papier-Vorlage verwendet werden kann) zu zeichnen. Dies wird als visuelle Hilfe für die Feststellung, welcher Teil des Bandes verwendet wurde, um die Lebensmittel-oder Umweltproben Oberfläche Probe dienen. </li><li> Form eines "C"-förmigen Schleife der Band, mit der klebrigen Seite nach der Fläche in die Stichprobe. Um dies zu tun, halten Sie die klebrigen Enden mit dem Daumen und Mittelfinger und die Position der Zeigefinger gegen die gezogenen Quadrat auf der Rückseite (nicht-klebrige Seite) des Bandes (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie das Band auf der Oberfläche abgetastet und drücken Sie vorsichtig den markierten Bereich an die Oberfläche. Ohne die Freigabe der Ränder des Bandes, verwenden Sie den Zeigefinger, um sicherzustellen, dass die Klebeseite des Bandes in vollem Kontakt mit der Probenoberfläche kommt, blasenfrei. </li><li> Mit einer gleichmäßigen Bewegung, ziehen Sie das Band von der Probe entfernt, körperlich Extrahieren Oberflächen-gebundenen Mikroben. Befestigen Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger mit generischen transparent Büro Band. Stellen Sie sicher, die richtige Spannung / Dehnung des Bandes, so dass eine ebene, nicht faltig Oberfläche entsteht. Dies wird dazu beitragen minimieren Probleme mit Deformation / Eisstock des Bandes bei der anschließenden Erwärmung während der Hybridisierung. </li></ol> 2. Solid-Phase-Enrichment und Flüssigkeitsoberfläche Miniculture <ol><li> Solid-Phase-Anreicherung ist, indem das Band der Vorderseite nach unten auf Xylose-Lysin-Tergitol 4 (XLT-4)-Agar-Platten, so dass die Proben-Zellen in direktem Kontakt mit der Agar-Oberfläche platziert werden durchgeführt. Die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes ist bündig mit der Agar-Oberfläche und ein Ende des Bandes lose an der Seitenwand der Petrischale geklebt um ein leichtes Entfernen des Bandes aus der Agar-Oberfläche folgende Bereicherung zu erleichtern. </li><li> Die Platten werden invertiert (um Kondensation zu vermeiden) resuspendiert und bei 35 bis 37 ° C, um eine ausreichende Wachstum von Salmonella spp ermöglichen. Die Länge der Inkubationszeit benötigt, um die Zellen auf ein nachweisbares Niveau bereichern wird bei der erstmaligen Kontamination mit Salmonellen abhängen. Wir haben ausgezeichnete Mikrokoloniebildung aus niedrigen anfänglichen Inokula beobachtet nach 8 h Anreicherung. </li><li> Nachdem die gewünschte Anreicherung Zeitraum, öffnen Sie die Agar-Platte. Das Band wird seine Klebrigkeit während der Inkubation zu behalten. Drücken Sie das Band vor dem Agar mit dem Zeigefinger, um die Rückforderung von Mikrokolonien auf der Band-Agar-Schnittstelle gebildet zu gewährleisten. Fassen Sie das Klebeband von der Kante an der Wand der Petrischale und entfernen Sie sie mit einem langsamen, gleichmäßigen Bewegung. Montieren Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 beschrieben. Fahren Sie mit "Fixation und Dehydration" step unten. </li><li> Für flüssige Oberfläche miniculture, durch die Befestigung des Bandes für die Probenahme auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 oben beschrieben, verwendet beginnen. Dann bedecken Sie die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes mit einer nicht sterilen Silikon Perfusionskammer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), bilden eine geschlossene Kammer, deren Boden der Zelle geladenen Band besteht, nach oben. Fest, aber sanft drücken Sie die Kammer in Ort, um eine wasserdichte Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Mit einem flexiblen Gelbeladung Pipettenspitze, Transfer ≤ 500 ul Trypticase Soy Broth oder einem anderen geeigneten Anreicherungsmedium durch eine der Kammer ist klein Einlasskanäle. Seal beide Ports mit transparenten Büro-Band, um Verdunstung und inkubieren bei 35 -37 ° C zu verhindern, wie für eine ausreichende Anreicherung erforderlich. Obwohl alle Operationen nach guter Probenahme und Handhabung Praktiken durchgeführt werden sollte, ist die Sterilität von