Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszierende Quantenpunkte mit optimierter Helligkeit und Stabilität sowie minimierter Größe und unspezifischer Bindung für den Einsatz in der Einzelmolekül-Bildgebung herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine Cadmiumselenid-Quantenpunktkerne hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Kerne mit Quecksilber zu legieren, um ihre Fluoreszenz in das rote Spektrum zu verschieben und ihre Helligkeit zu erhöhen.

Als nächstes wird eine dünne Legierungshülle auf die Nanokristalle gezüchtet, um ihre Fluoreszenzemission zu stabilisieren. Der letzte Schritt besteht darin, diese Partikel aus organischen Lösungsmitteln in wässrige Puffer zu überführen, wobei ein mehrzähniges Polymer verwendet wird, das mit biologisch inertem Polyethylenglykol modifiziert werden kann. Letztendlich werden Fluoreszenzspektrometrie, Gelchromatographie und Gelelektrophorese verwendet, um zu zeigen, dass diese Partikel eine helle Fluoreszenz, eine kompakte hydrodynamische Größe und eine neutrale elektrostatische Ladung aufweisen, die sich gut für die Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung in der Biologie eignet.

Der Hauptvorteil dieser Quantenpunkte gegenüber bestehenden kommerziellen Materialien besteht darin, dass diese Nanopartikel eine deutlich verringerte hydrodynamische Größe aufweisen. Obwohl kleinere Quantenpunkte durch eine verringerte Fluoreszenzintensität, eine verminderte Fluoreszenzstabilität und eine Fluoreszenz nur im blauen Spektrum negativ beeinflusst werden, haben wir diese Effekte mit einem Quecksilber-Kationenaustauschverfahren ausgeglichen. Diese Nanokristalle können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Biophysik und der zellulären Signalübertragung zu beantworten, indem sie die dynamische Bildgebung einzelner Biomoleküle in überfüllten biologischen Umgebungen ermöglichen.

Bereiten Sie zunächst eine 0,4 molare Lösung von Selen zu, indem Sie Selen zu einem 50-Milliliter hinzufügen. Dreihalskolben, Evakuieren des Kolbens unter hohem Vakuum und Befüllen mit Argon unter Verwendung einer Sch-Schaftleitung unter luftfreien Bedingungen. Fügen Sie 10 Milliliter hinzu und erhitzen Sie es unter einstündigem Rühren auf 100 Grad Celsius, um eine klare, farblose Lösung zu erhalten.

Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und den Kolben beiseite stellen. Außerdem wird eine Lösung aus Cadmiumoxid TDPA und ODE in einem 250-Milliliter-Dreihalskolben unter Verwendung der im schriftlichen Protokoll aufgeführten Mengen hergestellt. Begleitend zu diesem Video evakuieren Sie die Lösung mit einer Schaftleitung unter Rühren.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 100 Grad Celsius und evakuieren Sie für weitere 15 Minuten. Um Verunreinigungen mit niedrigem Siedepunkt unter Argonnengas zu entfernen, erhitzen Sie das Gemisch eine Stunde lang auf 300 Grad Celsius, um das Cadmiumoxid vollständig aufzulösen. Die Lösung wechselt von einer rötlichen Farbe zu einer klaren und farblosen Farbe und kühlt die Lösung auf Raumtemperatur ab.

Als nächstes HDA zur Cadmiumlösung geben, auf 70 Grad Celsius erhitzen und evakuieren. Sobald ein konstanter Druck erreicht ist, erhöhen Sie die Temperatur und lassen Sie die Lösung 30 Minuten lang zurückfließen. Schalten Sie das Schlink-Leitungsventil auf Inertgas und setzen Sie das Thermoelement direkt in die Lösung ein.

Geben Sie unter luftfreien Bedingungen DPP in die Cadmiumlösung und erhöhen Sie die Temperatur auf 310 Grad Celsius. Verwenden Sie nun eine Einweg-Plastikspritze, die an einer 16-Gauge-Nadel befestigt ist, um 7,5 Milliliter der 0,4 molaren oberen Selenlösung zu entfernen. Sobald sich die Temperatur auf 310 Grad Celsius ausgeglichen hat, stellen Sie den Temperaturregler auf null Grad Celsius ein und injizieren Sie die obere Selenlösung schnell direkt in die Cadmiumlösung.

