Name: Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenz-Molekulartomographie für die nicht-invasive Bildgebung von Glioblastom-Xenotransplantaten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Überwachung von Tumordynamiken in vivo.

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Wir danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center für GBM-PDX neurosphären. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Niederlage GBM Forschung Collaborative, eine Tochtergesellschaft von National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez wurde durch eine Auszeichnung von American Brain Tumor Association (ABTA) unterstützt; Ciro Zanca wurde teilweise durch eine amerikanisch-italienischen Cancer Foundation Postdoc Fellowship unterstützt. Frank Furnari erhält Gehalt und zusätzliche Unterstützung von Ludwig Institute for Cancer Research.

Experimentelle forschungstiere und Krankheitserreger, wie z. B. Lentivirus, die Krebszellen transduzieren benötigen Zustimmung vom institutionellen Tierbetreuung Programm und der institutionellen Biosafety-Ausschuss. Dieses Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Pflege der Tiere von der University of California San Diego (UCSD).
1. Kennzeichnung von Glioblastom-Zellen mit FP635 oder FP720 Konstrukt
<ol><li>Zu produzieren Sie und zu reinigen Sie Lentivirus gemäß dem Protokoll von Tiscornia Et Al. beschrieben 12
</li>
	<li>Kultur ca. 2,0 x 106 Zellen aus einer menschlichen Gliom-Zelllinie mit DMEM plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15-cm-Schüssel; oder Kultur 2.0 x 106 menschlichen Glioblastom Patienten abgeleitet (GBM-PDX) Kugeln mit DMEM/F12 1:1 Medium mit B27 ergänzen plus human rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng/mL) und FGF (10 ng/mL) in ein Auffanggefäß T75.</li>
	<li>Alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 100 % relativer Luftfeuchte zu erhalten.</li>
	<li>Die Zellen zu trennen.<ol>
<li>Für die Gliom-Zellen: den überstand von den Platten zu entfernen und das Gliom-Zellen 3-5 mL Trypsin 1 X hinzufügen.</li>
		<li>Für die GBM Sphären: die Zellen zu sammeln, indem Sie die Zellen in ein 15-mL-Röhrchen pipettieren.<ol>
<li>Spin-down der GBM-Kugeln 200 X g für 5 min mit einer Tischplatte Zentrifuge bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Entfernen des Überstands und 3-5 mL Zelle Ablösung Lösung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inkubieren Sie alle Zellen bei 37 ° C für 10-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorgfältig trennen die Zellen durch pipettieren nach oben und unten mehrmals (sicherzustellen, dass die Kugeln und Gliom Zellen abgeschlossen sind getrennt) und Spin-down bei 200 X g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL Medium durch nach oben und unten mehrmals pipettieren. Bestimmen Sie die Zellviabilität Trypan blau ausgeschlossen.</li>
	<li>Platte 1,0 x 106 der Zielzellen in einem 10-cm-Schüssel mit 5 mL Medium durch pipettieren.</li>
	<li>Transduzieren Sie Zellen mit Lentivirus auszudrücken fluoreszierende Proteine bei der Multiplizität der Infektion (MOI) 5 wie von Tiscornia Et Al. beschrieben wird 12 und bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie nach 24 h das Medium aus den transduced Zellen, 5 mL frisches Medium hinzufügen und weitere 48 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Distanzieren Sie die infizierten Zellen in eine einzelne Zelle Suspension wie beschrieben in Schritten 1,4-1,6. Spin-down der Zellen bei 200 X g für 5 min und Aufschwemmen in 500 µL Lösung zu sortieren (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % FBS).</li>
	<li>Pipette die Zellsuspension in FACS Röhren. Co färben Sie die Zellen mit 1 µL/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Dihydrochloride, abgestorbenen Zellen auszuschließen. Negative Kontrollen sind erforderlich, um den Flow Cytometer Toren einzurichten (nicht ausgestrahlt und nicht ausgestrahlt Zellen / DAPI gefärbt).</li>