Port-Dichtband oder Perfusionskammern nicht während der Flüssigkeitsoberfläche miniculture erforderlich. Die Kombination von FISH und Durchflusszytometrie ermöglicht eine klare Diskriminierung von Salmonella spp. von Nicht-Ziel-Bakterien, die vorhanden sein, wobei der größte Anteil der Nicht-Ziel-Flora erwartet von der Probe selbst kommen können. Fahren Sie mit "Fixation und Dehydration" step unten. </li></ol> 3. Fixation und Dehydration <ol><li> Für die direkte Entnahme von Oberflächenproben oder für feste Phase Anreicherung von Salmonella spp. auf XLT-4-Agar, führen on-tape Zellfixierung für 30 min bei 25 ° C durch das Abdecken der Probe Kontaktfläche mit 500 ul 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Discard Fixativ in einem verschließbaren Behälter (unter einer chemischen Haube um die Exposition gegenüber irritierenden / giftige Dämpfe zu minimieren). </li><li> Entwässern in einem Ethanol-Reihe (50%, 80% und 95%, 300 ul / 3 min jeder Konzentration). Fahren Sie mit "Hybridisierung" step unten. </li><li> Zur Fixierung von 500 ul Flüssigkeitsoberfläche miniculture Probes sind Perfusionskammern entsiegelt worden sind, und eine flexible Gel-loading Pipettenspitze wird verwendet, um die enrichate extrahieren. Schnelle rauf und runter Pipettieren verwendet wird, um sicherzustellen, effektive Entfernung der übrigen Band-gebundenen Zellen. </li><li> Anschließend wird die gesamte 500 ul miniculture Lautstärke auf ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert bei 2.000 xg (5 min). Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30-60 s gevortext, dann in ein gleiches Volumen 10% resuspendiert neutral gepuffertem Formalin. Die Zellen werden für 30 min bei 25 ° C fixiert </li><li> Als nächstes Fixativ entfernt und die Probe wird in Zelle Speicher-Puffer, wie folgt. 60 s, die in einem gleichen Volumen von 50% nicht-denaturiertem Ethanol-50% resuspendiert Phosphat-- Die Probe wird bei 2.000 xg (5 min, 25 ° C) den Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30 gevortext gesponnen Kochsalzlösung. Fixierten Zellen können unbegrenzt gelagert werden (in Jahren) bei -20 ° C. Hinweis: Wenn Flüssigkeiten verändert werden (zum Beispiel bei der Einführung eines Fixativ oder verschiedene Puffer), ist es wichtig, gründlich resuspendieren (mit Vortex) das Zellpellet in einem minimalen Anteil (~ 10 bis 20 ul) des "outgoing" flüssigen Systems . Dadurch wird verhindert, Verklumpung und sicherzustellen, dass auch Suspensionen von einzelnen Zellen erhalten werden. Fahren Sie mit "Hybridisierung" step unten. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Hybridisierung / Waschpuffer mit der kommerziellen Molekularbiologie-Grade-Lösungen hingewiesen in Werkstoff-Tabelle. Finale Pufferkomponente Konzentrationen sind 0,7 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% Natriumdodecylsulfat, machte bis zur endgültigen gewünschte Lautstärke mit molekular-Grad Wasser und unter Verwendung einer 0,22 um Spritze oder eine Tasse Filter. Die gleichen Puffer, ohne den Zusatz von Sonden (siehe unten) wird als Waschpuffer verwendet. Vorheizen Hybridisierung und Waschpuffer bis 55 ° C. </li><li> Add fluoreszenzmarkierten Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') und Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) Oligonukleotid-Sonden (Werkstoff-Tabelle) vorgeheizt Hybridisierungspuffer. Insgesamt Sonde Konzentration von 5 ng ul -1 verwendet (z. B. 2,5 ng ul -1 jede Sonde; Bisha und Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Für Direct-to-Tape-und Festphase Bereicherung Proben, überlagern die Vorlagen Probe Kontaktfläche des Bandes mit 300 ul Hybridisierungspuffer mit der Sonde Cocktail und hybridisieren Band-gebundenen Zellen in einer feuchten, verschlossenen Inkubationskammer Satz bis 55 ° C. Wenn eine direkte Kontakt-Inkubator wie der Slide Moat Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden die Proben für 15 min hybridisiert und&gt; 20 Objektträger können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn ein Dreh-style Hybridisierungsofen wie der Bambino-Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden Folien in 50 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Hybridisierung, eine Folie pro Röhrchen gegeben. Da die Wärmeübertragung nicht direkt, werden diese Proben über einen längeren Zeitraum (bis zu 30 min) hybridisiert. </li><li> Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und die Sonde-haltigen Hybridisierungspuffer Overlay wird verworfen. Folien werden dann entweder kurz und sanft mit vorgewärmten Waschpuffer durch Pipettieren einem kleinen Volumen Puffer über eine geneigte Rutsche (3 Spülungen von 300 ul jeweils) gespült, oder formal gewaschen (bis zu 30 min) mit entweder einer Überlagerung von vorgewärmtem Waschpuffer oder Eintauchen in eine 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten Waschpuffer. Nach unserer Erfahrung ist, obwohl eine formelle waschen verbesserten Ergebnissen (weniger Dunst von ungebundenen Sonde) bieten wird, spülen Sie einfach ausreichend für eindeutige Nachweis von Salmonella spp. Anschließend werden Dias an der Luft getrocknet, bevor er nach der "Detection" Schritt unten. </li><li> Die Hybridisierung der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben wird durch Abzentrifugieren Proben (frisch fixiert oder auf Lager gehalten Puffer bei -20 ° C) für 5 min bei 2.000 xg durchgeführt, gefolgt von kräftigem Vortexen des Pellets und Resuspendierung in 100 ul vorgewärmte Hybridisierungspuffer mit die Sonde Cocktail. Die Proben werden bei 55 hybridisiert ° C für 30 min auf einem Heizblock oder einem anderen geeigneten Inkubationszeit Bahnhof (Werkstoff-Tabelle), durch Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer folgte. Wie bei Band-gebundenen Proben, können diese Proben formal gewaschen werden bis zu 30 min mit weiteren Inkubation bei 55 ° C in diesem Waschpuffer mit Intervallschaltung Vortexen. Alternativ können die Proben gründlich nach Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer verwirbelt werden, gefolgt von sofortiger Ernte für die Analyse (unten). </li><li> In Vorbereitung für den Nachweis von Salmonella spp. über Durchflusszytometrie, Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben bis auf 2.000 xg für 5 min gesponnen werden, der Überstand wird verworfen und die Proben werden in 300 ul Raumtemperatur resuspendiert (~ 25 ° C) PBS. Wenn Proben Transport benötigen, um eine entfernte Anlage, oder wenn eine Verzögerung zwischen Hybridisierung und Analyse zu erwarten ist, können die Proben im Kühlschrank gelagert werden oder statt auf dem Eis vor anaLyse. Alternativ können die Proben zu Zelle Pufferspeicher (50:50-Mischung aus PBS und absolutem Ethanol) übertragen werden und hielt bei -20 ° C bis zu einer Woche ohne nennenswerte Verluste in Sonde-verliehenen Fluoreszenz (Bisha und Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Erkennung <ol><li> Für on-tape Nachweis von Salmonella spp. via Fluoreszenzmikroskopie werden direct-to-Tape oder fester Phase Bereicherung Proben mit ~ 10 ul Vectashield H-1200 Montage-Medium mit den nuklearen Gegenfärbung 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI), mit einem Deckglas montiert überlagert, dann im Dunkeln für 10 min inkubiert. </li><li> Immersionsöl auf das Deckglas gelegt, und die Proben werden unter Verwendung eines High-Vergrößerung Öl-Objektiv (63x oder 100x). Die DAPI-Filter verwendet wird, um die Probe in den Fokus zu bringen, das Mikroskop wird dann an den entsprechenden Filter (grün oder rot, je nach dem verwendeten Farbstoff zu Ende-Label der Sonden) und Salmonella-Zellen abgeschaltet werden visuell nach ihrer Fluoreszenz (erzielte Fakten 2 und 3). </li><li> Für durchflusszytometrischen Nachweis der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben können verschiedene Instrumente verwendet, je nach lokaler Verfügbarkeit werden. In unserem Labor sind PBS suspendiert Proben zu 5 ml Rundboden Probenahme-Röhrchen (BD Falcon) überführt und unter Verwendung eines FACSCanto Durchflusszytometer mit einer Anregung bei 647 nm (Werkstoff-Tabelle). Für angereicherten Proben mit hohen Zahl von insgesamt Bakterien, ist die "Low-Flow-Rate"-Einstellung (10 l min -1) verwendet und 5.000-50.000 Ereignisse gesammelt werden. Daten werden mit Hilfe FlowJo Software (Version 8.8.6, Baum Star, Inc., Ashland, OR) oder andere geeignete Analyse-Software (Abbildung 4, Platten A und B). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von Salmonella spp. von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Typische Ergebnisse für direct-to-Tape-Probenahme-und FISH Detektion von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 von der Oberfläche der Tomaten (100 X Öl-Objektiv). Ein Zwei-Sonde Cocktail aus Texas Red-markierten Sonden (Sal3/Salm-63) wurde verwendet, zur Kennzeichnung dieser Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Mikrokolonien von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 auf der Oberfläche der Xylose-Lysin-Tergitol-4 (XLT-4)-Agar nach 8 h on-tape Bereicherung bei 37 ° C. Die anfängliche Inokulum von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten abgetastet wurde gebildet. Solid-Phase-Anreicherung steigt die Zahl der verfügbaren Zellen für die Detektion und verbessert auch die zelluläre rRNA Inhalt. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von S. enterica Serovar Typhimurium von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten, durch direkte Analyse über FISH und Durchflusszytometrie (Panel A) oder nach 5 h nicht-selektiven Flüssigkeitsoberfläche miniculture Bereicherung in einer Perfusionskammer mit 500 ul Trypticase Soy Broth (Panel B gefüllt, gefolgt ).

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<li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.</li>
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</ol>

Einfache und schnelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern auf Oberflächen erzeugen kann zu einer Abschwächung Lebensmittelinfektionen durch rechtzeitige und verwertbare Daten. Klebeband-basierte Methoden zur Probenahme in Umwelt-, Klinik-und Lebensmittel-Mikrobiologie, seit den 1950er Jahren verwendet und beinhalten Drücken von &quot;Scotch&quot;-Stil Band auf Oberflächen zur Entfernung von Mikroorganismen, gefolgt von direkten mikroskopischen Untersuchung oder die Übertragung von anhaftenden Mikroorganismen zu...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape Probenahmeband</td><td>Wissenschaftliches Gerätelaboratorium</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It-Probenahmeklebeband</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Durchsichtiges Büroband, generisch</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Sollte optisch klar sein und eine geringe Eigenfluoreszenz aufweisen</td></tr><tr><td>Oberfläche von Lebensmitteln</td><td>Lokaler Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>Tomate&amp;#8211;s (rote Tomate&amp;#8211;an der Rebe gereift, hier verwendete nicht gewachste oder geölte Früchte</td></tr><tr><td>Trypticase-Soja-Brühe</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>Für die anreichernde Minikultur auf flüssiger Oberfläche ohne Selektion</td></tr><tr><td>Basis für Xylose-Lysin-Tergitol-4-Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>Für &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;selektives Agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Xylose-Lysin-Tergitol-4-Agar-Supplement</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>Für&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;selektives Agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Formalinlösung </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10%ige Lösung, neutral, gepuffert (Zellfixiermittel)</td></tr><tr><td>Absolutethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Molekularbiologische Qualität (vor der Hybridisierung durchgeführte Dehydrierung)</td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>RNase- und DNase-frei</td></tr><tr><td>Mikroskopische