Die Lösung wechselt von farblos zu gelb und orange, und die Temperatur sinkt schnell und steigt wieder auf etwa 280 Grad Celsius an. Der schwierigste Schritt bei diesem Verfahren besteht darin, so schnell wie möglich das gesamte Volumen der Spritze in die Cadmiumlösung zu injizieren. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Partikel homogen keimen.

Nach einer Minute der Reaktion wird der Kolben aus der Heizhaube genommen und schnell mit einem Luftstrom abgekühlt, bis die Temperatur unter 200 Grad Celsius liegt. Wenn die Temperatur etwa 40 Grad Celsius erreicht, verdünnt mit 30 Millilitern Hexan, setzt sich der größte Teil des verbleibenden Cadmiumvorläufers aus der Lösung ab. Entfernen Sie diesen Niederschlag durch Zentrifugation.

In jedem der sechs konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen werden 12 Milliliter der resultierenden rohen Nano-Krystal-Lösung verdünnt. Mit 40 Millilitern Aceton nach der Zentrifugation mit den gleichen Parametern den Überstand vorsichtig dekantieren und entsorgen. Als nächstes lösen Sie die Nano-Krysttal-Pellets in Hexan auf.

Die Lösung wird mit dem gleichen Volumen Methanol extrahiert, wobei die obere Phase beibehalten wird. Wiederholen Sie diese Extraktion noch zweimal für die dritte Extraktion. Das Volumen von Methanol kann auf etwa 15 Milliliter eingestellt werden, um eine konzentrierte Hexanlösung aus reinen Cadmiumselenid-Quantenpunkten bei etwa 200 Mikromolar zu erhalten.

Die typische Ausbeute dieser Reaktion beträgt drei mikromolare Cadmiumselenidkristalle mit einem Durchmesser von zwei drei Nanometern, bestimmen den Nano-Krystal-Durchmesser und die Konzentration durch Messung des ultravioletten sichtbaren Absorptionsspektrums, wie in dem schriftlichen Verfahren beschrieben, die Nanokristalle können teilweise mit Quecksilber ausgetauscht werden, um die Rotverschiebung, die Absorption und die Fluoreszenzemission zu gewährleisten. Dazu in einem 20-Milliliter-Glasfläschchen mit Rührstab Hexan und Chloroform mischen, dann die Cadmiumselenid-Quantenpunktlösung OLA und Quecksilberoktan verletzen. Nach der Reinigung der Nanokristalle und der Bestimmung ihrer Konzentration, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, lassen Sie die Nanokristalle mindestens 24 Stunden lang bei Raumtemperatur altern, um das Schalenwachstum zu ermöglichen.

0,1 molare Schalenvorläuferlösungen in 50 Millilitern, Dreihalskolben unter Vakuumerhitzung von Lösungen aus Cadmiumvorläufer, Zinkvorläufer und Schwefelvorläufer für eine Stunde zum Rückfluss vorbereiten, um klare Lösungen zu erhalten, dann mit Argon in einen Dreihalskolben auffüllen. Fügen Sie das Topo ODE und die vorbereiteten Quecksilber-Cadmium-Selenid-Quantenpunkte hinzu. Evakuieren Sie das Hexin bei Raumtemperatur mit Hilfe der Flankenlinie.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 100 Grad Celsius und lassen Sie sie 15 Minuten lang zurückfließen. Tauschen Sie das Leitungsventil auf Argonnengas aus und setzen Sie das Thermoelement in die Nano-Krystal-Lösung ein. Nachdem Sie die Temperatur auf 120 Grad Celsius erhöht haben, fügen Sie 0,5 Monoschichten oder 140 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung hinzu und lassen Sie die Reaktion 15 Minuten lang ablaufen.

Erhöhen Sie die Temperatur auf 140 Grad Celsius. Fügen Sie 0,5 Monoschichten oder 140 Mikroliter Cadmiumvorläuferlösung hinzu und lassen Sie die Reaktion 15 Minuten lang laufen. Geben Sie dann 500 Mikroliter wasserfreies OLA in die Reaktionslösung.

