Name: Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Lernen Sie die Herstellung kompakter Quantenpunkte für Einzelmolekül-Imaging. Diese Methode optimiert Helligkeit und Stabilität bei minimierter Größe für biophysikalische Anwendungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Hong Yi an der Emory University Integrierte Microscopy Core-danke für die Elektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse finanziert (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 und 1K99CA154006-01).

Die folgenden Synthese-Verfahren beinhalten Standard luftfreien Techniken und die Verwendung einer Vakuum / Inertgas Verteiler; detaillierte Methode können in Referenzen 10 und 11 gefunden werden. MSDS für alle potenziell toxischen und brennbaren Stoffen sollten vor Gebrauch konsultiert werden und alle brennbaren und / oder Luft-labile Verbindungen sollten in Septum verschlossenen Fläschchen in einem Handschuhfach oder Handschuhsacks aliquotiert werden. Ein. Synthese von Mercury Cadmium Selenide (Hg x Cd 1-x Se) Quantum Dot Cores <ol><li> Bereiten Sie eine 0,4 M Lösung von Selen in Trioctylphosphin (TOP). Fügen Selen (0,316 g, 4 mmol) in einem 50 ml-3-Halskolben, dann evakuieren und füllen mit Argon mit einem Schlenk Linie. Unter Luft-freien Bedingungen (trockener Stickstoff oder Argon), 10 ml TOP und Hitze bis 100 ° C unter Rühren für 1 Stunde, um eine klare, farblose Lösung ergeben. Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur und stellen Sie die Flasche beiseite. </li><li> In einem 250-ml-3-Halskolben, fügen Cadmiumoxid (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), Tetradecylphosphonsäure (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) und Octadecen (DGL, 27,6 ml) und evakuieren die Lösung mit dem Schlenk Linie unter Rühren. Erhöhen der Temperatur auf 100 ° C und Evakuieren für weitere 15 min auf niedrig siedende Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Unter Argon oder Stickstoff, erwärmt das Gemisch auf 300 ° C für 1 Stunde vollständig auflösen CdO. Die Lösung wird von einer rötlichen Farbe klar und farblos ändern. Die Lösung wird auf Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen Hexadecylamin (HDA, 7,0 g) zu der Cadmium-Lösung, erwärmt auf 70 ° C, und zu evakuieren. Sobald ein konstanter Druck erreicht ist, erhöht die Temperatur auf 100-110 ° C und Rückflußtemperatur der Lösung für 30 min. Schalten Sie das Schlenk-Ventil Inertgas und legen Sie das Thermoelement direkt in der Lösung. </li><li> Unter Luft-freien Bedingungen, fügen Diphenylphosphin (DPP, 100 ul) zu der Lösung und erhöhen die Temperatur auf 310 ° C. Entfernen Sie 7,5 ml der 0,4 M TOP-Se-Lösung(3 mmol Selen) in einem Einweg-Kunststoff-Spritze mit einer 16-Gauge-Nadel. </li><li> Sobald die Temperatur äquilibriert bei 310 ° C, stellen Sie den Temperaturregler auf 0 ° C und schnell spritzen den TOP-Se-Lösung direkt in die Cadmium-Lösung. Die Lösung wird von farblos bis gelb-orange zu ändern und die Temperatur schnell sinken und erhöhen erneut auf ~ 280 ° C. Nach 1 min Reaktionszeit, entfernen Sie den Kolben aus dem Heizmantel und rasche Abkühlung mit einem Luftstrom, bis die Temperatur weniger als 200 ° C. </li><li> Wenn die Temperatur ~ 40 ° C erreicht, mit 30 ml Hexan verdünnt, die meisten der verbleibenden Kadmium-Vorläufer wird sich aus der