Video-Okulographie in Mäuse
19. Juli 2012
Video-EOG ist ein sehr quantitative Methode zur okularen motorischen Leistungsfähigkeit zu untersuchen sowie motorischen Lernens. Hier beschreiben wir, wie man Video-Okulographie bei Mäusen zu messen. Die Anwendung dieser Technik auf normalen, pharmakologisch behandelt oder gentechnisch veränderten Mäusen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu Grunde liegenden Physiologie der motorischen Verhaltensweisen zu erforschen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Video-Okulographie bei Mäusen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Sockelkonstruktion am Schädel der Maus angebracht wird, die es ermöglicht, ihren Kopf in einer speziellen Kopf-Körper-Fixiervorrichtung zu immobilisieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Maus in der Video-Okul-Anlage zu positionieren und das Video-Pupillen-Tracking-System zu kalibrieren.
Anschließend werden Augenbewegungen aufgezeichnet, während das okulomotorische System mittels eines umfangreichen Repertoires vestibulärer und optokinetischer Reize aktiviert wird. Der letzte Schritt besteht in der Analyse dieser Augenbewegungen. Letztendlich kann die Video-O-Graphie an normalen, pharmakologisch behandelten oder genetisch veränderten Mäusen verwendet werden, um die Physiologie motorischer Verhaltensweisen zu untersuchen.
Obwohl diese Methode Einblicke in das okulomotorische System ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung von Erkrankungen mit zerebellärer, vestibulärer oder okularer Genese angewendet werden, indem Mausmutanten verwendet werden, die menschliche Pathologien nachahmen. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie die Maus in einer Gasnarkosekammer mit einer Mischung aus Isofluran, Fluor und Sauerstoff. Anschließend wird die Narkose durch eine Maske aufrechterhalten, über die das Gas zugeführt wird.
Als Nächstes verwenden Sie eine Heizplatte und einen analen Thermosensor, um die Körpertemperatur der Maus bei 37 Grad Celsius zu halten. Anschließend tragen Sie den Augensalbe auf, um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen, rasieren das dorsale Kopfhaar und reinigen den Operationsbereich. Danach führen Sie einen medianen Schnitt durch, um die dorsale Schädelfläche freizulegen, und reinigen sowie trocknen die Oberfläche.
Dann eine Tropfen Phosphorsäure von bgma auf Lambda auftragen. Nach 15 Sekunden das Ätzen entfernen, die Schädeloberfläche mit Kochsalzlösung reinigen und erneut trocknen. Einen Tropfen Opti Bond Prime auf die oberste Stelle der geätzten Schädeloberfläche auftragen und mit Luft abblasen.
Trocknen Sie es 30 Sekunden lang. Fügen Sie danach einen Tropfen Opti Bond Haftvermittler auf dem Opti Bond Primer hinzu. Härten Sie ihn eine Minute lang mit UV-Licht aus.
Anschließend bedecken Sie die Klebeschicht mit einer dünnen Schicht Charisma-Composite. Der Verbinder mit Magnetschraubenbohrung und Befestigungsstellen wird in das Composite eingebettet. Danach härten Sie das Composite mit UV-Licht aus.
Gegebenenfalls erneut zusätzliche Kompositlagen auftragen und mit Licht aushärten. Dem Tier nach der Operation mindestens drei Tage zur Erholung zugestehen. Im nächsten Schritt wird die Maus in die Haltevorrichtung gebracht und der Kopf mit dem Magneten und einer Schraube befestigt; die Kopf- und Körpervorrichtung für die Maus wird auf eine XY-Plattform montiert.
Platzieren Sie mit Hilfe der XY-Plattform den Kopf der Maus über der Mitte der Drehscheibe, sodass die Maus über die Nick- und Rollachsen bewegt werden kann. Bringen Sie anschließend den Kopf in den korrekten Nick- und Rollwinkel, indem Sie das Auge anhand des vom Augenscan-System erzeugten visuellen Bildes des Auges ausrichten. Die Drehscheibe ist nun mit einem AC-Servomotor verbunden.
Die Position des Drehtellers wird mit einem am Drehachse des Drehtellers angebrachten Potentiometer überwacht. Der Drehteller ist von einem zylindrischen umgebenden Bildschirm mit einem zufälligen Punkt-Muster bedeckt, der ebenfalls mit einem AC-Servomotor ausgestattet ist. Die Position des zylindrischen Bildschirms wird durch ein an seiner Achse befestigtes Potentiometer überwacht.
