Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Hallo. In diesem Video stellen wir ein vollständiges Experiment zur Einzelquanten-Verfolgung vor. Ein spezieller Algorithmus wurde in enger Zusammenarbeit mit Experten für Bildverarbeitung am ISIS vollständig konzipiert. In diesem Video verwenden wir den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor als Modell, um die Methode dieser Technik zu beschreiben.

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein Transmembranprotein. Dieser Rezeptor wird mithilfe eines monoklonalen Antikörpers markiert, der so reduziert wird, dass nur noch das A a B Fragment verbleibt. Das A a B Fragment wird biotinyliert und anschließend an das Streptavidin des Quantenpunkts gebunden, sodass das Wandsystem den EGF-Rezeptor gezielt erkennen kann.

Unser Ziel ist es, einen umfassenden Überblick über die Dynamik von Zelloberflächenrezeptoren zu liefern. Tatsächlich können sich molekulare Trajektorien von der brownschen Diffusion dadurch unterscheiden, dass sie innerhalb von Nanodomänen eingeschränkt sind. Dies kann beispielsweise ein Hinweis auf eine zugrundeliegende Wechselwirkung mit Signalkomponenten oder molekularen Gerüsten sein.

Wir zielen darauf ab, derartige Ereignisse umfassend zu beschreiben, indem wir sie über die Zelle hinweg kartieren, was die Arbeit mit hoher zeitlicher Auflösung der SPECT zusammen mit hoher Markierungsdichte erfordert. Wir bezeichnen diesen Ansatz daher als Multi-Target-Tracing. Der erste Schritt des Experiments ist die Probenvorbereitung.

Wir arbeiten mit lebenden Zellen mit oder ohne Antibiotika. Hier verwenden wir sieben kosteneffiziente Zellen, die EGFR-Rezeptoren endogen exprimieren. Nach dem Lösen der Zelle müssen wir genau bestätigen, um die gleiche Anzahl an Zellen pro Vertiefung der Platte zu haben.

Eine genaue Anzahl von Zellen ist sehr wichtig, um die Vorhersagbarkeit der Anzahl pro Zelle gebundener Quantenpunkte zu erhöhen. Nach dem Verteilen der Zellen in die Vertiefung müssen Sie die Kultur 24 Stunden bei 37 Grad und 7 % CO2 inkubieren. Der nächste Schritt ist die Herstellung von mit Antikörpern gekoppelten Quantenpunkten. Quantenpunkte sind kleine fluoreszierende Nanopartikel.

Diese Partikel sind hier von großem Interesse, da sie im Vergleich zu klassischen fluoreszierenden Farbstoffen und Signalen sehr hell und stabil sind. Das Signal-Rausch-Verhältnis ist für diese Art von Experiment sehr wichtig. In diesem Fall verwenden wir komplettes Medium, um die Bindungsstellen um die Quantenpunkte herum zu saturieren und Aggregation zu verhindern.

Danach stellten wir die Quantenpunkte im bioTE in ein Verhältnis von eins zu eins mit dem gewünschten Protein oder Antikörper her, um statistisch mehr einwertige Quantenpunkte zu erhalten. In diesem Experiment verwenden wir ein im Labor aus monoklonalen Antikörpern hergestelltes F(ab')₂-Fragment gegen den EGF-Rezeptor, das mit Biotin markiert ist. Während der Inkubation von etwa 15 Minuten können Sie die Kontrolle hinsichtlich Aggregation und Homogenität durch Schütteln bei 1.200 Umdrehungen pro Minute und 25 °C aufrechterhalten.

Wenn die Mischung bereit ist, können Sie sie Ihren Zellen hinzufügen. Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus der Vertiefung, um eine Ablösung der Zellen zu vermeiden, und geben Sie die für Ihr Experiment benötigte Menge der Mischung hinzu. In diesem Fall werden wir 100 Mikroliter Mischung pro Vertiefung hinzufügen.

Nach Zugabe des Gemischs können Sie Ihre Zellen 15 Minuten lang inkubieren. In diesem Fall bei 37 Grad mit 7 % CO2. Nach dieser Inkubation können Sie eine hohe Anzahl häufig auftretender Doppel-Punkte in Suspension im Medium finden.

Diese Quantenpunkte sollten vor der Bildgebung entfernt werden. Aufgrund des von uns verursachten Rauschens müssen wir jedes Mal – in diesem Fall mehrmals, also insgesamt fünfmal – gründlich waschen.