	<li>Sortieren Sie die Leuchtstoff-positiven/DAPI-negativen Zellen in Sortierung Lösung, wie von Basu Et Al. beschrieben 13, und sammeln Sie die sortierten Zellen in ein 15 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Spin-down der sortierten Zellen bei 200 X g für 5 min, den überstand zu entfernen und in 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln. Samen der sortierten Zellen in einer 10 cm Petrischale durch pipettieren. Inkubation bei 37 ° C für mindestens 48-72 h.</li>
	<li>Erweitern der sortierten Zellen durch Wehre die Zellen folgende Schritte 1,4-1,6 und Beschichtung in mehrere Gerichte für in Vivo Experimente. Hinweis: Näheres zur Zelle Sortierung, Aufbereitung und Reinigung siehe Basu Et al. 13
</li>
</ol>(2) intrakranielle Injektion von iRFP getaggt Glioblastom-Zellen in immungeschwächte Mäuse
Hinweis: Vor Beginn der Operation, stellen Sie sicher, dass die OP und Werkzeuge für die Prozedur sauber sind. Verwenden Sie immungeschwächte Athymic nackt (Foxn1Nu) männliche oder weibliche Mäuse, zwischen 4-5 Wochen alt und 17-19 g intrakraniellen Injektionen. Tiere sollten für mindestens 3 Tage nach Ankunft und vor der Operation untergebracht werden.
<ol><li>Handy-Vorbereitung<ol>
<li>Ernte und fluoreszierende positiv-Gliom Zellen in eine einzelne Zelle Suspension (Schritte 1,4-1,6) zu distanzieren und Aufschwemmen 0,5 oder 1,0 x 106 Zellen in 2 bis 5 µL PBS pro Injektion pro Tier. Pipette die Zellsuspension in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anästhesie-Vorbereitung und Verwaltung<ol>
<li>Bereiten Sie 200 µL Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) pro 20 Gramm Körpergewicht Maus vor. Wiegen Sie der Tiere und berechnen Sie die entsprechende Dosis der Narkose zu.</li>
		<li>Bieten Sie eine intraperitoneale Injektion von Anästhesie und gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, um Austrocknung zu verhindern. Weitere Details zu diesem Schritt finden Sie unter Kathleen Et al. Legen Sie 14 das Tier auf einer vorgewärmten Wasser Wärmeleitpad bei 37 ° C.</li>
		<li>Überprüfen Sie, dass die Tiere betäubt sind durch die Überwachung der Zehe Prise Antwort (Pedal Reflex), in der Regel innerhalb von 5-10 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intrakranielle Injektion<ol>
<li>Laden 5 µL Hamilton-Spritze (stumpfe Spitze Nadel) mit Zellsuspension und Berg in Sondenhalter.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem kleinen Tier Stereotaktische Rahmen und fixieren Sie den Kopf mit der Ohr-Bars und den Schneidezahn-Adapter nach den beschriebenen Details von Cetin Et al. 15
</li>
		<li>Desinfizieren Sie den Kopf mit 70 % Ethanol und Betadine Lösung. Stellen Sie sicher, dass der Operationsstelle ist komplett steril. Führen Sie einen mittleren Schnitt mit einem kleinen Skalpell und trennen Sie die Haut und Bindegewebe.</li>
		<li>Ort der Hamilton-Spritze am Bregma Punkt mit dem Mikromanipulator.</li>
		<li>Bewegen Sie die Sonde Halter 1,0 mm Anteroposterior und 2.0 mm seitliche vom Bregma Punkt. Markieren Sie diese Position mit einem Bleistift.</li>
		<li>Machen Sie an dieser Stelle aufmerksam ein Loch in den Schädel mit einem Mikromotor handgeführte Bohrer durch leichten Druck nach unten bis die Blutgefäße sichtbar werden. Stören Sie nicht die Arachnoidea Mater und Gehirn Parenchym.</li>
		<li>Führen Sie die Nadel in die Bohrlochs und 3,0 mm unterhalb der pial Oberfläche voraus.</li>
		<li>Richten Sie das Volumen (2 bis 5 µL) und die Durchflussmenge (1 µL/min) der Injektion mittels eines motorisierten stereotaktischen Injektors oder manuell durchführen der Injektion.</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam durch aufsteigende 1,0 mm alle 1 min und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol.</li>
		<li>In der Nähe die Haut Wunde mit chirurgischen Klammern oder durch chirurgisches Nahtmaterial (oft als Stiche) und siehe Kathleen Et al. 14 für weitere Informationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tierische Erholung<ol>
<li>Übertragen Sie das Tier auf ein Wärmeleitpad Wasser (37 ° C) und überwachen Sie die Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz, bis zur endgültigen Genesung. Verwalten Sie Analgesie pro standard-Protokolle. Hinweis: Weitere Informationen über die Stereotaktische Verfahren, Chirurgie und Koordinaten, siehe andere Berichte5,14,15.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) FMT Imaging