Die Projektionswand kann mit einem Halogenlicht beleuchtet werden. Die Bewegung des Drehtellers und der umgebenden Wand wird von einem Computer gesteuert, der mit einer Ein-/Ausgabeschnittstelle verbunden ist. Die Positionssignale des Drehtellers und der umgebenden Wand werden über eine 20-Hertz-Grenzfrequenz gefiltert, von der Ein-/Ausgabeschnittstelle digitalisiert und auf diesem Computer gespeichert.
Das Auge der Maus wird durch drei Infrarotstrahler beleuchtet. Zwei davon sind am Drehteller befestigt, und der dritte ist an der Kamera angebracht. Dieser dritte Strahler erzeugt eine Referenzreflexion an der Hornhaut, die während des Kalibrierungsverfahrens und bei den Augenbewegungsaufnahmen verwendet wird.
Eine Infrarot-CCD-Kamera, die mit einem Zoombobjektiv ausgestattet ist, ist an der Drehscheibe befestigt und auf den Kopf der Maus fokussiert. In der Mitte der Drehscheibe. Die Kamera kann entriegelt werden und entlang der Drehachse exakt um 20 Grad bewegt werden.
Während des Kalibrierungsverfahrens wird das Videosignal dann von einem Eye-Tracking-System verarbeitet, das die Pupille und die referenzielle Hornhautreflexion in horizontaler und vertikaler Richtung mit einer Abtastrate von 120 Hertz verfolgen kann. Anschließend werden die Position des referenziellen Hornhautreflexes, die Pupillenposition und die Pupillengrößensignale über die Ein- und Ausgabeschnittstelle digitalisiert und gemeinsam mit den Signalen der Tisch- und Umgebungsbildschirmpositionen in derselben Datei gespeichert, um die Augenbewegungen zu kalibrieren. Stellen Sie die Kopfposition der Maus mit Hilfe der Kamera so ein, dass das Videobild der Pupille in der Mitte des Monitors liegt und die Darstellung des referenziellen Hornhautreflexes auf der vertikalen Mittellinie des Auges direkt über der Pupille positioniert ist.
Bewegen Sie als Nächstes die Kamera mehrmals um jeweils 20 Grad Spitze. Drehen Sie um die vertikale Achse des Drehtellers. Verwenden Sie die Positionen der verfolgten Pupille und der referenzierten Hornhaut, die in den Extrempositionen der Kamera aufgezeichnet wurden, um den Radius der Pupillenrotation zu berechnen.
Wiederholen Sie diese Schritte mehrmals unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen, um den Zusammenhang zwischen der Pupillengröße und der Pupillenrotation zu bestimmen. Erstellen Sie anschließend eine Korrekturkurve für die Pupillenrotation. Berechnen Sie nun die Winkellage des Auges, indem Sie die Referenzposition der Hornhaut, die Pupillenposition und die Pupillengröße messen.
Der Pupillenrotationswert kann aus der Rotationskorrekturkurve der Pupille extrahiert werden, und die Winkellage des Auges kann mithilfe der folgenden Formel berechnet werden. Hier wird das VVOR-Augenbewegungsexperiment gezeigt. Konvertieren Sie nun die Augenpositionen, Tischpositionen und Umgebungs-Bildschirmpositionen in Winkelpositionen.
Anschließend differenzieren und filtern Sie die Winkellagen des Augentisches und des umgebenden Bildschirms mit einem Tiefpass-Butterworth-Filter. Unter Verwendung einer Grenzfrequenz von 20 hertz sub entfernen Sie die Sekunde aus dem Augenbewegungssignal mithilfe einer Erkennungsschwelle von 40 Grad pro Sekunde. Danach mitteln Sie die Tisch- und Augenbewegungssignale unter Verwendung jedes einzelnen Zyklus im Versuch und passen die gemittelten Signale mit einer geeigneten Funktion an.
Im Allgemeinen wird eine sinusförmige Geschwindigkeitsstimulation verwendet, und die durchschnittlichen Zyklen werden mit einer Sinus- oder Kosinusfunktion angepasst. Dieser Film zeigt, wie die Augenbewegungen durch die Drehung des umgebenden Bildschirms erzeugt werden, um einen optokinetischen Reflex hervorzurufen, wobei der umgebende Bildschirm über einen Frequenzbereich von 0,2 bis eins Hertz mit einer Amplitude von 1,6 Grad gedreht wird. Das optokinetische System der Maus erweist sich im niederfrequenten Bereich als effizienter als im hochfrequenten Bereich.
