Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Schritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu demonstrieren, die verwendet wird, um aus einer kleinen Menge Ausgangsmaterial einen ausreichenden Vorrat an einem bestimmten DNA-Segment herzustellen. Assemblieren Sie zunächst die Reagenzien und Materialien, die in der PCR-Reaktion verwendet werden sollen, und richten Sie dann das Reaktionsgemisch ein, einschließlich der vier Desoxy-Ribonukleotide, des DNA-Templates, der Primer und der DNA-Polymerase. Als nächstes programmieren Sie die thermischen Zyklusbedingungen und führen Sie die PCR-Reaktion durch.

Im Anschluss daran. Überprüfen Sie die Ergebnisse, um festzustellen, ob die Reaktion erfolgreich war. Letztendlich sollte eine Polymerase-Kettenreaktion ein spezifisches Amplikon der gewünschten Produktgröße ergeben.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit diesem Protokoll noch nicht vertraut sind, ein wenig Schwierigkeiten mit der Erstellung der Berechnungen für jedes der variablen Reagenzien, und manchmal haben sie Probleme mit dem Pipettieren, den richtigen Volumina, insbesondere mit der Polymerase, die Glycerin enthält. Beginnen Sie das Experiment mit einem frisch gefüllten Eiskübel. Tragen Sie Handschuhe, um eine Kontamination der Reaktion zu vermeiden.

Mischung und Reagenzien. Ordnen Sie die PCR-Komponenten auf Eis an, um sie vollständig aufzutauen. Dazu gehören die DNA-Template-Primer, DNA-Polymerase 10 x Reaktionspuffer mit oder ohne Magnesiumchlorid, Desoxynukleotide, steriles Wasser und Magnesiumchlorid.

Das Magnesiumchlorid wird benötigt, wenn der Puffer ohne Magnesiumchlorid verwendet wird. Legen Sie eine 96-Well-Platte als Halterung für die dünnwandigen 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen in einen Eiskübel. Rüsten Sie nun die Werkbank mit PCR-Röhrchen und -Kappen aus.

Ein PCR-Röhrchengestell, ein ethanolresistenter Marker und ein Satz Mikropipetten. Erstellen Sie immer eine Tabelle mit Reagenzien, in der das Reaktionsgemisch mit quantensterilem destilliertem Wasser aufgeführt ist, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Zum Beispiel die Verwendung von fünf Mikrolitern eines Puffers ohne Magnesium, einem Mikroliter 10 Millimolar DN NTPs und einem optimierten 4,0 Millimolar Magnesium.

Ein Mikroliter von je 20 mikromolaren Primern, 0,5 Mikroliter von zwei Nanogramm pro Mikroliter-Matrize. Und 0,5 Mikroliter Polymerase würden nur 33 Mikroliter steriles Wasser erfordern. Fügen Sie Magnesiumchlorid hinzu, wenn es nicht im 10 x Puffer vorhanden ist oder wenn es für die PCR-Optimierung benötigt wird.

Fahren Sie fort, die PCR-Röhrchen mit einem ethanolresistenten Marker auf jedem Reaktionsröhrchen zu markieren. Fügen Sie zuerst die berechneten Mengen an sterilem Wasser hinzu, dann fügen Sie 10 x Puffer und 10 Millimolare DN NTPs hinzu. Für diese Reaktion führen wir eine Titration mit Magnesiumchlorid durch.

Da die Magnesiumkonzentration nicht konstant ist, wird Magnesiumchlorid einzeln zu den PCR-Röhrchen gegeben, und das Volumen wird mit sterilem Wasser auf 10 Mikroliter normalisiert, so dass 40 Mikroliter des endgültigen Mastermixes zu jedem PCR-Röhrchen hinzugefügt werden. Um die 50-Mikroliter-Reaktion und Magnesiumchlorid abzuschließen, fügen Sie das DNA-Template und die Primer hinzu. Geben Sie schließlich 0,5 bis 2,5 Einheiten DNA-Polymerase pro 50-Mikroliter-Reaktion in ein 1,8-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor, die sowohl die Kontrollen als auch den Pipettenübertragungsverlust berücksichtigt. Stellen Sie eine Mikropipette auf etwa die Hälfte des Gesamtvolumens der Lösung ein und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Für jede Testprobe wird der eloquente Mastermix in das PCR-Röhrchen gegeben.

