Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Sequenzen von mRNA-Transkripten vom Drei-Primzahlen-Ende bis zu Regionen innerhalb der proteinkodierenden Region zu bestimmen, indem transkriptspezifische verschachtelte Primer in zwei aufeinanderfolgenden PCRs verwendet und die gereinigten PCR-Produkte sequenziert werden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im genetischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung des Polyadenylierungssignals, des Stoppcodons und der Sequenz der untranslatierten Region des Transkripts mit drei Primzahlen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf jedes Transkript angewendet werden kann, wenn die Sequenz des kleinen Bereichs des offenen Leserahmens Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Krebsdiagnose, da sie tumorspezifische Fusionsgene und Spleißvarianten nachweisen kann.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir neuartige Transkripte mit zuvor nicht charakterisierten, drei-primierten untranslatierten Regionen identifizierten. Um das Protokoll zu starten, tauen Sie das Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-Zellgemisch auf Eis auf. Nach dem Auftauen 100 Mikroliter Chloroform in das Mikrozentrifugenröhrchen in einer PCR-Haube geben.

Wirbeln Sie die Probe 10 bis 15 Sekunden lang, bis die Mischung rosa und undurchsichtig ist. Inkubieren Sie die Probe anschließend 15 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20.800 g und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie vorsichtig die obere farblose wässrige Phase und geben Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fahren Sie dann mit der Fällung fort und fügen Sie der Probe ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu. Fügen Sie der Probe einen Mikroliter Co-Präzipitant hinzu, um als Träger für die RNA zu fungieren und die RNA in den nachfolgenden Schritten sichtbar zu machen.

Inkubieren Sie die Proben mindestens vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Probe in eine gekühlte Zentrifuge umgefüllt und 35 Minuten lang bei 20.800 g und vier Grad Celsius geschleudert. Nach dem Schleudern erscheint die RNA als blauer Fleck auf dem Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie vorsichtig das Isopropanol aus der Probe. Fügen Sie 500 Mikroliter 80%iges Ethanol hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es drei Sekunden lang kurz vortexen. Zentrifugieren Sie die Probe erneut.

Entfernen Sie das gesamte Ethanol aus der Probe und lassen Sie die Probe etwa 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Sobald die Probe trocken ist, resuspendieren Sie sie in 35 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Legen Sie dann die Probe auf einen Heizblock.

Stellen Sie die Temperatur fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius ein, um sicherzustellen, dass die RNA vollständig in Lösung ist. Nach dem Erhitzen das Rohr sofort auf Eis legen. Für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern geben Sie vier Mikrogramm Gesamt-RNA mit zugesetztem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 22 Mikrolitern in ein neues Röhrchen.

Geben Sie zwei Mikroliter des Oligo dT 25 Primers aus der 10 mikromolaren Primerlösung hinzu. Fügen Sie aus dem reversen Transkriptionskit zwei Mikroliter des RNase-Inhibitors, acht Mikroliter des 5x Reaktionspuffers, vier Mikroliter 10 millimolare dNTPs und zwei Mikroliter der reversen Transkriptase hinzu. Richten Sie eine Reaktion ohne reverse Transkriptase ein, die als Negativkontrolle fungiert.

Inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius. Übertragen Sie das Röhrchen nach der Inkubation direkt auf Eis, bevor Sie es zum Heizblock transportieren. Erhitzen Sie dann die Röhre fünf Minuten lang bei 75 Grad Celsius.

Nachdem Sie es auf 75 Grad Celsius erhitzt haben, legen Sie das Rohr auf Eis. Übertragen Sie zwei Mikroliter der cDNA in ein frisches 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen. Geben Sie einen Mikroliter des Forward Primers und einen Mikroliter des Reverse Primers aus einer 10 millimolaren Primerlösung hinzu.

Stellen Sie bis zu 12,5 Mikroliter her, indem Sie 8,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen und 12,5 Mikroliter der 2x PCR zum Gel-Mastermix hinzufügen. Geben Sie dann die auf dem Bildschirm aufgelisteten Bedingungen für den PCR-Temperaturzyklus ein und führen Sie die PCR aus. Bereiten Sie nach der PCR ein 1%Agarose-Gel vor, das mit Ethidiumbromid gefärbt ist.