Fügen Sie 160 Grad Celsius hinzu, fügen Sie 0,5 Monoschichten oder 220 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung hinzu, gefolgt von einer gleichen Menge Zinkvorläuferlösung bei 170 Grad Celsius mit 15 Minuten zwischen jeder Zugabe. Fügen Sie dann bei 180 Grad Celsius 0,25 Monoschichten oder 150 Mikroliter Schwefelvorläuferlösung und Zinkvorläuferlösung in 15-Minuten-Intervallen hinzu. Kühl. Die Lösung für Raumtemperatur und ein neuer Extinktionskoeffizient für diese Partikel.

Unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrums und unter der Annahme, dass sich die Anzahl der Nanokristalle nicht geändert hat, wird die Reaktionslösung als Rohmischung in einem Gefrierschrank gelagert. In diesem Stadium können die Nanokristalle mittels Elektronenmikroskopie, UV-Vis-Absorptionsspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie charakterisiert werden. Geben Sie gereinigte Quantenpunkte aus der Kernschale in einen 50-Milliliter-Dreihalskolben und entfernen Sie das Hexin unter hohem Vakuum.

Um einen trockenen Film zu erhalten, füllen Sie den Kolben mit Argonnen. Geben Sie wasserfreies Purin in den Nanopartikelfilm und erhitzen Sie die Aufschlämmung im Laufe von ein bis zwei Stunden auf 80 Grad Celsius. Die Nanopartikel lösen sich vollständig auf.

Geben Sie einen Milliliter eines FIO-Glycerins in die Lösung und rühren Sie zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie 0,5 Milliliter Triethylamin hinzu, um das Thioglycerin zu protonieren, und rühren Sie 30 Minuten lang. Die Lösung kann nach der Zugabe von Triethylamin aufgrund der schlechten Löslichkeit von polaren Nanokristallen in diesem Lösungsmittelgemisch trüb werden.

Die Quantenpunktlösung wird in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben, das eine Mischung aus 20 Millilitern Hexan und 20 Millilitern Aceton enthält, und gut vermischen. Isolieren Sie die gefällten Nanokristalle durch Zentrifugation, gefolgt von einer Pelletwäsche mit Aceton, lösen Sie das Quantenpunkt-Pellet in fünf Millilitern DMSO mit Badbeschallung auf und folgen Sie der Zentrifugation. Um mögliche Aggregate zu entfernen, bestimmen Sie anschließend die Nanopartikelkonzentration aus einem UV-V-Absorptionsspektrum.

Die Lösung aus reinen Quantenpunkten sollte innerhalb von drei Stunden verwendet werden, da die Oberfläche unter Umgebungsbedingungen an der Luft langsam oxidieren kann. Die Quantenpunktlösung wird mit DMSO auf 10 Mikromolare oder weniger verdünnt und in einen 50-Milliliter-Kolben überführt. Geben Sie eine vorbereitete Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter dilatierter Polyacrylsäure in DMSO tropfenweise unter Rühren zur Quantenpunktlösung und entgasen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Quantenpunkt-Polymerlösung mit Argonnen und erhitzen Sie sie 90 Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie ein gleiches Volumen von 50 Millimolar Natrium mit pH-Wert acht Tropfen hinzu und rühren Sie 10 Minuten lang. Reinigen Sie die Quantenpunkte, wie in dem schriftlichen Verfahren beschrieben, und bestimmen Sie die Konzentration aus einem UV-Vis-Absorptionsspektrum in einem Vier-Milliliter-Glasfläschchen mit Rührstab, mischen Sie ein Mol Quantenpunkte in Boratpuffer mit einem 40.000-fachen molaren Überschuss von 750 Dalton-Mono-Amino-Polyethylenglykol.

Im schriftlichen Verfahren finden Sie eine Anleitung, wie den Nanokristallen eine bestimmte chemische Funktionalität hinzugefügt werden kann. Geben Sie schnell einen 25.000-fachen molaren Überschuss einer frisch zubereiteten Lösung der Aktivierungsmittellösung in die Quantenpunktlösung und rühren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur um. Wiederholen Sie diesen Schritt noch viermal, um die Nanokrysttaloberfläche mit PEG zu sättigen.