Lösung. Entfernen dieses Präzipitat durch Zentrifugation (5.000 × g, 10 min). </li><li> In jeder der sechs 50 ml Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen, verdünnen 12 ml des rohen Nanokristall-Lösung mit 40 ml Aceton, Zentrifuge (5.000 xg für 10 min), und vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen. </li><li> Lösen Sie die nanocrystal Pellets in Hexan (25 ml Gesamtvolumen). Extrahieren diese Lösung 3 mal mit dem gleichen Volumen Methanol, Halten der oberen Phase. Zum dritten Extraktion kann das Volumen von Methanol zu ~ 15 ml eingestellt werden, um eine konzentrierte Lösung von reinem Hexan CdSe QDs bei etwa 200 um zu erhalten. Die typische Ausbeute dieser Reaktion ist 3 pmol von CdSe-Nanokristallen mit einem Durchmesser von 2,3 nm (50-60% Reaktionsausbeute). </li><li> Bestimmen Sie die Nanokristall Durchmesser und Konzentration durch Messung der UV-Vis-Absorptionsspektrum und Anhörung der Größe sitzende Diagramm der Mulvaney und Kollegen 12 und die vom Aussterben Korrelationen Bawendi und Mitarbeiter 13. Siehe Anhang für weitere Details. </li><li> Mercury Kationenaustausch: die Nanokristalle können teilweise mit Quecksilber ausgetauscht werden, um Rot-Verschiebung der Absorption und Fluoreszenz-Emission. Mischen der folgenden zusammen, um in einem 20 ml Glasfläschchen mit einem Rührstab (diese Reaktion kann wie gewünscht skaliert): 3 ml Hexan, 2 ml Chloroform, 1 ml 200 uM CdSe QD-Lösung (200 nmol), 15 ul Oleylamin (OLA), und 500 ul einer 0,1 M Lösung von Hg (OT) 2 in Chloroform. Mercury octanethioate (HgOT 2) kann durch Umsetzung Quecksilberacetat und Octanthiol in Methanol (siehe Anhang) hergestellt werden. Da die Kationenaustauschreaktion fortschreitet, kann der Umfang der Rotverschiebung mit UV-Vis-Absorptionsspektrophotometrie überwacht werden. Nachdem die gewünschte Absorptionsbande erreicht ist, Messen der Absorption des Nanokristalls Lösung bei 350 nm und bestimmen den neuen Extinktionskoeffizient der Annahme, dass der Nanokristall Konzentration nicht verändert hat (30,7 uM in diesem Beispiel). Die Reaktion wird durch Entfernen des nicht umgesetzten Quecksilber: 5 ml Decan, 10 ml Hexan und 7 ml Methanol und extrahieren Sie die Lösung, indem die obere Phase, die die Nanokristalle. Auszug zweimal mit Hexan und Methanol, und die Lautstärke von Methanol, so dass die obere Phase ist ~ 7 ml. Wenn die Phasen langsam zu trennen sind, kann die Lösung zentrifugiert (5000 xg werden,10 min). Fügen Sie 100 ul TOP 100 ul OLA und 100 ul Ölsäure zu den Nanokristallen mit 40 ml Aceton, um die Ausfällung zu induzieren. Sammeln Sie die Nanokristalle durch Zentrifugation und verteilen in 3 ml Hexan. Zentrifugieren, um unlösliche Bestandteile zu entfernen und bestimmen den Nanokristall Konzentration wieder unter Verwendung des neuen Extinktionskoeffizienten bei 350 nm auf. Lassen Sie die Nanokristall-Lösung auf das Alter von mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li></ol> 2. Wachstum von Cadmium Zinksulfid (Cd y Zn 1-y S) Shell <ol><li> Bereiten 0,1 M-Schale Precursorlösungen in 50 ml 3-Hals-Kolben. Cadmium Vorläufer: Cadmiumacetat Hydrat (230,5 mg, 1 mmol) und 10 ml Oleylamin (OLA). Zinkvorläufer: Zinkacetat (183,5 mg, 1 mmol) und 10 ml OLA. Sulfur Vorstufe: Schwefel (32,1 mg, 1 mmol) und 10 ml ODE. Unter Vakuum erwärmt jede Lösung bis zum