Hier ist ein weiterer Film, der zeigt, wie die Augenbewegungen erzeugt werden. Durch Drehen der Maus im Dunkeln wird der vestibulo-okulare Reflex ausgelöst, wobei der Drehteller über einen Frequenzbereich von 0,2 bis 1 Hz mit einer Amplitude von 1,6 Grad gedreht wird. Es zeigt sich, dass das vestibulo-okulare System der Maus im hohen Frequenzbereich effizienter ist als im niedrigen Frequenzbereich.
Hier wird ein weiterer Film gezeigt, der veranschaulicht, wie Augenbewegungen erzeugt werden, indem die Maus im Licht rotiert wird, um einen visuell verstärkten vestibulären Okularreflex hervorzurufen, wobei die Drehscheibe über einen Frequenzbereich von 0,2 bis 1 Hertz mit einer Amplitude von 1,6 Grad gedreht wird, während der umgebende Bildschirm gut beleuchtet ist. Es wird gezeigt, dass die Maus über den gesamten Frequenzbereich effiziente kompensierende Augenbewegungen erzeugt. Dieser Film zeigt, wie motorisches Lernen durch adaptive Steigerung des vestibulären Okularreflexes erreicht wurde. Mithilfe eines gegenphasigen Trainingsparadigmas, bei dem die Drehscheibe gegenphasig zum umgebenden Bildschirm rotiert wird, erhöht sich die VOR-Verstärkung dieser Maus.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Video-Okulographie bei Mäusen durchführt.
Übersicht
In diesem Artikel wird die Vorgehensweise zur Durchführung der Video-Okulographie bei Mäusen beschrieben, eine quantitative Methode zur Untersuchung der okulomotorischen Leistung und motorischen Lernfähigkeit. Die Technik kann an normalen, pharmakologisch behandelten oder genetisch veränderten Mäusen angewendet werden, um die Physiologie motorischer Verhaltensweisen zu erforschen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Okulomotorische Leistung
- Motorisches Lernen
Hintergrund
- Die Video-Okulographie ist eine Methode zur Untersuchung von Augenbewegungen.
- Diese Technik liefert Erkenntnisse über das okulomotorische System.
- Sie kann auch zur Untersuchung von Erkrankungen mit zerebellärer oder vestibulärer Genese eingesetzt werden.
- Mausmodelle können menschliche Pathologien zu Forschungszwecken nachahmen.
Zweck der Studie
- Augenbewegungen bei Mäusen messen und analysieren.
- Die zugrundeliegende Physiologie motorischer Verhaltensweisen untersuchen.
- Die Methode auf verschiedene Mausmodelle für Krankheitsstudien anwenden.
Verwendete Methoden
- Rüsten Sie die Maus mit einem Sockel zur Fixierung des Kopfes aus.
- Kalibrieren Sie das Video-Pupillentrackingsystem.
- Aufzeichnung von Augenbewegungen unter Verwendung vestibulärer und optischer Reize.
- Analysieren Sie die aufgezeichneten Augenbewegungen, um physiologische Erkenntnisse zu gewinnen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kalibrierung des Eye-Tracking-Systems.
- Aufzeichnung von Augenbewegungen unter verschiedenen Reizbedingungen.
- Datenanalyse, die Einblicke in die Physiologie des motorischen Verhaltens liefert.
- Anwendung der Methode zur Untersuchung von Erkrankungen des okulomotorischen Systems.
Schlussfolgerungen
- Die Video-Okulographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Augenbewegungen.
- Mit der Methode kann das Verständnis von motorischem Lernen und Leistung verbessert werden.
- Sie bietet Potenzial für die Erforschung von Erkrankungen, die das okulomotorische System betreffen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Video-Okulographie bei Mäusen liefert einen quantitativen Verhaltensparameter zur Beurteilung der okulomotorischen Funktion und ermöglicht die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen, die an vestibulären, zerebellären und okulomotorischen Bahnen beteiligt sind. Die Methode unterstützt die Zielvalidierung, indem genetische oder pharmakologische Eingriffe mit messbaren Veränderungen reflektorischer Augenbewegungen verknüpft werden und so eine vorhersagbare Aussagekraft in der frühen Forschung bietet. Ihre Anwendbarkeit auf krankheitsrelevante Modelle verbessert die translationale Kontinuität für Pipelines neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die auf das vestibuläre, zerebelläre und okulomotorische System abzielen, anhand quantifizierbarer Verhaltensphänotypen.
