Name: Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Lernen Sie Multiple-Target Tracing zur Kartierung molekularer Diffusion in der Plasmamembran. Dieser Algorithmus verfolgt einzelne Quantenpunkte in lebenden Zellen und liefert präzise Einblicke in Nanodynamik.

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Wir bedanken uns bei Mitgliedern unseres Teams, vor allem MC Blache für technische Unterstützung, sowie M-und B-Irla Imhof, für ihre Unterstützung und fruchtbare Diskussionen. Zahlen für Deflation und Entbindung reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Nature Methods. Dieses Projekt wird von institutionellen Zuschüssen aus dem CNRS, INSERM und Marseille-Universität, und durch gezielte Zuschüsse aus der Region Provence-Alpes-Côte d&#39;Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR unterstützt-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) und der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wird durch ein Stipendium der Ligue Nationale Contre le Cancer unterstützt.

In diesem Video stellen wir eine vollständige Single Particle Tracking Experiment, mit Hilfe von Quanten-Dots gezielt an eine bestimmte Membran-Rezeptor. Das Hauptziel dieser Versuch besteht darin, diskriminierende verschiedene molekulare Diffusion Verhalten in der Plasmamembran von lebenden Zellen gemessen. Tatsächlich können molekulare Bewegungen, die durch an der Membran typischerweise Brownsche Diffusion abweichen, die linear gerichteten oder geschlossenen in Nanodomänen 26-29, zum Beispiel. Wir zielen darauf ab, gleichzeitig nach so vielen Rezeptoren wie technisch möglich, um einen Schnappschuss von der Vielfalt, die sich in der Dynamik, die innerhalb der Membran einer lebenden Zelle liefern. Dies wird letztlich zu erwarten, damit Entschlüsselung der Mechanismen, die Zelloberflächen-Rezeptor-Signalisierung. 1. Cell Culture <ol><li> Bereiten Sie die zelluläre Probe: verwenden adhärenten COS-7-Zellen, die endogen exprimieren den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) 30. WannArbeit mit lebenden Zellen ohne Antibiotika sicher kein latentes Sub-nachweisbare Verunreinigungen durch Verwendung geeigneter steriler Techniken zu jeder Zeit während der Vorbereitung haben zu machen. </li><li> Kultivieren von Zellen in vollständigem Medium (DMEM mit 10% Kälberserum, 1% Glutamin, 1% HEPES und 1% Natriumpyruvat, siehe Tabelle Reagenzien unten), bei 37 ° C mit 7% CO 2, wobei dafür, dass sie haben subkonfluenten, exponentielles Wachstum bevor sie sich ihnen in Lab-Tek. </li><li> Am Tag vor dem Versuch, zu verbreiten 5.000 Zellen / Well in 8-well Kammern (Lab-Tek) und über Nacht. Zählen von Zellen sorgt für eine konstante Zelldichte, damit eine reproduzierbare Verhältnis von Quanten-Punkten pro Zelle. </li></ol> 2. Zellmarkierung Bereiten Quanten-Punkte mit einer speziellen Beschichtung. Quantum-Dots sind fluoreszierende Nanopartikel von Halbleitern. Diese Nanopartikel stellen eine hohe Interesse, da sie sehr hell und photostabil sind im Vergleich zu klassischenFluoreszenzsonden 31,32, die Erreichung eines entsprechenden Signals erlaubt es, Rauschabstand (SNR) für Single Molecule Imaging. <ol><li> Vor dem Experiment, Fab-Fragmente zu erzeugen gegen EGFR aus Hybridom-Zelllinie (mAb 108, ATCC HB-9764), durch Verdau mit Papain, wie zuvor 21 beschrieben. </li><li> Konjugat Fab mit Biotin, als den Anweisungen des Herstellers (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylierungskit; Thermo Scientific, 1A.). </li><li> Verwendung Quanten-Punkte mit Streptavidin (Invitrogen) und Emission bei 605 nm (optimale Emissionswellenlänge für Glanz, Detektion und Abtrennung von zellulären Autofluoreszenz) funktionalisiert. </li><li> Bereiten Sie die Lösung zur Kennzeichnung in vollständigem Medium (siehe