Rückfluss für 1 Stunde, um klare Lösungen ergeben, und dann kostenlos mit Argon. Die Lösung kann Schwefelauf Raumtemperatur abgekühlt werden, wobei die Cadmium-und Zink-Vorläufer werden bei ca. 50 ° C gehalten Berechnungen von Shell Vorstufe Mengen können in Bezug 14 gefunden werden. </li><li> Zu einer 3-Halskolben: Hg x Cd 1-x Se QD (120 nmol, 2,3 nm Durchmesser), DGL (2 ml) und Trioctylphosphinoxid (TOPO, 250 mg). Evakuierung aus dem Hexan bei Raumtemperatur mit der Schlenk Linie. Erhöhen der Temperatur auf 100 ° C und Rückfluß für 15 min. Ändern Sie den Schlenk-Ventil Argon oder Stickstoff und legen Sie die Thermoelement in der Nanokristall-Lösung. </li><li> Erhöhen Sie die Temperatur auf 120 ° C, mit 0,5 Monolagen von Schwefel Precursorlösung (140 ul), und lassen Sie die Reaktion für 15 min gehen. Kleine Aliquots (&lt;50 ul) kann unter Verwendung einer Glasspritze, um den Fortschritt der Reaktion unter Verwendung von Fluoreszenz und / oder UV-Vis-Absorptionsspektrophotometrie überwachen. Erhöhen Sie die Temperatur auf 140 ° C, mit 0,5 Monolagen von Cadmium Precursorlösung (140 ul) und um die Reaktion für 15 min gehen. Fügen Sie 500 ul wasserfreiem OLA zu der Reaktionslösung. </li><li> Bei 160 ° C mit 0,5 Monolagen von Schwefel Precursorlösung (220 ul) durch eine gleiche Menge Zink Precursorlösung bei 170 ° C mit 15 min zwischen jeder Zugabe. Dann bei 180 ° C hinzuzufügen 0,25 Monoschichten von Schwefel Vorläuferlösung (150 ul) und Zinkvorläufer Lösung in 15 min Intervallen. </li><li> Man kühlt die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und erneut berechnet eine neue Extinktionskoeffizienten für diese Teilchen unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrum, unter der Annahme, dass die Anzahl von Nanokristallen nicht geändert hat (120 nmol in 3,8 ml Reaktionslösung). Speichern die Reaktionslösung als Rohgemisch in einem Gefrierschrank, die Nanokristalle kann aufgetaut und gereinigt werden nach Bedarf unter Verwendung desselben Verfahrens in den Abschnitten 1.8 und 1.9 beschrieben. </li><li> Die Nanokristalle kann dadurch mittels Elektronenmikroskopie, UV-Vis-Absorption-Spektroskopie und Fluoreszenz-Spektroskopie werden. Quantenausbeute kannabsolut Verwendung eines Ulbricht-Kugel oder relativ im Vergleich zu einem bekannten Standard unter Verwendung der Verfahren von Referenz 15 berechnet. </li></ol> 3. Phase Transfer <ol><li> Zugabe von gereinigtem Core / Shell Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y S QDs (5 ml, 20 uM) zu einem 50 ml 3-Halskolben und Entfernen des Hexans unter Hochvakuum, um einen trockenen Film zu ergeben. Füllen des Kolbens mit Argon, hinzuzufügen wasserfreiem Pyridin (3 ml) zu dem Nanoteilchenfilm und Wärme die Aufschlämmung auf 80 ° C. Im Laufe von 1 bis 2 h die Nanopartikel vollständig aufzulösen. </li><li> Add 1-Thioglycerin (1 ml) zu der Lösung zugegeben und bei 80 ° C für 2 Stunden. Dann kühlen die Lösung auf Raumtemperatur und fügen Triethylamin (0,5 ml) Thioglycerin deprotonieren. Rühre 30 Minuten. Die Lösung kann sich nach der Zugabe von Triethylamin aufgrund der schlechten Löslichkeit polarer Nanokristalle in diesem Lösungsmittelgemisch bewölkt. </li><li> Übertragen Sie die QD-Lösung in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen containing eine Mischung aus 20 ml Hexan und 20 ml Aceton