Hinweis: Nach der experimentellen Ziel überwacht die iRFP getaggt Glioblastom, die Zellen werden können in Vivo vor, während oder nach der Behandlung. Für imaging-Zweck, Tiere mit einer Isofluran Induktion Kammer zu betäuben, halten in einer bildgebenden Kassette beim Scannen und Bild in die Docking-Station von der FMT-Imager.
<ol><li>Entfernen Sie das Tier aus dem Käfig und stellen in der Isofluran-Induktion-Kammer. Schließen Sie die Kammer und schalten Sie Sauerstoffzufuhr und Verdampfer auf ca. 3-5 %.</li>
	<li>Überwachen Sie das Tier bis es vollständig betäubt ist, in der Regel innerhalb von 1-2 min. unbewussten Tiere sollte nicht reagieren auf äußere Reize.</li>
	<li>Entfernen Sie das narkotisierten Tier aus der Kammer und setzen Sie das Tier in der bildgebenden Kassette indem man den Kopf Adapter zuerst, indem man das Tier nach unten gefolgt. Stellen Sie sicher, dass der Kopf in die Mitte der Kassette befindet.</li>
	<li>Legen Sie die obere Platte der Kassette auf und ziehen Sie die Einstellknöpfen bis 17 mm.</li>
	<li>Einmal, dass das Tier ist sicher in der bildgebenden Kassette, fahren Sie mit Bildgebung durch Einsetzen der Kassette in die interne docking-Station von der FMT-Imager, wo die Isofluran gepumpt wird, um das Tier betäubt zu halten.</li>
	<li>Führen Sie die Imager und Analyzer Software durch Doppelklick auf das Symbol Software.</li>
	<li>Wählen Sie im Fenster "experimentelle Registerkarte""die"Datenbank"und"Study Group".</li>
	<li>Gehen Sie zum Fenster "Registerkarte" Scannen "" und wählen Sie den Betreff Bild durch Klicken auf "Thema auswählen". Außerdem wählen Sie den Laser-Kanal im Bereich "Laser-Kanal". Für die FP635-markierte Zellen wählen Sie "Laser Kanal 635 nm" und für FP720-markierte Zellen, "laser-Kanal 680 nm".</li>
	<li>Erwerben Sie ein Bild, indem Sie auf die Option "Capture" im Fenster "Registerkarte" Scannen "". Passen Sie dann den Scan-Bereich durch Klicken und ziehen das Scan-Feld in das aufgenommene Bild auf eine bestimmte Anzahl von Quellspeicherorten, in der Regel innerhalb von 20-25 Quellen für die ipsilateralen Seite.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Option "Zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen" und getroffen Sie "Scan" im Fenster "Registerkarte" Scannen "".</li>
	<li>Warten Sie, bis der Scan abgeschlossen ist und entfernen Sie dann die bildgebende Kassette aus der Docking-Station.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere Platte der Kassette und legen Sie das Tier zurück in den Käfig.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.12 für den Rest der Tiere.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Wählen Sie aus dem Imager und Analyzer Software das "Registerkarte Analyse"-Fenster.</li>
	<li>Laden Sie das Dataset und das Thema, indem Sie auf die Taste "+" im Bereich "Dataset Auswahl" des Fensters "Registerkarte Analyse" zu analysieren.</li>
	<li>Sobald das Bild im Fenster "Registerkarte Analyse" geladen wurde, Ausführen der Region of Interest (ROI) Analyse durch das Ellipsoid-Symbol in der oberen linken Ecke des Fensters "Registerkarte Analyse" auswählen.</li>
	<li>Passen Sie den Schwellenwert auf NULL mit der rechten Maustaste die "Schwelle" Spalte im Fenster "Registerkarte" Analysis "" im Bereich "Statistik".</li>
	<li>Der Gesamtwert im Bereich "Statistik" stellt das Signal aus den Leuchtstoff-Tags Glioblastom-Zellen in das Gehirn der Maus implantiert.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 für den Rest der Tiere. Laden oder ein neues Thema zu entfernen, indem Sie auf das "+" oder "−"-Taste, bzw. in "Dataset" Auswahljury des Fensters "Registerkarte Analyse". Hinweis: Weitere Informationen über die FMT Bildgebung und Betrieb der Software finden Sie unter20.
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Tumor Xenografts haben ausgiebig in der Krebsforschung verwendet worden und eine Reihe von etablierten bildgebenden Verfahren entwickelt: BLI; Magnetresonanztomographie (MRT); Positronen-Emissions-Tomographie (PET), berechnet Computertomographie (CT); FMT. Jeder dieser Ansätze kommt mit vor- und Nachteile, aber letztlich ergänzen sich mit der Art der bereitgestellten Informationen. Eines der am häufigsten verwendeten in-Vivo imaging-Technologie ist BLI5,6</sup...

