Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, ein präklinisches Modell zur Bildgebung von Hirntumoren mittels Fluoreszenz-Molekulartomographie (FMT) zu etablieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Hirntumorbiologie, Krebsforschung und Wirkstoffforschung über die Aggressivität, Heterogenität und Ansprechen auf die Behandlung von Tumoren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Tumoren in vivo vor, während oder nach der Behandlung nicht-invasiv, nahtfrei und quantitativ überwacht werden können.

Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Modelle auf andere Arten von Xenotransplantatmodellen anzuwenden, die in verschiedene Organe des Tieres implantiert werden. Beginnen Sie damit, eine mal 10 bis die sechste Glioblastomzelle in fünf Millilitern Medium in eine 10-Zentimeter-Schale zu säen, um sie 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator zu inkubieren. Am nächsten Morgen transduzieren Sie die Zellen mit Lentiviren, exprimieren ein geeignetes fluoreszierendes Protein von Interesse bei einer Infektionsmehrheit von fünf und bringen die Zellen in den Inkubator zurück.

Nach 24 Stunden wird der Überstand durch fünf Milliliter frisches Medium ersetzt und die Kultur weitere 48 Stunden inkubiert. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch drei bis fünf Milliliter Tripson für 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von vorsichtigem Pipettieren, um die abgelösten Zellen vollständig zu dissoziieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern Sortierlösung.

Teilen Sie die Zellen in die entsprechende Anzahl von Faxschläuchen auf und färben Sie die Zellen mit DAPI mit, um den Ausschluss toter Zellen zu verhindern. Laden Sie dann die Röhrchen auf das Durchflusszytometer und sortieren Sie die lebenden Zellen entsprechend ihrer Fluoreszenzkonstruktexpression in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit frischer Sortierlösung. Nach der Zentrifugation werden die positiv und DAPI-negativen Zellen in fünf Millilitern Kulturmedium wieder suspendiert und in eine neue 10-Zentimeter-Schale für ihre Kultur bei 37 Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden gesetzt.

Teilen Sie am Ende der Inkubation die Zellen für die Aussaat in mehrere Schalen auf, um nachfolgende In-vivo-Experimente durchzuführen. Am Tag der Injektion dissoziieren Sie die fluoreszierenden positiven Gliomazellen in eine Einzelzellsuspension und suspendieren sie in einem Verhältnis von 0,5 oder einmalig 10 bis 10 Zellen pro zwei bis fünf Mikroliter PBS pro Injektion pro Tierkonzentration in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, tragen Sie Salbe auf die Augen der immungeschwächten Athymic Nude-Empfängermaus auf und laden Sie eine Fünf-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit einer stumpfen Nadel mit den Zellen für die Injektion.

Montieren Sie die Spritze in einen Sondenhalter und platzieren Sie die Maus in einem kleinen, tierischen stereotaktischen Rahmen. Fixieren Sie den Kopf mit den Ohrbügeln und dem Schneidezahnadapter und desinfizieren Sie den Kopf mit 70%iger Ethanol- und Batadinlösung. Machen Sie mit einem kleinen Skalpell einen mittleren Schnitt und trennen Sie Haut und Bindegewebe.

Platzieren Sie die Hamilton-Spritze mit dem Mikromanipulator auf dem Bregmapunkt und bewegen Sie den Sondenhalter einen Millimeter anteroposterior und zwei Millimeter lateral vom Bregmapunkt entfernt. Nachdem Sie die Position mit einem Bleistift markiert haben, bohren Sie mit einem mikromotorischen Handbohrer vorsichtig ein Loch in den Schädel und üben Sie einen leichten Druck nach unten aus, bis die Blutgefäße sichtbar werden. Führen Sie die Nadel drei Millimeter unterhalb der Pialoberfläche in das Gratloch ein und injizieren Sie die Zellen mit einem Durchfluss von einem Mikroliter pro Minute nach rechts.

Wenn das gesamte experimentelle Zellvolumen injiziert wurde, entfernen Sie die Nadel allmählich mit einer Aufstiegsgeschwindigkeit von einem Millimeter pro Minute und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol. Verschließen Sie dann die Hautwunde nach Standardprotokollen und überwachen Sie das Tier auf einem Wärmekissen, bis es sich vollständig erholt hat. Um die injizierten Zellen abzubilden, legen Sie das anästhesierte Empfängertier in die Bildgebungskassette eines Fluoreszenz-Molekulartomographie-Imagers, wobei der Kopfadapter zuerst in Bauchlage und der Kopf in der Mitte der Kassette liegt.

Ziehen Sie bei geschlossener Kassette die Einstellknöpfe auf 17 Millimeter fest. Wenn das Tier sicher ist, setzen Sie die Kassette in die interne Dockingstation ein und öffnen Sie den Imager und die Analysesoftware. Wählen Sie im Registerkartenfenster "Experimental" die entsprechende Datenbank und Studiengruppe aus und öffnen Sie das Registerkartenfenster "Scan".

Klicken Sie auf Motiv auswählen, um das Motiv für das Bild auszuwählen, und wählen Sie den Laserkanal im Laserkanalfenster aus. Klicken Sie auf Aufnehmen, um ein Bild aufzunehmen, und klicken Sie auf das Scanfeld im aufgenommenen Bild, und ziehen Sie es, um die Quellspeicherorte zu identifizieren. Aktivieren Sie die Option Zur Rekonstruktion hinzufügen und klicken Sie im Fenster der Registerkarte Scan auf Scannen.

Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, nehmen Sie die Bildkassette aus der Dockingstation und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück, der bis zur vollständigen Genesung überwacht wird. Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie in der Imager- und Analyzer-Software das Fenster der Registerkarte "Analyse" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Pluszeichen" im Datensatzauswahlfenster, um den Datensatz und das Subjekt für die Analyse zu laden. Verwenden Sie dann das Ellipsoid-Symbol, um den gewünschten Bereich auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schwellenwertspalte, um den Schwellenwert im Bereich der Statistikdaten auf Null einzustellen.

Glioblastomzellen, die mit fluoreszierenden Proteinen im nahen Infrarot markiert wurden, zeigen, wie gerade gezeigt, ausgeprägte Fluoreszenzprofile, die durch Fluoreszenz-Molekulartomographie sogar bis zu fünf Tage nach der Injektion unterschieden werden können. Darüber hinaus erleichtert das Fehlen eines Hintergrundsignals zwischen den Konstrukten die duale in vivo-Bildgebung von Krebszellpopulationen, die von Interesse sind. In diesem Experiment wurden fluoreszierende Konstrukt-markierte Glioblastomkugeln, die mit Lentivirus-kodierendem SHRNA kodiert und auf das mit der Todesdomäne assoziierte Protein abzielen, in immundefiziente Athymic Nude-Mäuse injiziert, wie gerade gezeigt wurde.

Die quantitative Vorreaktion der reversen Transkription bestätigte die Wirksamkeit des SHRNA-Targetings in beiden Krebszelllinien, und die molekulare Fluoreszenztomographie zeigte eine Abnahme des Fluoreszenzsignals bei den Mäusen, die mit SHRNA-Glioblastomkugeln transplantiert wurden, im Vergleich zu Tieren, denen SH-Kontrollzellen implantiert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie präklinische Daten für die Hirntumorforschung mit einem molekularen Fluoreszenztomographie-System generiert werden können.