und gut mischen. Isolieren Sie die gefällten Nanokristalle durch Zentrifugation (5.000 xg, 10 min), und waschen Sie das Pellet mit Aceton. </li><li> Man löst den QD Pellet in DMSO (5 ml) mit Bad Ultraschallbehandlung, und dann zentrifugiert (7000 × g, 10 min), um mögliche Aggregate zu entfernen. Ermitteln der Konzentration Nanopartikel aus einem UV-Vis-Absorptionsspektrum. Diese Lösung des reinen QDs sollte innerhalb von 3 h verwendet werden, da die Oberfläche Thiole können langsam unter Umgebungsbedingungen an der Luft oxidieren. </li><li> Verdünnen Sie die QD-Lösung bis 10 uM oder weniger mit DMSO und übertragen auf eine 50 ml Flasche. Bereiten Sie eine 5 mg / ml Lösung von thiolierten Polyacrylsäure (Synthese in Anhang beschrieben) in DMSO. Hinzufügen der Polymerlösung (0,15 mg Polymer pro nmol QDs) tropfenweise zu der Lösung unter Rühren QD und entgast die Lösung bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Bereinigen des QD / Polymer-Lösung mit Argon und auf 80 ° C für 90 min. Dann kühlen die Lösung auf Raumtemperatur eind tropfenweise das gleiche Volumen von 50 mM Natriumborat, pH 8. Rühre 10 Minuten. </li><li> Reinigen die QDs mittels Dialyse (20 kDa Cutoff) in 50 mM Natriumborat, pH 8, und dann konzentrieren sich die Partikel mit einem Zentrifugen-Filtereinheiten (10 kDa Cutoff). Bestimmung der Konzentration von einem UV-Vis-Absorptionsspektrum. </li></ol> 4. PEG Coating <ol><li> In einem 4 ml Glasfläschchen mit einem Rührstab, mischen 1 nmol QDs in Boratpuffer mit einem 40.000 x molaren Überschuss von 750 Da mono-Polyethylenglykol (30 mg, 40 pmol). Wenn eine bestimmte chemische Funktionalität ist den Nanokristallen (zB Hydrazid oder Maleimid) zugesetzt werden, kann es durch Ersetzen eines Anteils der Amino-PEG mit einem heterobifunktionellen Amino-PEG (30% Stoffmengenanteil typischerweise gut funktioniert) eingeführt werden. Verdünnen Sie die Nanokristall-Lösung zu 1 uM mit Boratpuffer. Diese Reaktion kann beliebig skaliert werden. </li><li> Bereiten Sie eine frische Lösung von DMTMM (20 mg, 72 mmol) in DMSO (144 ul). Diese Lösung kann kurzzeitig erhitzt werden unter einen Strom von warmem Leitungswasser oder untergetaucht in einem Ultraschallbad vollständig auflösen DMTMM. Schnell eine 25.000 x molaren Überschuss dieser 0,5 M DMTMM Lösung (50 ul) der QD-Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4,2 vier weitere Male, um den Nanokristall Oberfläche mit PEG zu sättigen. Schließlich, fügen Sie 200 ul 1 M Tris-Puffer, um die Reaktion zu stoppen und Reinigung der Nanokristalle mittels Dialyse, zentrifugale Filter oder Ultrazentrifugation. </li><li> Die Nanokristalle kann Monodispersität, hydrodynamische Größe und Oberflächenladung mit Flüssigkeitschromatographie, Agarose-Gelelektrophorese, und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hydrodynamische Größe und Größenverteilung mit einem automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-System (GE AKTAprime Plus) zu bestimmen, verwenden eine Superose 6 Säule, einer Flussrate von 0,5 ml / min mit PBS-Puffer Eluent und Absorption Detektion bei 260 oder 280 nm beträgt. Vergleichen Nanopartikel Elutionszeiten mit denen von Molekulargewichtsstandards. Für Agarosegel ElektrophoreseWider bereiten ein 0,5% iges Agarosegel in 50 mM Natrium-Borat-Puffer (pH 8,5) oder 