Nun für die Negativkontrolle ohne Template-DNA, fügen Sie alle Reagenzien hinzu und verwenden Sie steriles Wasser, um das fehlende DNA-Volumen auszugleichen. Verwenden Sie dann für die Positivkontrolle einen Satz von Matrizen-DNA und Primern, die ein bekanntes Fragment unter den gleichen Bedingungen wie die experimentellen PCR-Proben amplifizieren. PCR-Thermocycler erhitzen und kühlen das Reaktionsgemisch schnell auf und ermöglichen so die hitzeinduzierte Denaturierung von Duplex, das Knien von DNAA-Primern an den Plus- und Minussträngen des DNA-Templates und die Dehnung des PCR-Produkts.

Die Zykluszeiten basieren auf der Größe des Templates und dem GC-Gehalt der DNA für die allgemeine Formel. Beginnen Sie mit einer anfänglichen Denaturierung der Schablone und starten Sie dann 25 bis 35 Runden eines dreistufigen Temperaturzyklusprogramms. Der erste Schritt dieser Zyklen ist die Denaturierung der DNA-Vorlage.

Dann programmieren Sie für das Optimum ein Knien der Primer etwa fünf Grad Celsius unter der scheinbaren Schmelztemperatur der Primer, gefolgt von dem Elongationsschritt, um die Polymerase zum DNA-Template zu bringen und das PCR-Produkt zu synthetisieren. Geben Sie nun die Anzahl der Zyklen ein. Nächstes Programm.

Ein erweiterter Elongationsschritt zur Fertigstellung der Synthese von Amplikons. Zum Schluss fügst du einen Abbruchschritt hinzu und kühlst die Mischung auf vier Grad Celsius ab. Wenn die Standard-PCR-Bedingungen nicht das gewünschte Amplikon liefern, ist eine PCR-Optimierung erforderlich, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Wenn die Reaktionen also beim ersten Mal nicht funktioniert haben, sollten Sie versuchen, eine Fehlerbehebung für die Reaktion durchzuführen. Und so wollen Sie zuerst sicherstellen, dass das Problem kein menschliches Versagen war. Und das kann passieren, wenn Sie einen Pipettierfehler haben oder wenn Sie, wenn Sie vergessen haben, dem Test ein Reagenz hinzuzufügen, eines der Reagenzgläser verwenden.

Als nächstes können Sie versuchen, einige der Strenge der Bedingung zu ändern, so dass Sie die Einrichtung des Thermocyclers ändern können, oder Sie können die Magnesiumkonzentration ändern, ist eine weitere alternative Methode. Sie können auch versuchen, dem Reagenz einige Additive hinzuzufügen, um die Probleme zu beheben. Alternativ können Sie die Heißstart-PCR als eine vielseitige Modifikation betrachten, bei der die anfängliche Denaturierungszeit drastisch verlängert wird.

Die AROS-Gelelektrophorese wird dann verwendet, um die PCR des GAL 3-Gens aus der genomischen DNA von S seia aufzulösen, um die optimale Magnesiumionenkonzentration für diesen Satz von Reagenzien zu bestimmen. 2098 Basenpaare erscheinen beginnend bei einer Magnesiumkonzentration von 2,5 Millimolar mit einer optimalen Konzentration von vier Millimolaren auf verschiedenen DNA-Template-Amplifikationen des gewünschten PCR-Produkts, da eine diskrete Bande zwei erfordert millimolares Magnesium. Die Reduzierung der Stringenz der Reaktion auf effektiv suboptimale Amplifikationsbedingungen führt zu einem Abstrich unspezifischer Produkte.

Darüber hinaus ist bei der Gesamtstringenz der Reaktionsreduktion eine geringere Menge an Magnesiumionen erforderlich, um ein Amplikon-Symbol zu bilden. Auf diese Weise kann die Optimierung der PCR unter Berücksichtigung der Variablen das diskrete gewünschte Produkt erzeugen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Polymerase-Kettenreaktion einrichten und vorbereiten.

Ziel ist es, die Variablen jeder PCR zu verstehen und zu verstehen, wie sie manipuliert werden können, um das gewünschte Amplikon zu erzeugen.