Objektträger und Deckgläser</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Molekularbiologische Qualität, 5 M Lösung (Bestandteil des Hybridisierungspuffers)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA-Pufferlösung (100× Konzentrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1 M Tris [pH 8,0], 0,1 M EDTA (Komponente der Hybridisierungspufferlösung)</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfatlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>10%ige Lösung in 18-Megohm-Wasser (Bestandteil des Hybridisierungspuffers)</td></tr><tr><td>Sal3- und Salm-63-Oligonukleotidsonden</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-markiert mit 6-Carboxyfluorescein (FAM) oder Texas Red (für die Mikroskopie) bzw. Cy5 (für die Zytometrie), HPLC-gereinigt</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge mit variabler Drehzahl</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Verwenden Sie den Rotordurchmesser, um die für die im Protokoll beschriebenen RCF-Werte benötigte Drehzahl (RPM) zu berechnen.</td></tr><tr><td>CoverWell-Perfusionskammer </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>Nicht steril</td></tr><tr><td>Gelpipettenspitzen (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Lange, dünne Spitzen für den einfachen Zugang zu kleinen Probenahmestellen und hohe Beweglichkeit innerhalb der Kammer</td></tr><tr><td>Aluminium-Wärmespeicherblock oder präzisionsgesteuerte Heizstation</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Eppendorf Thermomixer R Trockenblock-Heiz- und Kühlschüttler, hier verwendet</td></tr><tr><td>Bambino Mini-Hybridisierofen</td><td>Boekel Scientific</td><td>Modell 230300</td><td>Die Objektträger werden für die Hybridisierung in 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, Wärmeübertragung nicht direkt</td></tr><tr><td>Slide Moat-Schlittenhybridisierer</td><td>Boekel Scientific</td><td>Modell 240000</td><td>Ermöglicht eine schnelle, direkte Wärmeübertragung durch den Objektträger</td></tr><tr><td>Vectashield H-1200 Eindeckmedium mit 4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Minimiert die Abschwächung der Fluoreszenz während der Mikroskopie, liefert eine DAPI-Gegenfärbung</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Leitz Laborlux S, hier verwendet</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Kamera des Typs Canon PowerShot A640, wie hier verwendet</td></tr><tr><td>Software zur Bildaufnahme</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Axiovision-Software v. 4.6 (Carl Zeiss) verwendet</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Für die minimale Bildverarbeitung (Überlagerung von Bildern, die in verschiedenen Kanälen aufgenommen wurden)</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>FACSCanto-Flusszytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) mit roter (647 nm) Anregung verwendet</td></tr><tr><td>Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>FlowJo Software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) verwendet</td></tr></tbody></table>

kombination von klebstoff-tape-basierten sampling und fluoreszenz in situ hybridisierung zum schnellen nachweis von salmonellen on fresh produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für Klebeband-basierte Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen, durch on-tape-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die schnelle Kultur-unabhängigen Nachweis von Salmonella spp. Cell-geladenen Bänder können auch verdeckt auf Selektivagar für Festphasen-Anreicherung gelegt werden, bevor die Erkennung. Alternativ kann mit geringem Volumen Flüssigkeit Anreicherungen (Flüssigkeitsoberfläche miniculture) auf der Oberfläche des Bandes in nicht-selektiven Brühe durch FISH und Analyse über die Durchflusszytometrie gefolgt durchgeführt werden. Um zu beginnen, sterile Klebeband ist in Kontakt mit frischen Produkten gebracht wird, wird sanfter Druck angewandt, und das Band entfernt wird, physisch Extrahieren