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 1 pM mischen Proben mit 10% Glycerin und Last in Bohrlöcher, und führen bei 100 V für 30 min . Bild der Nanokristalle in dem Gel mit Hilfe eines UV Hand Zauberstab oder UV-Transilluminator und Fluoreszenzanregung. Um das Bild der Nanokristalle auf der Ebene einzelner Moleküle mittels Fluoreszenzmikroskopie, verdünnen die Partikel bis 0,2 nM in 10 mM Phosphat-Puffer, fallen 2,5 ul der Lösung auf einem Deckglas, und vorsichtig ein zweites Deckglas auf der Oberseite des flüssigen Kügelchen zu verbreiten ein Film zwischen den Deckgläsern. Bild der Oberfläche gebundenen Partikel mit einer hohen numerischen Apertur Objektiv (idealerweise mindestens 1,40) oder in beiden Epifluoreszenz TIRF-Modus mit einer Anregung bei Wellenlängen zwischen 400 bis 580 nm und einer Elektronen-multiplizierenden CCD-Kamera. Exact Bildparameter werden zwischen Mikroskopie Setup variieren. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Vergleich zu herkömmlichen CdSe Quantenpunkten, können ternäre Legierung Hg x Cd 1-x Se-Nanokristalle in der Größe und Fluoreszenzwellenlänge unabhängig eingestellt werden. Die Größe wird zuerst während der Synthese von CdSe Nanokristall Kernen ausgewählt und der Fluoreszenzwellenlänge in einem sekundären Quecksilber Kationenaustauschschritt, welche im Wesentlichen nicht verändern die Nanokristallgröße 9 übernommen. Es ist wichtig, damit das gereinigte Hg x Cd 1-x</sub...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Selen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229865 </td><td></td></tr><tr><td> Tri-n-octylphosphin </td><td> Strem </td><td> 15-6655 </td><td> 97% rein, Luft instabil </td></tr><tr><td> Cadmiumoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 202894 </td><td> Sehr giftig: Vorsicht </td></tr><tr><td> Tetradecylphosphonsäure </td><td> PCI Synthese </td><td> 4671-75-4 </td><td></td></tr><tr><td> Octadecene </td><td> Alfa Aesar </td><td> L11004 </td><td> Technische Qualität </td></tr><tr><td> Hexadecylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7408 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylphosphine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252964 </td&gt; <td> Pyrophore </td></tr><tr><td> Quecksilberacetat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 456012 </td><td> Sehr giftig: Vorsicht </td></tr><tr><td> 1-Octanthiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471836 </td><td> Starker Geruch </td></tr><tr><td> Ölsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W281506 </td><td></td></tr><tr><td> Zinkacetat </td><td> Alfa Aesar </td><td> 35792 </td><td></td></tr><tr><td> Cadmium acetathydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229490 </td><td> Sehr giftig: Vorsicht </td></tr><tr><td> Oleylamin </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12954 </td><td> Luft instabil </td></tr><tr><td> Schwefel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 344621 </td><td></td></tr><tr><td> Trioctylphosphinoxid </td><td> Strem </td><td> 15-6661 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Pyridin </td><td> VWR </td><td> EM-PX2012-6 </td><td> Wasserfrei </td></tr><tr><td> Thioglycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1753 </td><td> Starker Geruch </td></tr><tr><td> Triethylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471283 </td><td> Wasserfrei </td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Spectrum Labs </td><td> 131342 </td><td> Cutoff 20 kDa </td></tr><tr><td> Zentrifugalfilter </td><td> Millipore </td><td> UFC801024 </td><td> Cutoff 10 kDa </td></tr><tr><td> Mono-PEG </td><td> Rapp Polymere </td><td> 12 750-2 </td><td> 750 Da </td></tr><tr><td> DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium-chlorid-Hydrat </td><td> Alfa Aesar </td><td> H26333 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAprime Plus-Chromatographie-System </td><td> GE HealthCare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL Chromatographiesäule </td><td> GE HealthCare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, Omnipur </td><td> VWR </td><td> EM-2120 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anhang Synthese von Quecksilber octanethiolate: Langsam eine Methanollösung von Quecksilberacetat (1 eq.) Zu einer gerührten Lösung von 1-Octanthiol (3 Äq.) Und Kaliumhydroxid (3 Äq.) In Methanol bei Raumtemperatur. Isolieren Sie das Quecksilber (II) octanethiolate Niederschlag durch Filtration, waschen zweimal mit Methanol und einmal mit Ether und dann im Vakuum getrocknet. Synthese von mehrzähnigen Polymer: Lösen Polyacrylsäure (1 g, 1.773 Da) in 25 ml Dimethylformamid (DMF) in einem 150 ml-Dreihalskolben und Blase mit Argon für 30 min. Fügen Sie eine wasserfreie Lösung von Cysteamin (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml DMF. Bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren langsam wasserfreies Diisopropylcarbodiimid (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) über 30 min, gefolgt von Triethylamin (170 ul, 1,22 mmol) gefolgt, und um die Reaktion für 72 Stunden bei 60 ° C. Hinzufügen Mercaptoethanol (501 mg, 6,41 mmol), um die Reaktion zu quenchen, und rühre für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Entfernen DMF durch Rotationsverdampfung und Isolierung des Polymers mit dem Zusatz von einem 2:1-Gemisch von eiskaltem Aceton: Chloroform, gefolgt von Zentrifugation. Lösen des Polymers in ~ 5 ml wasserfreiem DMF, Filter, Niederschlag nochmals mit Diethylether, und wiederholen. Trocknen Sie das Produkt unter Vakuum und speichern unter Argon. Bestimmung von CdSe Kerndurchmesser: Von der UV-Vis-Absorptionsspektrum bestimmt die Wellenlänge des ersten Exciton-Peak (λ in nm), die am längsten Wellenlängenspitze (z. B. etwa 498 nm für CdSe in Abbildung 2a), und verwenden Sie die Dimensionierung Kurve Mulvaney und Mitarbeiter 12: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg" alt= &quot;Gleichung 1&quot; /&gt; Bestimmung von CdSe Nanokristall Konzentration: Aus einem Hintergrund-subtrahierten UV-Vis-Spektrum einer optisch klaren Lösung von CdSe-Nanokristallen, bestimmen die Absorption bei 350 nm Wellenlänge. Reihenverdünnungen kann ermittelt werden, wenn die optische Absorption innerhalb des linearen Bereichs des Beerschen Gesetz ist. Der Nanokristall Konzentration (QD, in M) durch Einstecken des Nanokristalls Durchmesser (D, in nm), der optischen Absorption Wert (A 3sa) und der Küvette Weglänge (l, in cm) in die folgende Gleichung bestimmt werden aus die empirische Korrelation von Bawendi und Mitarbeiter 13: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /></td></tr></tbody></table>

