Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Quantenpunkte mit optimierter Helligkeit und Stabilität sowie minimierter Größe und unspezifischer Bindung für die Einzelmolekül-Bildgebung herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine Quantenpunkt-Kerne aus Cadmiumselenid hergestellt werden. Im zweiten Schritt werden diese Kerne mit Quecksilber legiert, um deren Fluoreszenz in den roten Spektralbereich zu verschieben und ihre Helligkeit zu erhöhen.

Anschließend wird eine dünne Legierungsschale auf den Nanokristallen aufgewachsen, um deren Fluoreszenzemission zu stabilisieren. Im letzten Schritt werden diese Partikel mittels eines mehrzähnigen Polymers aus organischen Lösungsmitteln in wässrige Puffer überführt, das mit biologisch inertem Polyethylenglykol modifiziert werden kann. Schließlich werden Fluoreszenzspektrometrie, Gelchromatographie und Gelelektrophorese eingesetzt, um zu zeigen, dass diese Partikel helle Fluoreszenz, eine kompakte hydrodynamische Größe und eine neutrale elektrostatische Ladung aufweisen – Eigenschaften, die sie besonders gut für die Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung in der Biologie geeignet machen.

Der Hauptvorteil dieser Quantenpunkte gegenüber bestehenden kommerziellen Materialien liegt darin, dass diese Nanopartikel eine deutlich verringerte hydrodynamische Größe aufweisen. Obwohl kleinere Quantenpunkte durch eine reduzierte Fluoreszenzintensität, eine geringere Fluoreszenzstabilität und ausschließlich Fluoreszenz im blauen Spektrum beeinträchtigt werden, haben wir diese Effekte durch einen Quecksilber-Kationenaustauschprozess kompensiert. Diese Nanokristalle können helfen, zentrale Fragen in der Biophysik und Zellkommunikation zu beantworten, indem sie die dynamische Abbildung einzelner Biomoleküle in stark überfüllten biologischen Umgebungen ermöglichen.

Zunächst wird eine 0,4-molare Selenlösung in THF hergestellt, indem Selen in einen 50-Milliliter-Dreihalskolben gegeben, der Kolben unter Hochvakuum evakuiert und unter luftfreien Bedingungen mittels einer Schlenk-Leitung mit Argon gefüllt wird. Anschließend werden 10 Milliliter THF zugegeben und eine Stunde lang unter Rühren auf 100 Grad Celsius erhitzt, um eine klare, farblose Lösung zu erhalten.

Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur ab und stellen Sie das Kolben beiseite. Bereiten Sie außerdem eine Lösung aus Cadmiumoxid, TDPA und ODE in einem 250-Milliliter-Dreihalskolben mit den in der schriftlichen Anleitung aufgeführten Mengen vor. Evakuieren Sie die Lösung unter Rühren mithilfe einer Vakuumpumpe, die dem vorliegenden Video beiliegt.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 100 Grad Celsius und evakuieren Sie weitere 15 Minuten lang. Um Verunreinigungen mit niedrigem Siedepunkt unter Argongas zu entfernen, erhitzen Sie die Mischung eine Stunde lang auf 300 Grad Celsius, um das Cadmiumoxid vollständig aufzulösen. Die Lösung wechselt von einer rötlichen Farbe zu klar und farblos; kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur ab.

Fügen Sie anschließend HDA zur Cadmiumlösung hinzu, erhitzen Sie auf 70 Grad Celsius und evakuieren Sie. Sobald ein konstanter Druck erreicht ist, erhöhen Sie die Temperatur und refluxieren die Lösung 30 Minuten lang. Schalten Sie das Ventil der Schlenk-Leitung auf Inertgas und führen Sie das Thermoelement direkt in die Lösung ein.

Unter luftfreien Bedingungen DPP zur Cadmiumlösung hinzufügen und die Temperatur auf 310 Grad Celsius erhöhen. Anschließend 7,5 Milliliter der 0,4-molaren oberen Selenlösung mit einer Einweg-Plastspritze, die an eine 16-Gauge-Nadel angeschlossen ist, entnehmen. Sobald die Temperatur 310 Grad Celsius erreicht hat, den Temperaturregler auf null Grad Celsius einstellen und die obere Selenlösung rasch direkt in die Cadmiumlösung injizieren.