Ein Gramm Agarose wird in 100 Millilitern Triacetat oder TAE-Puffer in einem 250-Milliliter-Kolben gelöst. Kochen Sie den Inhalt in der Mikrowelle. Lassen Sie das Gel eine Minute lang abkühlen und geben Sie 7,5 Mikroliter Ethidiumbromidlösung in einen Abzug.

Gut mischen, indem man den Kolben schwenkt. Gießen Sie den Inhalt in ein horizontales Gelgerät und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur im Abzug mindestens 30 Minuten lang erstarren. Bedecken Sie das Gel mit 1x TAE-Puffer und laden Sie 10 Mikroliter des PCR-Produkts zusammen mit drei bis fünf Mikrolitern der DNA-Molekulargewichtsleiter auf das Agarose-Gel.

Lassen Sie das Gel 10 Minuten lang bei 175 Volt laufen. Für die erste PCR wird ein Mikroliter cDNA in ein PCR-Röhrchen überführt und fünf Mikroliter 10x Pfu-Reaktionspuffer hinzugefügt. Fügen Sie einen Mikroliter des ersten nested forward Primers, einen Mikroliter des T7 Oligo dT 25 Primers und einen Mikroliter dNTPs aus einer 10 millimolaren Lösung hinzu.

Erzeugen Sie bis zu 49 Mikroliter Gesamtvolumen, indem Sie 40 Mikroliter Wasser hinzufügen. Fügen Sie einen Mikroliter Pfu-DNA-Polymerase hinzu und mischen Sie gut. Führen Sie dann die PCR aus.

Bereiten Sie als Nächstes die zweite PCR vor. Übertragen Sie zwei Mikroliter der Produkte aus der ersten PCR in ein neues PCR-Röhrchen und mischen Sie es mit fünf Mikrolitern 10x Pfu ultra zwei Reaktionspuffer. Fügen Sie einen Mikroliter des zweiten verschachtelten PCR-Primers, einen Mikroliter des T7-Primers und einen Mikroliter dNTPs hinzu.

Erhöhen Sie das Gesamtreaktionsvolumen auf 49 Mikroliter, indem Sie 39 Mikroliter Wasser hinzufügen und einen Mikroliter Pfu-DNA-Polymerase hinzufügen. Führen Sie die PCR mit demselben PCR-Profil aus, das auch bei der ersten PCR-Einrichtung eingerichtet wurde. Alternativ kann anstelle der Pfu-DNA-Polymerase eine chimäre DNA-Polymerase in den beiden verschiedenen PCRs verwendet werden.

Nehmen Sie fünf bis zehn Mikroliter des zweiten PCR-Produkts und lassen Sie es auf einem Agarose-Gel laufen. Visualisieren Sie abschließend das Ergebnis auf einem Imager. Dieses Agarose-Gel zeigt zwei unterschiedliche PCR-Produkte, die denselben Forward-Primer, aber unterschiedliche Reverse-Primer verwenden, und ein unterschiedliches PCR-Produkt, das einen unterschiedlichen Forward- und Reverse-Primer aufweist.

Die idealen Primer für die PCR-basierte Reaktion sind solche, die ein eindeutiges PCR-Produkt ergeben. Produkte aus der zweiten PCR-Reaktion mit der Pfu-DNA-Polymerase und der chimären DNA-Polymerase produzierten die gleichen PCR-Produkte, obwohl sie unterschiedliche PCR-Zyklusbedingungen für das RACE mit drei Primzahlen aufwiesen. Die Negativkontrollen der reversen Transkriptase zeigten keine genomische Kontamination der RNA, die sowohl bei der cDNA-Synthese als auch bei nachfolgenden nachgeschalteten Reaktionen verwendet wurde.

Gelgereinigte PCR-Produkte wurden zur Sequenzierung geschickt. Eine repräsentative Sanger-Sequenz aus einem Sequenzchromatogramm identifizierte die Lage des Stoppcodons, des mutmaßlichen Polyadenylierungssignals und der Stelle sowie des Poly-A-Schwanzes im Drei-Prime-RACE-Produkt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, immer Schutzausrüstung und Handschuhe zu tragen.

Verwenden Sie außerdem sterile DNase und RNase für Ihre Reagenzienröhrchen und andere Einwegartikel. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol und Chloroform äußerst gefährlich sein kann. Und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die Verwendung der Reagenzien in einer Haube und die Entsorgung von Material in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.