Verwenden Sie ein bildgebendes Medium ohne Autofluoreszenz. Hier verwenden wir HBSS-Puffer mit aps. Jetzt sind Ihre Zellen bereit.

Es ist Zeit, zum Aufbau für die Aufnahme überzugehen. Der Aufbau besteht aus vier Hauptteilen: einem invertierten Mikroskop, einer Kamera mit empfindlichem Sensor für Licht, einer leistungsstarken Quecksilberlampe und einem Inkubator, um die Zellen bei 37 Grad zu halten. Das Licht der Quecksilberlampe durchläuft eine Faser und ein Filterrad, bevor es die Probe beleuchtet.

Die Fluoreszenz der Probe wird gefiltert und von einer E-M-C-C-D-Kamera links gesammelt. Derzeit verwenden wir Objektive mit einer numerischen Apertur von 1,3 und 1,49 mit Öl-Immersion. Der zentrale Schritt dieses Experiments ist die Aufnahme selbst.

Sobald die Zellen scharfgestellt sind, betrachten wir eine repräsentative Zelle mit starker Markierung. Bei Quantenpunkten nehmen wir zunächst ein Einzelbild im durchgehenden Weißlicht auf, das später zur Überprüfung des Zellaspekts und der speziellen Grenze der LA-Podien verwendet werden kann. Anschließend nehmen wir ein Video typischerweise mit einer Rate von 36 Millisekunden auf, der schnellsten Rate, die im Vollbildmodus möglich ist.

Wir verwenden eine elektronenvervielfachende CCD-Kamera, um bei ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 20 Dezibel Einzelmolekül-Empfindlichkeit zu erreichen. Typischerweise erwerben wir bei etwa 25 Dezibel 300 Bilder. Um einen bestimmten Datensatz auszuwerten, müssen Sie lediglich den Pfad zu dem Verzeichnis angeben, das die Videodateien enthält.

Dann geben Sie den Befehl ein, wodurch der Text in MetLab oder dem Befehl MTT 23 I erneut verbunden wird, der zunächst eine grafische Benutzeroberfläche mit Auflistung anzeigt. Alle verwendeten Parameter starten die vollständig automatisierte Analyse. Die Kern-MTT-Analyse wird für jeden Einzelbildschritt durchgeführt und ruft dabei drei Hauptaufgaben auf: zunächst die Detektion für jedes Pixel hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer Ziel-Quantenabweichung.

Danach erfolgt für jede Detektion die Schätzung der relevanten Parameter des Zielobjekts, wie beispielsweise seine Pixelposition, Signalintensität und so weiter. Zuletzt die Wiederverbindung der neuen Zielobjekte mit den Spuren, die bereits in den vorherigen Bildern für jedes Pixel erstellt wurden.

Unter Betrachtung einer lokalen Teilregion vergleichen wir zwei Hypothesen über das Vorhandensein entweder lediglich von Rauschen oder eines Signals. Mit der Punktverbreiterungsfunktion weist ModuLite einen Hin-Peak auf. Wir verwenden eine Schwelle, die sicherstellt, dass die Zahl falscher Alarme gering genug ist, mit weniger als einem Fehlalarm pro erkanntem Ziel und Bildrahmen.

Anschließend führen wir eine kleinste-Quadrate-Ghost-Nährstoff-Fußanalyse durch, um Breite und Höhe der Position der detektierten Goshen zu schätzen. Dies liefert insbesondere die Spitzenzellposition des Farbstoffs, typischerweise mit einer Genauigkeit von etwa 10 bis 20 Nanometern. Bei typischen Signal-Rausch-Verhältnissen können sich die Peaks bei hoher Dichte oft zu stark annähern, wobei stärkere Peaks schwächere behindern können. Daher entzerren wir die detektierten Peaks aus dem ursprünglichen Bildlauf.

Auch hier kann die Detektion auf dem Residuum typischerweise etwa 10 % der Peaks erneut erfassen. Eine nahezu vollständige Detektion ist sehr vorteilhaft für eine genaue Wiederverbindung. Anschließend wird die Menge der neuen Zielstrukturen mit der Menge der vorherigen Spuren für diesen Pupillenbereich abgeglichen.