Die Lösung verfärbt sich von farblos zu gelb, orange, und die Temperatur sinkt schnell ab und steigt anschließend wieder auf etwa 280 Grad Celsius an. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, das gesamte Volumen der Spritze so schnell wie möglich in die Cadmiumlösung zu injizieren. Dies gewährleistet, dass die Partikel homogen nucleieren.

Nach einer Minute Reaktionszeit den Kolben vom Heizmantel nehmen und schnell mit einem Luftstrom abkühlen, bis die Temperatur unter 200 Grad Celsius fällt. Wenn die Temperatur etwa 40 Grad Celsius erreicht, mit 30 Milliliter Hexan verdünnen; der größte Teil des verbleibenden Cadmiumvorläufers wird sich aus der Lösung absetzen. Diesen Niederschlag durch Zentrifugation entfernen.

In je einem von sechs 50-Milliliter-Polypropylen-Kegelzentrifugenröhrchen 12 Milliliter der resultierenden rohen Nano-Krystal-Lösung mit 40 Milliliter Aceton verdünnen. Nach der Zentrifugation mit denselben Parametern das Überstandsvolumen vorsichtig dekantieren und verwerfen. Danach die Nano-Krystal-Pellets in Hexan auflösen.

Extrahieren Sie die Lösung mit einem gleichen Volumen Methanol unter Beibehaltung der oberen Phase. Wiederholen Sie diese Extraktion insgesamt dreimal, wobei die dritte Extraktion die letzte ist. Das Volumen von Methanol kann auf etwa 15 Milliliter angepasst werden, um eine konzentrierte Hexan-Lösung reiner Cadmiumselenid-Quantenpunkte bei etwa 200 Mikromolar zu erhalten.

Die typische Ausbeute dieser Reaktion beträgt drei Mikromolar Cadmiumselenid-Kristalle mit einem Durchmesser von zwei bis drei Nanometern. Bestimmen Sie den Durchmesser und die Konzentration der Nanokristalle durch Messung des ultravioletten-sichtbaren Absorptionsspektrums, wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben. Die Nanokristalle können teilweise mit Quecksilber ausgetauscht werden, um die Absorption und die Fluoreszenzemission in den roten Bereich zu verschieben. Mischen Sie hierzu in einem 20-Milliliter-Glaskolben mit Rührfisch Hexan und Chloroform, fügen Sie dann die Cadmiumselenid-Quantenpunkt-Lösung, OLA und Quecksilberoctandiolat hinzu. Nach der Reinigung der Nanokristalle und der Bestimmung ihrer Konzentration gemäß der schriftlichen Anleitung lassen Sie die Nanokristalle mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur altern, um das Wachstum der Hülle zu ermöglichen.

Stellen Sie 0,1-molare Schalen-Vorläuferlösungen in 50-Milliliter-Dreihalskolben her. Erhitzen Sie unter Vakuum Lösungen des Cadmium-Vorläufers, des Zink-Vorläufers und des Schwefel-Vorläufers zur Rückflusskondensation für eine Stunde, um klare Lösungen zu erhalten, und spülen Sie dann den Dreihalskolben mit Argon. Geben Sie Topo, ODE und die hergestellten Quecksilber-Cadmium-Selenid-Quantenpunkte hinzu. Entfernen Sie das Hexin bei Raumtemperatur über die Seitenarmleitung.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 100 Grad Celsius und führen Sie eine Rückflusskühlung für 15 Minuten durch. Wechseln Sie das Leitungsventil auf Argongas und führen Sie das Thermoelement in die Nano-Krystal-Lösung ein. Nach Erhöhung der Temperatur auf 120 Grad Celsius geben Sie 0,5 Monolagen oder 140 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung hinzu und lassen die Reaktion 15 Minuten lang ablaufen.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 140 Grad Celsius. Geben Sie 0,5 Monolagen oder 140 Mikroliter Cadmium-Vorläuferlösung hinzu und lassen Sie die Reaktion 15 Minuten lang ablaufen. Anschließend geben Sie 500 Mikroliter wasserfreies OLA zur Reaktionslösung hinzu.

Geben Sie 160 Grad Celsius, 0,5 Monolagen oder 220 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung hinzu, gefolgt von einer gleichen Menge Zinkvorläuferlösung bei 170 Grad Celsius mit jeweils 15 Minuten Abstand zwischen jeder Zugabe. Anschließend bei 180 Grad Celsius jeweils 0,25 Monolagen oder 150 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung und Zinkvorläuferlösung im Abstand von 15 Minuten hinzufügen. Abkühlen lassen. Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und einen neuen Extinktionskoeffizienten für diese Partikel bestimmen.

Unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrums und unter der Annahme, dass die Anzahl der Nanokristalle unverändert geblieben ist, lagern Sie die Reaktionslösung als Rohgemisch im Gefrierschrank ein. Zu diesem Zeitpunkt können die Nanokristalle mittels Elektronenmikroskopie, UV-Vis-Absorptionsspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie charakterisiert werden. Geben Sie gereinigte Core-Shell-Quantenpunkte in einen 50-Milliliter-Dreihalskolben und entfernen Sie das Hexin unter Hochvakuum.

Um einen trockenen Film zu erhalten, füllen Sie den Kolben mit Argon. Geben Sie anhydres Purin zum Nanopartikelfilm hinzu und erhitzen Sie die Aufschlämmung über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden auf 80 Grad Celsius. Die Nanopartikel lösen sich vollständig auf.

Geben Sie ein Milliliter eines FIO-Glycerins zur Lösung hinzu und rühren Sie zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Nach dem Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur fügen Sie 0,5 Milliliter Triethylamin hinzu, um das Thio-Glycerin zu deprotonieren, und rühren 30 Minuten lang. Die Lösung kann nach Zugabe von Triethylamin trüb werden, da die polaren Nanokristalle in dieser Lösungsmittelmischung schlecht löslich sind.

Überführen Sie die Quantenpunkt-Lösung in ein 50-Milliliter-konisches Zentrifugenröhrchen, das eine Mischung aus 20 Milliliter Hexan und 20 Milliliter Aceton enthält, und mischen Sie gründlich. Isolieren Sie die ausgefallenen Nanokristalle durch Zentrifugation, waschen Sie das Pellet mit Aceton und lösen Sie das Quantenpunkt-Pellet unter Bad-Sonorisation in fünf Milliliter DMSO auf, gefolgt von einer Zentrifugation. Entfernen Sie mögliche Aggregate und bestimmen Sie anschließend die Nanopartikelkonzentration anhand eines UV-Vis-Absorptionsspektrums.

Die Lösung reiner Quantenpunkte sollte innerhalb von drei Stunden verwendet werden, da deren Oberfläche unter Umgebungsbedingungen in Luft langsam oxidieren kann. Verdünnen Sie die Quantenpunkt-Lösung mit DMSO auf 10 Mikromolar oder weniger und überführen Sie sie in einen 50-Milliliter-Kolben. Geben Sie eine vorbereitete Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter verdünnter Polyacrylsäure in DMSO tropfenweise unter Rühren zur Quantenpunkt-Lösung hinzu und entgasen Sie die Lösung bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Spülen Sie die Quantenpunkt-Polymerlösung mit Argon und erhitzen Sie sie 90 Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Nach dem Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur geben Sie ein äquivalentes Volumen von 50 Millimolar Natrium-Azetat, pH 8, tropfenweise hinzu und rühren 10 Minuten lang. Reinigen Sie die Quantenpunkte gemäß dem schriftlichen Verfahren und bestimmen Sie die Konzentration anhand eines UV-Vis-Absorptionsspektrums in einem vier Milliliter fassenden Glasvial mit Rührfisch. Mischen Sie ein Mol Quantenpunkte in Boratpuffer mit einem 40.000-fachen molaren Überschuss an 750 Dalton großem monoaminiertem Polyethylenglykol.

Anleitungen dazu, wie spezifische chemische Funktionalitäten an die Nanokristalle angeheftet werden können, finden sich im schriftlichen Verfahren. Geben Sie schnell ein 25.000-faches molares Überschuss einer frisch hergestellten Lösung des Aktivierungsreagens zur Quantenpunkt-Lösung hinzu und rühren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur um. Wiederholen Sie diesen Schritt noch viermal, um die Oberfläche der Nanokristalle mit PEG zu saturieren.