- Operationaler Wert: Bietet einen reproduzierbaren, mit Hochdurchsatzverfahren kompatiblen Test zur Identifizierung genetischer und pharmakologischer Modulatoren des motorischen Verhaltens.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung, indem die Funktion des okulomotorischen Schaltkreises von störenden motorischen oder motivationalen Variablen isoliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Augenbewegungsgeschwindigkeit, Verstärkung, Phase), die Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Genotyp-Phänotyp-Korrelationen ermöglichen.
- Operationaler Wert: Standardisierte Kalibrierungs- und Nachverfolgungsprotokolle gewährleisten die Übertragbarkeit zwischen Laboren und die Bereitschaft des Assays zur Wirkstoffbewertung.
- Wissenschaftlicher Wert: Die Ergebnisse unterstützen die mechanistische Risikominimierung, indem sie die Beiträge des vestibulären, optokinetischen und visuell verstärkten VOR zur motorischen Steuerung voneinander unterscheiden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Krankheitsrelevante Systeme: Mausmodelle, die menschliche vestibuläre, zerebelläre oder okuläre Pathologien nachahmen, ermöglichen eine direkte translationale Abstimmung von Biomarkern.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Verfolgung von motorischem Lernen und adaptiver Plastizität und unterstützt so die präklinische Validierung kognitiver und motorischer Therapeutika.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem funktionelle Erholung oder Fortschreiten von Defiziten in genetischen Modellen quantifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows als phänotypisches Screening-Tool zur Zielvalidierung integrieren, wobei die Ergebnisse die Identifizierung von Leitstrukturen und Entscheidungen über die präklinische Weiterentwicklung auf Grundlage der Integrität des okulomotorischen Systems beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung vestibulärer und optokinetischer Beiträge zur Augenbewegungssteuerung.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Kopffixierung, Kalibrierung und Stimuluspräsentation, wodurch eine zuverlässige Bewertung von Wirkstoffen oder Genotypen gewährleistet ist.
- Analytik: Liefert quantitative Messgrößen (Winkelposition des Auges, Geschwindigkeit, Verstärkung), die gefiltert und an sinusförmige Reize angepasst sind, um vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch Anwendbarkeit in Krankheitsmodellen und ermöglicht die Beurteilung therapeutischer Wirkungen auf motorische Verhaltensphänotypen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für interdisziplinäre Teams, die motorisches Lernen, Gleichgewichtsstörungen und neuropsychiatrische Indikationen erforschen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Sicherheit beim Target-Engagement anhand messbarer Veränderungen der Gain- und Phasenwerte von VOR, OKR und VVOR.
- Operativer Wert: Standardisierte chirurgische Vorbereitung, Fixierung des Kopfes und Infrarot-Tracking gewährleisten die Reproduzierbarkeit über Labore und Zeitpunkte hinweg.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien, indem frühzeitige Erkennung von Funktionsstörungen motorischer Schaltkreise in genetischen oder pharmakologischen Modellen ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die okulomotorische Leistung als Biomarker für die Integrität neuronaler Schaltkreise quantifiziert wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in muriner Chirurgie, Implantation von Kopfplatten und Infrarot-Augenbewegungs-Tracking-Systemen.
- Benötigt spezialisierte Ausrüstung, einschließlich XY-Plattformen, servogesteuerter Drehteller, Infrarotstrahler und Hochgeschwindigkeits-CCD-Kameras.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teams hinweg bei chirurgischen Protokollen, Kalibrierungsverfahren und Stimulusparametern zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse voraus.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen modellspezifische Anpassungen bezüglich Mausstamm, Körpergewicht und okulärer Pigmentierung, die die Genauigkeit der Infrarot-Tracking-Messung beeinflussen können.
- Praktische Einschränkungen beinhalten die Erholungszeit nach der Operation sowie mögliche Störgrößen durch Anästhesie oder Entzündungen, die die Baseline-Funktion der Augenmotorik beeinträchtigen können.