Tabelle der Reagenzien), um die vorliegenden Streptavidine um die Quanten-Punkte sowie eine Aggregation und nicht-spezifische Bindung an die Zellen und auf das Deckglas zu verhindern sättigen. </li><li> Bereiten Sie zwei Zwischen-Lösungen:ein mit Quantum-Dots-Streptavidin und ein weiteres mit biotinylierten Fab, jeweils bei 20 nM. </li><li> Mischen Sie das gleiche Volumen dieser beiden Lösungen: Mischen Sie die Quantum-Dots mit Fab im Verhältnis 1:1 in eine finale Arbeitsdatei Konzentration von 10 nM Fab erhalten: Quanten-Punkte-Komplex. Verwendung einer äquimolaren Verhältnis begünstigt die Bildung von Mono-funktionalisierten Komplexen eines Quantenpunkt-und einem biotinylierten Fab-Fragment besteht. Dies begünstigt monovalenten Kennzeichnung, die Begrenzung Artefakt Beobachtungen durch Rezeptor-Vernetzung 33,34. </li><li> Inkubieren für 15 Minuten bei 25 ° C unter Verwendung eines Schüttler bei 1.200 Umdrehungen pro Minute eine Aggregation zu verhindern. Die Mischung ist dann bereit, auf lebende Zellen zu verwenden. </li><li> Inkubieren Zellen in 100 ul-Mix für 5 Minuten bei 37 ° C mit 7% CO 2. </li><li> Waschen der Zellen mit nicht-Autofluoreszenzlichtbild Bilderzeugungsmedium (HBSS-Puffer, 1% HEPES, siehe Tabelle der Reagenzien) bei 37 vorgewärmt ° C </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige von Etiketten zu verhindern UN-notwendig verderben das SNR um ungebundene, unscharf Quanten-Punkte, indem sie ausführlich Waschen jeder Vertiefung mit Bilderzeugungsmedium, typischerweise 5 mal bei Raumtemperatur mit mindestens 5 Minuten Verzögerung vor dem letzten Waschen. </li></ol> 3. Optischer Aufbau Die Video-Mikroskopie-Setup besteht aus vier Hauptteilen: <ol><li> Mithilfe eines inversen Mikroskops mit einem spezifischen Fluoreszenz-Würfel (FF01-457/50 Anregung, FF495-DI02 dichroitische und FF01-617/73 Emissionsfilter, Semrock) und einer hohen numerischen Apertur (1,3 oder 1,49) Öl-Immersions-100x Objektiv. </li><li> Ein 100-W-Quecksilberlampe (die mit dem Mikroskop durch eine optische Faser, die Vermeidung stören Thermoregulation). </li><li> Ein 512 x 512 Pixel hohe Empfindlichkeit EMCCD-Kamera, einen ausreichenden SNR zu erreichen. </li><li> Ein Inkubator für biologische Proben bei 37 ° C zu halten während des Experiments. </li></ol> 4. Erwerb <ol><li> Wählen Sie isolierten und gut Ausbreitung Zellen. Diesbegünstigt die Verlängerung der schönen, flachen Lamellipodien, am besten geeignet, für planare Bewegung der Membran Moleküle aussehen. </li><li> Bewerten Sie die zellulären physiologischen Status durch sein Aussehen sowohl im Durchlicht und Fluoreszenz-in: intensiv vesikulären Verkehr, das Fehlen von nekrotischen oder apoptotischen Zeichen, geringe Autofluoreszenz und mittlere-starke Quantenpunkt-Kennzeichnung (in der Regel bis zu 1.000 Quanten-Punkten pro Zelle, siehe Abb.. 1B, C). </li><li> Wählen Sie einen hohen Dichte Kennzeichnung, die entscheidend zur simultanen Überwachung so viele Rezeptoren wie möglich ist. Dies ist tatsächlich sowohl durch physiologische (Oberflächenexpression, Epitop Zugänglichkeit, seitliche Bewegung) und algorithmischen Parameter (nicht-überlappenden Point-Spread-Funktionen (PSF), auch unter Berücksichtigung der Unschärfen durch Bewegung, um die ordnungsgemäße Erfassung und Wiederverbindung zu erlauben). Begrenzt </li><li> Für jede Zelle wird zunächst einen Hellfeld-Feld-Bild (vorzugsweise unter Verwendung von DIC, wenn verfügbar), die weitere Überprüfung zulassen kann für die Zelle Aspektund räumlichen Grenzen des Lamellipodien. </li><li> Speichern Sie das Bild mit dem gleichen Namen wie die Video-Stapel (wie cell1.tif &amp; cell1.stk zum Beispiel), in einen Unterordner namens DIC, da mit diesen Konventionen, kann der Algorithmus automatisch zurück finden das