compact quantum dots für einzelmolekül-imaging

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-Molecule Imaging ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Mechanismen der biomolekularen Funktion und zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der molekularen Verhaltensweisen, die Zellbiologie 1-4 zugrunde liegen. Zum Abbilden eines einzelnen Moleküls von Interesse, ist es typischerweise konjugiert an einen fluoreszierenden Marker (Farbstoff, Protein, Kügelchen oder Quantenpunkt) und beobachtet mit Epifluoreszenz oder Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie. Während Farbstoffe und fluoreszierende Proteine ​​gewesen die Hauptstütze der Fluoreszenz-Bildgebung Jahrzehnten ist ihre Fluoreszenz unter hohem Photonenflüsse notwendig, einzelne Moleküle zu beobachten instabil, was nur wenige Sekunden der Beobachtung vor dem vollständigen Verlust des Signals. Latexkügelchen und Farbstoff-markierten Kügelchen eine verbesserte Signalstabilität aber auf Kosten drastisch größere hydrodynamische Größe, die nachteilig zu verändern, kann die Diffusion und das Verhalten des untersuchten Moleküls. ntent &quot;&gt; Quantum Dots (QDs) bieten eine Balance zwischen diesen beiden problematischen Regime. Diese Nanopartikel aus Halbleitermaterialien bestehen und kann mit einem hydrodynamisch kompakte Größe mit außergewöhnlicher Beständigkeit gegen Photodegradation 5 konstruiert werden. So ist in den letzten Jahren QDs wurden in ermöglicht instrumental Langzeitbeobachtung von komplexen makromolekularen Verhalten auf der Ebene einzelner Moleküle. Allerdings sind diese Teilchen noch gefunden zu einer Beeinträchtigung der Diffusion in überfüllten molekularen Umgebungen wie dem Zytoplasma und der neuronalen synaptischen Spalt, wo ihre Größen sind immer noch zu groß 4,6 aufweisen , 7. Vor kurzem haben wir die Kerne und Oberflächenbeschichtungen von QDs für minimierte hydrodynamischen Größe ausgelegt, während Balancing Offsets kolloidalen Stabilität, Photostabilität, Helligkeit und unspezifische Bindung, die den Nutzen der kompakten QDs behindert haben in der Vergangenheit 8,9. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigendie Synthese, Modifizierung und Charakterisierung dieser optimierten Nanokristalle aus einem legierten Hg x Cd 1-x Se-Kern mit einer isolierenden Cd y Zn 1-y S Schale, weiter mit einem mehrzähnigen Liganden mit kurzer Polymer Polyethylenglykol modifiziert beschichtet ist ( PEG)-Ketten (Abbildung 1). Verglichen mit herkömmlichen CdSe-Nanokristalle, bieten Hg x Cd 1-x Se-Legierungen größer Quantenausbeuten der Fluoreszenz Fluoreszenz bei rotem und nahes Infrarot-Wellenlängen für verbessertes Signal-zu-Rauschen in Zellen, und Anregung bei nicht zytotoxische sichtbaren Wellenlängen. Mehrzähnigen Polymerbeschichtungen binden an den Nanokristalloberfläche in einem geschlossenen und flache Konformation hydrodynamischen Größe zu minimieren, und PEG neutralisiert die Oberflächenladung auf unspezifische Bindung an Zellen und Biomolekülen zu minimieren. Das Ergebnis ist ein hell fluoreszierende Nanokristall mit Emission zwischen 550-800 nm und insgesamt hydrodynamische Größe der Nähe von 12 nm. Dies ist in der same Größenbereich so viele lösliche globuläre Proteine ​​in Zellen, und wesentlich kleiner als bei konventionellen PEGylierte QDs (25-35 nm).

2 zeigt repräsentative Absorptions und Fluoreszenzspektren für CdSe-Nanokristalle, Hg x Cd 1-x Se-Nanokristallen nach Kationenaustausch und Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y S-Nanokristallen auf Granate Wachstum. Die Kern CdSe-Nanokristalle eine Quantenausbeute der Fluoreszenz der Nähe von 15% (einschließlich langwelligen tief-Trap-Emission), aber dieser Wirkungsgrad sinkt auf weniger als 1% nach Quecksilber Austausch, wahrscheinlich aufgrund ...