Krebs ist eine der führenden Ursachen für krankheitsbedingte Todesfälle beim Menschen in der industrialisierten Welt. Mit einer extrem hohen Todesopfer sind neue Behandlungen dringend erforderlich. Glioblastoma Multiforme (GBM) ist eine extrem tödliche Art von Hirntumoren, bestehend aus heterogenen Bevölkerung von Gehirn, Stromale und immun Tumorzellen. Laut der zentralen Gehirn Tumor Registrierung der USA ist die Inzidenz des primären malignen und nicht-malignen Hirntumoren etwa 22 Fälle pro 100.000. Rund 11.000 Neuerkrankungen werden voraussichtlich in den USA im Jahr 20171diagnostiziert werden.
Präklinische Studien untersuchen die Wahrscheinlichkeit, dass ein Medikament, Verfahren oder Behandlung vor der Prüfung beim Menschen wirksam sein. Einer der frühesten Labor Schritte in präklinischen Studien ist mögliche Molekulare Targets für medikamentöse Behandlung identifizieren, mithilfe von Krebszellen, die in einen Wirtsorganismus, definiert als menschliche Xenograft Modelle implantiert. In diesem Zusammenhang haben intrakraniellen Gehirn Tumor Xenograft Modelle mit Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs) weit verbreitet zu studieren Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion, und vor kurzem für die Entwicklung von Biomarkern, Drogen Screening und personalisierte Medizin2,3,4.
Die meisten erschwinglich und nicht-invasive in Vivo bildgebende Verfahren zur Überwachung der intrakraniellen Xenotransplantate gehört Biolumineszenz imaging (BLI)5,6,7,8. Jedoch enthalten einige BLI Einschränkungen Substrat Verwaltung und Verfügbarkeit, Enzymstabilität, abschrecken und Streuung während imaging Erwerb9. Hier berichten wir über die Infrarot-FMT als Alternative bildgebendes Verfahren zur Überwachung der präklinischen Glioblastom Modelle. In dieser Methode, Signalerfassung und Quantifizierung der intracranially implantierten PDXs, mit dem Ausdruck ein Nahinfrarot-fluoreszierende Protein iRFP72010,11 (fortan als FP720 bezeichnet) oder turboFP635 (fortan als FP635 bezeichnet), wird mit einer FMT imaging-System durchgeführt. Mit der FMT-Technologie überwacht der orthotopen können Tumoren sein in Vivo vor, während oder nach der Behandlung in einer nicht-invasiven, frei von Substrat und quantitative Weise für präklinische Beobachtungen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Hoher Glukose&nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Zelltechnologien</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>humane rekombinante EGF&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>humane rekombinante FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>Kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>Salbe</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Resorbierbares Nahtmaterial</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>5 ul Spritze</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>Katalognummer wie verkauft von Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>Maus stereotaktischer Rahmen&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter stereotaktischer Injektor</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Mikromotorischer Handbohrer</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Wärmekissen&nbsp;</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenztomographie-System&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant Imaging-Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td></td>7005319</tr><tr><td>Ultra-Zentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Schar</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur 100 mm</td><td>Schalen Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur 150 mm Schalen</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen, Polypropylen, dünnwandig, 5,0 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen, dünnwandig, Polypropylen, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Athymic Nacktmäuse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Dehnungs-Code&nbsp; 490 (homozygot)</td><td>Vorherige Genehmigung durch das Institutional Animal Care Program und das Institutional Biosafety Committee erforderlich. &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz molekulare computertomographie für die in-vivo bildgebung des glioblastoms xenotransplantate