Fügen Sie schließlich 200 Mikroliter eines molaren Tris-Puffers hinzu, um die Reaktion vor der Reinigung der Nanokristalle zu abschrecken. Unter Verwendung von Dialyse-Zentrifugalfiltern oder Ultrazentrifugation kann das resultierende Nanokristall mittels Flüssigkeitschromatographie, Gelelektrophorese und Fluoreszenzmikroskopie auf hydrodynamische Monodispersität und Oberflächenladung analysiert werden. Hier sehen Sie ein repräsentatives Absorptions- und Fluoreszenzspektren für Cadmiumselenid-Nanokristalle, Quecksilber, Cadmium, Selenid, Nanokristalle nach Cadionenaustausch und einen Kern Quecksilber-Cadmiumselenid, Schalencadmium und Zinksulfid-Nanokristalle nach dem Schalenwachstum. Die Kern-Cadmiumselenid-Nanokristalle haben eine Quantenausbeute von nahezu 15 %, dieser Wirkungsgrad sinkt jedoch nach dem Quecksilberaustausch auf weniger als 1 %, wahrscheinlich aufgrund von Ladungsträgerfallen, die durch die Zerstörung von Oberflächenatomen eingeführt werden.

Das Wachstum einer dünnen Hülle aus Cadmium-Zink-Sulfid steigert diesen Wirkungsgrad auf mehr als 70 %, der nach dem Transfer in Wasser weitgehend erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu verlieren Kern-Cadmiumselenid-, Schalencadmium- und Zinksulfid-Nanokristalle ohne Quecksilbereinbau einen erheblichen Teil ihrer Quantenausbeute an Wasser, es sei denn, es wird eine dicke Schale gezüchtet. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verkappung mit Cadmium-Zink-Sulfid die Spektren aufgrund des Austretens der elektronischen Ladungsträger in das Schalenmaterial ins Rote verschiebt.

Diese Verschiebung liegt bei etwa 20 bis 30 Nanometern für Cadmiumkerne im Kern und nimmt mit zunehmendem Quecksilbergehalt im Kern zu. Durch den Einbau von Quecksilber in den Kern-Nanokristall kann die geringe Größe des Nano-Krystal beibehalten werden, ohne die Helligkeit zu beeinträchtigen. Die geringe Größe wird in dieser transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme und der Partikelgrößenverteilung von Kern-Quecksilber-, Cadmium-, Selenid-, Schalencadmium- und Zinksulfid-Nanokristallen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 3,2 plus oder minus 0,6 Nanometern demonstriert.

Die Verwendung eines zweistufigen Phasentransfers auf Wasser ist entscheidend, um eine homogene Population von Nanokristallen zu erhalten, die keine weitere Größensortierung erfordert, um Cluster und Aggregate zu entfernen. Das hier abgebildete Chromatogramm bestätigt, dass die Größe der von Con-Albumin ähnelt. Bei 75 Kilodalton und nach Modifikation mit 750 Dalton Amino PEG erhöht sich die Größe auf nur noch 12 Nanometer, ähnlich der eines IgG-Antikörpers.

PEG-Modifikation neutralisiert die Oberflächenladung, wie im hier dargestellten Aros-Gelelektrophorese-Experiment bestätigt wurde, die Vertiefung ist mit einem Pfeil markiert und auf der rechten Seite sind Elektrodenpolaritäten angegeben, was zeigt, dass die Nanokristalle vor der Konjugation als onische Partikel wandern und dass die pegylierten Nanokristalle elektrostatisch neutral sind. Hier ist eine epi-fluoreszenzmikroskopische Aufnahme dieser Nanokristalle zu sehen, die auf einem gläsernen Deckglas abgeschieden und mit 545 Nanometern sichtbarem Licht angeregt wurden. Diese Nanokristalle lassen sich auf Einzelmolekülebene mit 30 Bildern pro Sekunde mit einer elektronenvermehrenden CCD-Kamera beobachten.

Dieses Diagramm zeigt, dass die Anzahl der fluoreszierenden Teilchen, die in jedem Bild beobachtet werden, im Laufe der Zeit mit kontinuierlicher Anregung schwankt. Dies ist auf eine Kombination aus Blinken und Fotoverschlechterung zurückzuführen. In den ersten sieben Minuten dominiert das Blinken, bevor sich langsam der oxidative Photoabbau bemerkbar macht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Quantenpunkte chemisch synthetisiert, wie man sie in wässrige Puffer überträgt und wie man sie für Bioimaging-Anwendungen modifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit cadium- und quecksilberhaltigen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Exposition gegenüber Personen zu vermeiden.