Wir beschreiben die Herstellung von kolloidalen Quantenpunkten mit minimierter hydrodynamische Größe für Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Imaging. Im Vergleich zu herkömmlichen Quantenpunkte sind diese Nanopartikel in der Größe ähnlich zu globularen Proteinen und sind für Einzel-Molekül-Helligkeit, Stabilität gegen Photodegradation und Beständigkeit gegen unspezifische Bindung an Proteine ​​und Zellen optimiert.

Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Die Einzelmolekül-Bildgebung ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Mechanismen biomolekularer Funktionen sowie zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Quantenpunkte mit optimierter Helligkeit und Stabilität sowie minimierter Größe und unspezifischer Bindung für die Einzelmolekül-Bildgebung herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine Quantenpunkt-Kerne aus Cadmiumselenid hergestellt werden. Im zweiten Schritt werden diese Kerne mit Quecksilber legiert, um deren Fluoreszenz in den roten Spektralbereich zu verschieben und ihre Helligkeit zu erhöhen.Anschließend wird eine dünne Legierungsschale auf den Nanokristallen aufgewachsen, um deren Fluoreszenzemission zu stabilisieren. Im letzten Schritt werden diese Partikel mittels eines mehrzähnigen Polymers aus organischen Lösungsmitteln in wässrige Puffer überführt, das mit biologisch inertem Polyethylenglykol modifiziert werden kann. Schließlich werden Fluoreszenzspektrometrie, Gelchromatographie und Gelelektrophorese eingesetzt, um zu zeigen, dass diese Partikel helle Fluoreszenz, eine kompakte hydrodynamische Größe und eine neutrale elektrostatische Ladung aufweisen – Eigenschaften, die sie besonders gut für die Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung in der Biologie geeignet machen.Der Hauptvorteil dieser

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Wir stellen detaillierte Anweisungen für die Herstellung von monovalenten zielgerichteten Quantenpunkten (mQDs) aus Phosphorthioat-DNA definierter Länge zur Verfügung. Die DNA-Umhüllung erfolgt bei hoher Ausbeute, so dass die Produkte nicht gereinigt werden müssen. Wir demonstrieren die Verwendung des SNAP-Tags, um mQDs für Anwendungen zur Bildgebung lebender Zellen an Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu richten.

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

Der Herstellungsprozess und experimentelle Charakterisierungstechniken, die für Einzelelektronenpumpen auf Basis von Silizium-Metalloxid-Halbleiter-Quantenpunkten relevant sind, werden diskutiert.

Silicium-Metall-Oxid-Halbleiter-Quantenpunkte für Einzelelektronen Pumping

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

Resonante Anregung von einem einzigen selbstgebaute Quantenpunkt kann eine Anregung Modus orthogonal zu den Fluoreszenz-Sammlung-Modus erreicht werden. Wir zeigen eine Methode mit dem Hohlleiter und Fabry-Perot-Modi von einem planaren Mikrokavität rund um die Quantenpunkte. Die Methode ermöglicht völlige Freiheit in der Erkennung Polarisierung.

Resonanz-Fluoreszenz ein InGaAs Quantum Dot in einem planaren Hohlraum mit orthogonalen Erregung und Erkennung

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Immunmarkierung eines Proteins in den Herzgewebeschnitten unter Verwendung von Quantenpunkten. Diese Technik bietet ein nützliches Werkzeug, um die subzelluläre Lokalisation und Expression eines Proteins auf ultrastruktureller Ebene zu visualisieren.

Visualisierung der subzellulären Lokalisation eines Proteins im Herzen mittels Quantenpunkt-vermittelter Immunmarkierung gefolgt von Transmissionselektronenmikroskopie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) und den Nachweis von Krankheitsbiomarkern mit QDNB-basierten Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem fluoreszierenden Stripreader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.

Fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von Quantenpunkt-Nanokügelchen

Lernen Sie die Herstellung kompakter Quantenpunkte für Einzelmolekül-Imaging. Diese Methode optimiert Helligkeit und Stabilität bei minimierter Größe für biophysikalische Anwendungen.

Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

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