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenität ist die Fähigkeit von Krebszellen, einen Tumor bilden Masse. Ein weit verbreiteter Ansatz um festzustellen, ob die Zellen tumorigenic sind wird durch Injektion immungeschwächte Mäuse subkutan mit Krebszellen und die Tumor-Masse zu messen, nachdem es sichtbar und fühlbar wird. Orthotopen Injektionen von Krebszellen sollen die Xenograft in der Mikroumgebung einzuführen, die am ehesten des Gewebes von Ursprung des Tumors untersucht. Gehirn-Krebs-Forschung erfordert intrakraniellen Krebszellen die Tumorbildung und Analyse in der einzigartigen Mikroumgebung des Gehirns zu ermöglichen. Die in-Vivo -Darstellung der intrakraniellen Xenotransplantate überwacht augenblicklich die Tumor-Masse des Orthotopically pfropfte Mäuse. Hier berichten wir über die Verwendung von Fluoreszenz Molekulare Computertomographie (FMT) von Gehirn Tumor Xenografts. Die Krebszellen sind zunächst mit ausgestrahlt, in der Nähe von Infrarot-fluoreszierende Proteine und dann in das Gehirn des immungeschwächte Mäuse injiziert. Die Tiere werden dann gescannt, um quantitative Informationen über die Tumor-Masse über einen längeren Zeitraum hinweg zu erhalten. Zelle vor Kennzeichnung ermöglicht eine kostengünstige, reproduzierbare und zuverlässige Quantifizierung der tumorlast innerhalb jeder Maus. Wir eliminiert die Notwendigkeit für die Injektion bildgebenden Substrate und reduziert den Stress auf die Tiere. Eine Einschränkung dieses Ansatzes wird durch die Unfähigkeit, sehr kleine Massen erkennen dargestellt; Allerdings hat es besseren Auflösung für größere Massen als andere Techniken. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit einer medikamentösen Behandlung oder genetische Veränderungen von Gliom-Zell-Linien und Patienten stammenden Proben zu bewerten.