Um jeder Spur nach Möglichkeit ein Ziel zuzuweisen und mögliche Blinkphänomene zu berücksichtigen, nutzen wir sämtliche verfügbaren statistischen Informationen, die aus dem Detektionsschritt gewonnen wurden. Daher werden Ziele nicht einfach der nächstgelegenen Spur zugeordnet. Im Falle von Konflikten, wenn sich Spuren kreuzen können, was bedeutet, dass sich die jeweils relevanten Forschungsregionen überlappen, berücksichtigen wir die statistischen Werte der Intensität, Geschwindigkeit, Breite und des Blinkverhaltens sowohl für die Spuren als auch für die Ziele.

Dies liefert die statistisch optimale Wiederverbindungsbewertung. Die Strategie ermöglicht es, wenn möglich, eine Verzerrung der Wiederverbindung hin zu den nächstgelegenen Nachbarn – also zur langsameren Bewegung – zu vermeiden. Anschließend verwenden wir eine Funktion, um mögliche vorübergehende Einschränkungen innerhalb der Trajektorien zu bewerten.

Diese Funktion steht in umgekehrtem Verhältnis zur lokalen Diffusion, wie von Sexton Simpson und Mitarbeitern gezeigt wurde. Durch Anlegen einer Schwelle lässt sich bestimmen, ob es sich um Phasen der Einschränkung handelt oder nicht. Durch Iteration über alle Spuren können wir schließlich die Membrandyamik in Bezug auf vorübergehende Einschränkungen und Hinweise auf Verlangsamung kartieren, und dies kann dargestellt werden.

Alternativ führt MTT anhand der binären oder diskreten Werte dieses Einschlussindex standardmäßig diese Aufgaben automatisch durch und speichert für jedes Video die Zeilenparameter für jeden Peak in einer eski-Datei zur weiteren detaillierten Analyse. Typische Ergebnisse wie die Spurenkarte über jeder Zelle sowie Diagramme und Histogramme für Parameter von Interesse – beispielsweise Peakintensitäten, Signal-Rausch-Verhältnis und lokale Defizitwerte – können ebenfalls problemlos an jede spezifische Untersuchung angepasst werden. In diesem Video werden nun typische mit MTT erzielte Ergebnisse zusammengefasst.

Ein wesentlicher Teil der Arbeit besteht in der Ausarbeitung des Algorithmus, der möglicherweise an spezielle Untersuchungen wie Bewegungsarten unter Stress oder Wechselwirkungen angepasst werden muss. Das Ausführen von MTT ist jedoch sehr einfach. Die Nutzer müssen lediglich einige Parameter wie die räumlichen und zeitlichen Grenzen optimieren.

Bei der Entwicklung von MTT verfolgten wir das Ziel, die analytischen Optionen für jede Aufgabe vollständig neu zu überdenken. Wir optimieren den Prozess entlang zweier anspruchsvoller Achsen. Erstens, der Umgang mit hohen Dichten, um die bestmögliche räumliche Information über die Oberfläche zu erhalten, und zweitens, die Handhabung eines geringen Signal-Rausch-Verhältnisses, was typischerweise die Arbeit bei geringer Elimination und hoher Geschwindigkeit ermöglicht; Einschränkung kann als Signatur einer zugrundeliegenden Wechselwirkung interpretiert werden.

Membranrezeptoren können beispielsweise mit dem submembranösen Cytoskelett oder pro-lipidären Domänen interagieren. Solche Ereignisse können durch räumliche und zeitliche Variationen der Einschränkung untersucht werden. Dynamische Messungen können mit komplementären Ansätzen wie FRAP, FCS oder Freita verglichen werden.

Der Open-Source-Code steht für akademische Forschungszwecke zur Verfügung. Er kann von unserer Webseite unter CML dot univ if an S fr auf der Seite unseres Teams heruntergeladen werden, wo ein entsprechender Download-Link bereitgestellt wird. Interessierte Industriepartner sind ebenfalls eingeladen, mit uns Kontakt aufzunehmen.

Wir möchten uns insbesondere bei den Mitgliedern unseres Teams und der gemeinsamen Einrichtungen für die Unterstützung und die fruchtbaren Diskussionen bedanken. Dieses Projekt wird durch Fördermittel des CNRS in c MAA University Pac Region National de La finanziert, und die Stiftung Medical wird durch den Ligakontrolleur unterstützt. Vielen Dank fürs Zuschauen.