Mikroben anwesend auf diesen Flächen. Tapes sind klebrig-Seite nach oben auf Objektträger aus Glas montiert und in der Stichprobe Zellen werden mit 10% igem Formalin (30 min) und entwässert mit einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 80 und 95%; 3 min jeder Konzentration) festgelegt. Als nächstes Zelle aufgeladen Bänder werden mit Puffer mit einem Salmonella-gezielte DNA-Sonde Cocktail gesichtet und hybridisiert für 15 bis 30 min bei 55 ° C, gefolgt von einer kurzen in einem Waschpuffer, um ungebundene Sonde zu entfernen spülen. Adhärente sind FISH-markierten Zellen werden dann mit den DNA-Farbstoff 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) gegengefärbt und die Ergebnisse betrachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für Festphasen-Anreicherung, sind Zell-geladenen Bänder Gesicht nach unten auf einen geeigneten selektiven Agar-Oberfläche gelegt und inkubiert, um in situ Wachstum von Salmonella Mikrokolonien durch FISH und Mikroskopie verfolgt, wie oben beschrieben zu ermöglichen. Für flüssige Oberfläche miniculture sind Zell-geladenen Bänder klebrigen Seite nach oben und ein Silikon Perfusionskammer angewendet wird, so dass das Band und Objektträger bilden den Boden einer wasserdichten Kammer, in die ein kleines Volumen (≤ 500 ul) von Trypticase Soy Broth (TSB) wird eingeführt. Die Einlassöffnungen sind versiegelt und die Kammern sind bei 35 inkubiert - 37 ° C, so dass das Wachstum-basierte Amplifikation von Tape-extrahierten Mikroben. Nach der Inkubation Einlasskanäle entsiegelt worden sind, Zellen abgelöst und unter kräftigem wieder gemischt und her Pipettieren geerntet durch Zentrifugation und in 10% neutral gepuffertem Formalin. Schließlich sind die Proben hybridisiert und untersucht per Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Salmonella spp offenbaren. Wie hier beschrieben, können unsere &quot;Band-FISH&quot;-Ansatz bietet eine einfache und schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf Tomaten Oberflächen. Wir haben auch diesen Ansatz für die Probenahme andere Arten von frischen Produkten, einschließlich Spinat und Chilischoten verwendet.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt<em&gt; Salmonellen</em&gt; Mittels Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für die klebebandbasierte Probenahme von Oberflächen von Tomaten und anderem frischem Erzeugnis, gefolgt von einer Fluoreszenzuntersuchung direkt auf dem Klebeband in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Probenahme von frischem Gemüse mithilfe von Klebeband mit der molekularen Detektion von Salmonellen-Spezies in ganzen Zellen mittels schneller Fluoreszenz in der C-two-Hybridisierung, auch bekannt als FISH, zu koppeln. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Klebeband auf das gewünschte Material aufgebracht und daran gebundene Oberflächenzellen extrahiert werden. Die Zellbeladungs-Bändchen können direkt analysiert oder einer festen oder flüssigen Phasen-Anreicherung unterzogen werden.Der zweite Schritt des Verfahrens erfolgt auf Band, Selbstfixierung und Dehydrierung in einer Ethanolreihe für in Bouillon suspendierte oder angereicherte Zellen. Der zweite Schritt umfasst die Fixierung der Zellen in Suspension, gefolgt von der Resuspension der Zellen in Puffer zur Lagerung. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine schnelle Hybridisierung auf Band unter Verwendung eines salmonellenspezifischen Oligonukleotid-Sonden-Cocktails durchzuführen, gefolgt von der Entfernung überschüssiger Sonde durch Spülen mit Waschpuffer. Für Proben, die per Fax analysiert werden, wird der FISH-Schritt in Suspension durchgeführt, und üb

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Erfahren Sie eine Methode zur schnellen Salmonellen-Detektion auf frischem Gemüse mittels Klebeband-Sampling und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Diese Technik ermöglicht effiziente Lebensmittelsicherheitskontrollen.

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