Glioblastom-Zellen U87EGFRvIII (U87 Zellen zum Ausdruck über der EGF-Rezeptor-Variante III) wurden nach dem Schritt 1.2 kultiviert. Lentivirus wurde produziert und gemäß Schritt 1.1 gereinigt. Die virale Konzentration von p24 bestimmt war ELISA Analyse. Zellen wurden mit Lentivirus mit Infrarot-fluoreszierende Proteine nach Schritt 1,8 ausgestrahlt. Das Plasmid FP72010,11 -Codierung wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt v...

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, ein präklinisches Modell zur Bildgebung von Hirntumoren mittels Fluoreszenz-Molekulartomographie (FMT) zu etablieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Hirntumorbiologie, Krebsforschung und Wirkstoffforschung über die Aggressivität, Heterogenität und Ansprechen auf die Behandlung von Tumoren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Tumoren in vivo vor, während oder nach der Behandlung nicht-invasiv, nahtfrei und quantitativ überwacht werden können.Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Modelle auf andere Arten von Xenotransplantatmodellen anzuwenden, die in verschiedene Organe des Tieres implantiert werden. Beginnen Sie damit, eine mal 10 bis die sechste Glioblastomzelle in fünf Millilitern Medium in eine 10-Zentimeter-Schale zu säen, um sie 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator zu inkubieren. Am nächsten Morgen transduzieren Sie die Zellen mit Lentiviren, exprimieren ein geeignetes fluoreszierendes Protein von Interesse bei einer Infektionsmehrheit von fünf und bringen die Zellen in den Inkubator zurück.Nach 24 Stunden wird der Überstand durch fünf Milliliter frisches Medium ersetzt und die Kultur weitere 48 Stunden inkubiert. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch drei bis fünf Milliliter Tripson für 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von vorsichtigem Pipettieren, um die abgelösten Zellen vollständig zu dissoziieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern Sortierlösung.Teilen Sie die Zellen in die entsprechende Anzahl von Faxschläuchen auf und färben Sie die Zellen mit DAPI mit, um den Ausschluss toter Zellen zu verhindern. Laden Sie dann die Röhrchen auf das Durchflusszytometer und sortieren Sie die lebenden Zellen entsprechend ihrer Fluoreszenzkonstruktexpression in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit frischer Sortierlösung. Nach der Zentrifugation werden die positiv und DAPI-negativen Zellen in fünf Millilitern Kulturmedium wieder suspendiert und in eine neue 10-Zentimeter-Schale für ihre Kultur bei 37 Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden gesetzt.Teilen Sie am Ende der Inkubation die Zellen für die Aussaat in mehrere Schalen auf, um nachfolgende In-vivo-Experimente durchzuführen. Am Tag der Injektion dissoziieren Sie die fluoreszierenden positiven Gliomazellen in eine Einzelzellsuspension und suspendieren sie in einem Verhältnis von 0,5 oder einmalig 10 bis 10 Zellen pro zwei bis fünf Mikroliter PBS pro Injektion pro Tierkonzentration in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, tragen Sie Salbe auf die Augen der immungeschwächten Athymic Nude-Empfängermaus auf und laden Sie eine Fünf-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit einer stumpfen Nadel mit den Zellen für die Injektion.Montieren Sie die Spritze in einen Sondenhalter und platzieren Sie die Maus in einem kleinen, tierischen stereotaktischen Rahmen. Fixieren Sie den Kopf mit den Ohrbügeln und dem Schneidezahnadapter und desinfizieren Sie den Kopf mit 70%iger Ethanol- und Batadinlösung. Machen Sie mit einem kleinen Skalpell einen mittleren Schnitt und trennen Sie Haut und Bindegewebe.Platzieren Sie die Hamilton-Spritze mit dem Mikromanipulator auf dem Bregmapunkt und bewegen Sie den Sondenhalter einen Millimeter anteroposterior und zwei Millimeter lateral vom Bregmapunkt entfernt. Nachdem Sie die Position mit einem Bleistift markiert haben, bohren Sie mit einem mikromotorischen Handbohrer vorsichtig ein Loch in den Schädel und üben Sie einen leichten Druck nach unten aus, bis die Blutgefäße sichtbar werden. Führen Sie die Nadel drei Millimeter unterhalb der Pialoberfläche in das Gratloch ein und injizieren Sie die Zellen mit einem Durchfluss von einem Mikroliter pro Minute nach rechts.Wenn das gesamte experimentelle Zellvolumen injiziert wurde, entfernen Sie die Nadel allmählich mit einer Aufstiegsgeschwindigkeit von einem Millimeter pro Minute und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol. Verschließen Sie dann die Hautwunde nach Standardprotokollen und überwachen Sie das Tier auf einem Wärmekissen, bis es sich vollständig erholt hat. Um die injizierten Zellen abzubilden, legen Sie das anästhesierte Empfängertier in die Bildgebungskassette eines Fluoreszenz-Molekulartomographie-Imagers, wobei der Kopfadapter zuerst in Bauchlage und der Kopf in der Mitte der Kassette liegt.Ziehen Sie bei geschlossener Kassette die Einstellknöpfe auf 17 Millimeter fest. Wenn das Tier sicher ist, setzen Sie die Kassette in die interne Dockingstation ein und öffnen Sie den Imager und die Analysesoftware. Wählen Sie im Registerkartenfenster "Experimental" die entsprechende Datenbank und Studiengruppe aus und öffnen Sie das Registerkartenfenster "Scan".Klicken Sie auf Motiv auswählen, um das Motiv für das Bild auszuwählen, und wählen Sie den Laserkanal im Laserkanalfenster aus. Klicken Sie auf Aufnehmen, um ein Bild aufzunehmen, und klicken Sie auf das Scanfeld im aufgenommenen Bild, und ziehen Sie es, um die Quellspeicherorte zu identifizieren. Aktivieren Sie die Option Zur Rekonstruktion hinzufügen und klicken Sie im Fenster der Registerkarte Scan auf Scannen.Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, nehmen Sie die Bildkassette aus der Dockingstation und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück, der bis zur vollständigen Genesung überwacht wird. Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie in der Imager- und Analyzer-Software das Fenster der Registerkarte "Analyse" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Pluszeichen" im Datensatzauswahlfenster, um den Datensatz und das Subjekt für die Analyse zu laden. Verwenden Sie dann das Ellipsoid-Symbol, um den gewünschten Bereich auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schwellenwertspalte, um den Schwellenwert im Bereich der Statistikdaten auf Null einzustellen.Glioblastomzellen, die mit fluoreszierenden Proteinen im nahen Infrarot markiert wurden, zeigen, wie gerade gezeigt, ausgeprägte Fluoreszenzprofile, die durch Fluoreszenz-Molekulartomographie sogar bis zu fünf Tage nach der Injektion unterschieden werden können. Darüber hinaus erleichtert das Fehlen eines Hintergrundsignals zwischen den Konstrukten die duale in vivo-Bildgebung von Krebszellpopulationen, die von Interesse sind. In diesem Experiment wurden fluoreszierende Konstrukt-markierte Glioblastomkugeln, die mit Lentivirus-kodierendem SHRNA kodiert und auf das mit der Todesdomäne assoziierte Protein abzielen, in immundefiziente Athymic Nude-Mäuse injiziert, wie gerade gezeigt wurde.Die quantitative Vorreaktion der reversen Transkription bestätigte die Wirksamkeit des SHRNA-Targetings in beiden Krebszelllinien, und die molekulare Fluoreszenztomographie zeigte eine Abnahme des Fluoreszenzsignals bei den Mäusen, die mit SHRNA-Glioblastomkugeln transplantiert wurden, im Vergleich zu Tieren, denen SH-Kontrollzellen implantiert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie präklinische Daten für die Hirntumorforschung mit einem molekularen Fluoreszenztomographie-System generiert werden können.