Als letzter Schritt 200 Mikroliter eines einmolarigen Tris-Puffers hinzufügen, um die Reaktion abzubrechen, bevor die Nanokristalle mittels dialysierender Zentrifugalfilter oder Ultrazentrifugation gereinigt werden. Die resultierenden Nanokristalle können hinsichtlich Monodispersität, hydrodynamischer Größe und Oberflächenladung mittels Flüssigkeitschromatographie, Gelelektrophorese und Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Dargestellt sind repräsentative Absorptions- und Fluoreszenzspektren für Cadmiumselenid-Nanokristalle, Quecksilber-Cadmiumselenid-Nanokristalle nach Kationenaustausch sowie Kern-Quecksilber-Cadmiumselenid, Mantel-Cadmium-Zinksulfid-Nanokristalle nach Mantelwachstum. Die Kern-Cadmiumselenid-Nanokristalle weisen eine Fluoreszenzquantenausbeute von nahezu 15 % auf. Diese Effizienz sinkt jedoch nach dem Quecksilberaustausch auf unter 1 %, wahrscheinlich aufgrund von Ladungsträgerfallen, die durch die Störung der Oberflächenatome entstehen.

Das Wachstum einer dünnen Schale aus Cadmium-Zink-Sulfid steigert diesen Wirkungsgrad auf über 70 %, wobei dieser weitgehend erhalten bleibt, nachdem die Partikel in Wasser überführt wurden. Im Gegensatz dazu verlieren Cadmiumselenid-Kern, Cadmium-Zink-Sulfid-Schale enthaltende Nanokristalle ohne Quecksilber-Einbau einen erheblichen Anteil ihrer Quantenausbeute in Wasser, sofern keine dicke Schale ausgebildet wird. Es ist wichtig anzumerken, dass die Passivierung mit Cadmium-Zink-Sulfid eine Rotverschiebung der Spektren bewirkt, die auf der Durchdringung der elektronischen Ladungsträger in das Schalenmaterial beruht.

Diese Verschiebung liegt bei Kernpartikeln aus Cadmium bei etwa 20 bis 30 Nanometern und nimmt mit steigendem Quecksilberanteil im Kern zu. Durch die Einlagerung von Quecksilber in den Nanokristallkern kann somit die geringe Größe des Nanokristalls beibehalten werden, ohne dass die Helligkeit beeinträchtigt wird. Die geringe Größe zeigt sich in diesem Transmissionselektronenmikrograf und der Partikelgrößenverteilung von Kern-Nanokristallen aus Quecksilber, Cadmium, Selenid und einer Hülle aus Cadmium, Zinksulfid mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 3,2 ± 0,6 Nanometern.

Die Verwendung eines zweistufigen Phasentransfers in Wasser ist entscheidend, um eine homogene Population von Nanokristallen zu erhalten, die keine weitere Größenseparation zur Entfernung von Clustern und Aggregaten mittels Größenausschluss erfordert. Das hier dargestellte Chromatogramm bestätigt, dass die Größe der Nanokristalle derjenigen von Conalbumin ähnelt. Bei 75 Kilodalton und nach Modifizierung mit 750 Dalton Amino-PEG erhöht sich die Größe lediglich auf 12 Nanometer, vergleichbar mit der eines IgG-Antikörpers.

Die PEG-Modifizierung neutralisiert die Oberflächenladung, wie im hier dargestellten Agarose-Gel-Elektrophorese-Experiment bestätigt wird. Die Probe wird mit einem Pfeil markiert, und die Elektrodenpolaritäten sind rechts angegeben. Dies zeigt, dass die Nanokristalle vor der Konjugation als ionische Teilchen wandern, während die pegylierten Nanokristalle elektrostatisch neutral sind. Gezeigt ist hier eine Epifluoreszenzmikrografie dieser Nanokristalle, die auf einem Glasdeckel aufgebracht und mit sichtbarem Licht der Wellenlänge 545 Nanometer angeregt wurden. Diese Nanokristalle können auf Einzelmolekülebene bei 30 Bildern pro Sekunde mit einer elektronenvervielfachenden CCD-Kamera leicht beobachtet werden.

Dieses Diagramm zeigt, dass die Anzahl der fluoreszierenden Partikel, die in jedem Einzelbild beobachtet werden, im Laufe der Zeit bei kontinuierlicher Anregung schwankt. Dies ist auf eine Kombination aus Blinken und photochemischer Degradation zurückzuführen. In den ersten sieben Minuten dominiert das Blinken, bevor langsam oxidative photochemische Degradation sichtbar wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Quantenpunkte chemisch synthetisiert, wie man sie in wässrige Puffer überführt und wie man sie für Anwendungen in der Bioimaging modifiziert. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Reagenzien, die Cadmium und Quecksilber enthalten, äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, um persönliche Exposition zu vermeiden.