fluorescence-molecular-tomography-for-vivo-imaging-glioblastoma

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Intrakranielle Implantation von GL261-Zellen in C57BL / 6 Mäusen produziert maligne Gliome, dass viele Merkmale der menschlichen Glioblastoma multiforme zu rekapitulieren. Wir verwendeten GL261-Zellen stabil exprimiert Luziferase, damit wir...

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für...

Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die genetische Veränderung von Gliomzellen, um infrarotes fluoreszierendes Protein oder iRFP zu exprimieren. Diese fluoreszenzmarkierten Gliomzellen sind für die Bildgebung von tiefem Gewebe nützlich, um die Entwicklung von Hirntumoren zu verstehen.

Fluoreszenzmarkierung von Gliomzellen: Eine lentivirale vektorbasierte Transfektionsmethode zur Gewinnung von Gliomzellen, die fluoreszierendes Protein für die Tiefenbildgebung exprimieren

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Molekulartomographie oder FMT für die in vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten in Mausmodellen. Die Technik ist nützlich, um die Wirkung von Anti-Tumor-Therapeutika auf molekularer Ebene aufzuklären.

Fluoreszenz-Molekulartomographie: Ein bildgebendes Verfahren für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten im Mausmodell

Quelle: Clark, A.J., et al. Biolumineszenz-Bildgebung eines immunkompetenten Tiermodells für Glioblastome. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfolgung des Fortschreitens des Glioblastoms in einem immunkompetenten Mausmodell, wobei Luciferase-exprimierende Tumorzellen und Luciferin zur nicht-invasiven Quantifizierung des Tumorwachstums verwendet werden.

Biolumineszenz-Bildgebung eines immunkompetenten Mausmodells für Glioblastom

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Erfahren Sie die Fluoreszenz-Molekulartomographie für die nicht-invasive Bildgebung von Glioblastom-Xenotransplantaten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Überwachung von Tumordynamiken in vivo.

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

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