passende Bild für jeder Stapel. </li><li> Erwerben Sie 1 bis 3 Videos pro Zelle, kontinuierlich, typischerweise bei 36-ms-Rate, die schnellste Geschwindigkeit, die in Full-Frame mit dieser Kamera. Allerdings kann man bei höheren Frequenzen zu erwerben, bis zu 1-ms-Rate, mit dedizierten CCD-Sensor mit erhöhter Empfindlichkeit und / oder weniger Pixel. Die Frame-Transfer-Technologie bietet vernachlässigbare Verzögerung zwischen Frames. </li><li> Electron mehrfach Erweiterung sollte immer bei maximaler (knapp unterhalb der Sättigung, wenn relevant) gesetzt werden, damit erreicht einzelnes Molekül Empfindlichkeit, mit einem ausreichenden SNR, zumindest oberhalb von 20 dB (Peak-Erkennung für eine effiziente 1), in der Regel etwa 25-30 dB. </li><li> In der Regel erwirbt 300 Bilder pro Video, sinCE-Bahnen werden über ~ 100 Frames im Schnitt, meist durch lange blinken Ereignisse beschränkt rekonstruiert. Video Häufigkeit und Länge kann für eine bestimmte Maßnahme, die mehr Spuren zum Beispiel verlangen, angepasst werden konnten. </li></ol> 5. MTT-Analyse <ol><li> Wählen Sie den Pfad zu dem Verzeichnis, das die Video-Dateien, um eine bestimmte Datenmenge mit Matlab oder Octave zu bewerten. </li><li> Um die vollautomatische Analyse 1,35 zu starten, geben Sie den Befehl detect_reconnex23 in Octave, oder MTT23i in Matlab. Dieses Programm steht für &quot;Version 2.3, mit User-Interface&quot; und steht zum Download bereit, zusammen mit der Vorgängerversion 2.2. Es zeigt zuerst ein grafisches Interface, in dem alle Parameter verwendet, wie in Abb. 2. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse MTT automatisch analysiert jedes Video-Recorder, um Spuren von erkannt und geschätzt, Ziele, durch weitere ergänzt liefern inchungen, wie Einschluss Detektion. Dies ermöglicht letztendlich Mapping Spuren über Zell-Bilder (Abb. 1C und 3). MTT-Beschreibung Der Kern MTT Analyse wird über jeden Rahmen durchgeführt unter Berufung auf drei Hauptaufgaben (Abb. 3): <ol><li> Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Ziels (Quantenpunkt-), innerhalb eines gleitenden Teilbereich nacheinander um jedes Pixel zentriert ist, wobei zwei Hypothesen verglichen: Gegenwart entweder eines Signals, mit dem PSF als zweidimensionale Gauß-Peak modellierte , oder nur Lärm, unter Verwendung eines Schwellenwertes versichern niedrig genug Fehlalarm, mit weniger als einem unechten Erkennung pro Frame. Dies führt zu einer Karte Detektionswahrscheinlichkeit. Jede lokale Maximum ergibt, als mögliches Zielgen erlaubt, sichergestellt wird, dass die Wahrscheinlichkeit höher als ein Mindestwert, richtet sich nach der gewünschten Wahrscheinlichkeit eines falschen Alarms (PFA) ist. Diese Grenze ist tief genug, um effizient zu diskriminieren SIGSignale vom Rauschen und vermeidet bestenfalls falsche Erkennungen (PFA von 10 -6 standardmäßig auf weniger als ein Fehler in 512 x 512 Pixel Bilder zu versichern), während immer noch eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit der Aufdeckung und erreichte damit den theoretisch vorhergesagten optimalen ein. Beachten Sie, dass das Erfordernis der Verwendung eines Teilbereich bedeutet, dass die Bildränder (3 Pixel, für eine Standard-Fenster von 7 x 7 Punkte) nicht ausgewertet werden kann. </li><li> Schätzung für jedes detektierte Ziel, der relevanten Parameter, wie Subpixel-Position und der Signalintensität. Für jedes detektierte Ziel wird eine Methode der kleinsten Quadrate Gauß-Newton-Sitz nächsten durchgeführt, um die Position, Breite und Höhe des detektierten Gauß zu schätzen. Dies stellt insbesondere die Subpixel-Position des Farbstoffs (10 bis 20 nm Genauigkeit für typische SNR-Werte und unbeweglich und langsam diffundierende Farbstoffe, jedoch bis zu ~ 100 nm für Farbstoffe Diffundieren bei 0,1 um 2 / s). </li><li> Reconnection der neuen Ziele mit derSpuren bereits in den vorangegangenen Frames aufgebaut. Die Reihe neuer Ziele mit dem Satz von vorhergehenden Spuren abgestimmt. Zu diesem Zweck, um jedes Ziel eine Spur zuzuordnen, wenn möglich, alle erhältlich statistischer Information zur Detektion Schritt verwendet wird, nicht nur die Position, sondern auch die Intensität, Breite, zu blinken, und die zugehörigen Statistiken. Daher werden Ziele nicht nur auf die nächste Spur zugewiesen: im Falle von kreuzenden Spuren, Intensität, Geschwindigkeit, Breite und blinkende werden berücksichtigt. Dies liefert die statistisch optimale Wiederanschluss des Gastes. Diese Strategie vermeidet, wenn möglich, das Vorspannen des Wiederverbindung zu den nächsten Nachbarn. </li></ol> Detektierten Peaks können im Nachhinein abgelehnt werden, wenn ihrer Einschätzung oder Wiederverbindung scheitert sein. Eine besondere Prüfung übernimmt die Erkennung von neuen Spitzen, die neue Spuren zu initiieren würde. Dieser Test verwendet eine strengere PFA (10 -7), da Sie wieder eine Spitze, um eine Spur können de facto als Bestätigung interpretiert werden o<html> f seine Relevanz (dieses Kriterium als per Definition nicht anwendbar für neue Peaks). Trajektorienanalyse Mögliche vorübergehende Entbindung nächsten durch eine Funktion umgekehrt proportional zur lokalen Verbreitung 24-29 im Zusammenhang ausgewertet. Die Anwendung ermöglicht einen Schwellenwert zu definieren, beschränkt oder nicht Episoden. Durch diese Iteration über alle Spuren, können wir abbilden Membran Dynamik im Hinblick auf die vorübergehende Haft / verlangsamen Veranstaltungen. Dies kann alternativ dargestellt werden entweder mit dem Binär-oder diskrete Werte dieser Beschränkung Index. Standardmäßig MTT diese Aufgaben automatisch und spart 8 Peakparameter in einer Textdatei: Frame-Nummer, Offset-i und j Position, Signalstärke, den Radius und blinken, für jeden Video-Frame (Gruppe von 7 Zeilen) und Spurenelemente (Spalte) . Diese Ausgabeparameter kann in Matlab oder Octave mit dem fread_data_spt Skript für die weitere Analyse dh Spuren oder Signalintensitäten geladen werden, wie in der beispielhaft<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example Skript im Anhang. Weitere Analysen führen zu Spuren in jeder Zelle zugeordnet werden (Abb. 1C und 3) und Histogramm-Verteilung für die relevanten Parameter (wie zB Peak-Intensitäten, SNR oder lokale Diffusion Werte) zu schaffen. Für jede Datei, Mittelwert und Standardabweichung der einzelnen Parameter werden in einer Textdatei gespeichert, zusammen mit einem Bild der Histogramme. Logarithmisch-Distributionen, wie zum Quadrat Verschiebungen R 2, auf geometrische Mittel führen. Der Diffusionskoeffizient D wird aus einer linearen Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD-Kurve berechnet. Diese Werte geben einen Überblick über ein Experiment mit zum Beispiel Kinetik der zellulären Reaktionen oder pharmazeutische / enzymatische Behandlungen beeinflussen Membran Organisation. Da MTT ist ein Open-Source-Code, kann dieser Aspekt ohne weiteres auf jeden engagierten Untersuchung angepasst werden. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Überwachung Membranrezeptoren Dynamik MTT. (A) Membrankomponenten, wie EGFR, sind markiert mit Quanten-Punkten gekoppelt ist, um biotinylierte Fab-Fragmente (schematische Zeichnung mit annähernd richtig Skalierung jedem Molekül). (B) Typische fluoreszierende Bild von einer Live-COS-7 Zelle erworben, mit 36-ms Belichtungszeit, Darstellung beugungsbegrenzten Peaks, die individuell beschriftet Rezeptor. (C) Ausgang des MTT-Analyse zeigt die rekonstituierte Bahnen der Rezeptoren auf der Hellfeldbild der Zelle überlagert. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. MTT Eingabeparameter. Laufen MTT23i öffnet eine grafische Benutzeroberfläche listet alle Input-Parameter, Namen und Standardwerte, wie in unseren früheren Publikation 1 beschrieben. In den Algorithmus, Raum und Zeit Parameter (Suchfenster, Spitzenradius, maximale Verbreitung<html> und blinkend) sind in dimensionslosen Standard-Einheiten, Pixel und Rahmen. Kalibrierungen können im Nachhinein zu Ausgabeergebnisse umwandeln angewendet werden. Default-Werte, entsprechend einer Cascade 512BFT mit 100-facher Vergrößerung, sind Pixel-Größe: 156 nm / pxl und Frame-Verzögerung: 36 ms / Frame. Die Ermittler sollten die Optimierung ein paar kritische Parameter, wie zB der maximal zu erwartenden Diffusionskoeffizienten (&quot;Diff max&quot;) und einem maximalen blinkt Verschwinden (&quot;T off&quot;). Diese beiden Raum und Zeit Limits sind fast die einzigen, die zu überdenken für einen bestimmten experimentellen Bedingungen, die anderen nach robusten Standardwerte werden gesetzt werden müssen. Zum Beispiel wird die Anzahl von Fehlalarmen direkt auf weniger als einem Fehler pro Millionen Pixel, so dass weniger als einmal pro Frame, was zufriedenstellend in den meisten Fällen zu gewährleisten. Alle Parameter werden in einer Textdatei in der Ausgabe-Ordner gespeichert, so dass Anwender im Nachhinein zu überprüfen, welche Einstellungen wurden für die Analyse verwendet. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Bild 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Wichtige Schritte des MTT-Analyse. Ausgehend von einem Stapel von experimentellen Fluoreszenzbilder werden Peaks nacheinander und automatisch erkannt, geschätzt durch eine Gauß-Sitz und wieder über Rahmen (erste Reihe von Operationen, oberen Teil des Flussdiagramms). Die Spuren können weiter nach möglichen Einschluss untersucht werden, zum Beispiel, was letztlich zu einer dynamischen Karte von relevanten Deskriptoren (zweite Reihe von Operationen, unterer Teil). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Labeling Wertigkeit hat keinen Einfluss auf MTT. Um die mögliche Voreingenommenheit durch artifizielle multivalenten Kennzeichnung eingeführt zu bewerten, wurde MTT-Analyse durchgeführt, um endogenen EGFR getaggt mit 2 verschiedenen Systemen, zur Generierung und Analyse von Trajektorien Karten zu verfolgen. (A)-Rezeptoren wurden mit biotinylierten Fab und Quanten-dots605-Streptavidin markiert, wie im Protokoll beschrieben.In diesem Fall kann die Multi-Quanten-Wertigkeit von Punkten und Streptavidine in Kopplung mehrerer Rezeptoren an einen einzigen Farbstoff führen. (B)-Rezeptoren wurden mit Fab direkt mit einem organischen Farbstoff, ATTO647N gekoppelt ist markiert. In diesem Fall kann man Fab, damit ein Rezeptor, um mehr als einen Farbstoff gekoppelt sein. (C) mittleren quadratischen Verlagerung (MSD)-Kurve für alle Spuren für jede Zelle berechnet wurde, entweder mit Quantenpunkt-Farbstoffe oder Atto (links und rechts Graphs, jeweils) markiert. Diffusionskoeffizienten wurden durch lineare Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD (rote gepunktete Linie) berechnet. Jedes Schema der Kennzeichnung führten zu ähnlichen Werten Diffusion (Zentral Grafik). Qdot: Quanten-dots605 (n = 5 Zellen), Atto: ATTO647N (n = 7 Zellen), ns: nicht signifikant (Student t-Test p-Wert&gt; 0,05).

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<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In Einzelpartikel-Tracking, neben den Zellen und Mikroskopie Aspekte stellt die Analyse einen wesentlichen Teil der Arbeit. Diese befasst sich mit der Algorithmus verwendet, um die drei wichtigsten Aufgaben: Erkennen, Abschätzen und wieder Gipfeln über jeden Frame. Aber die konsequente Aspekt dieser Arbeit besteht in der Erarbeitung des Algorithmus selbst, die müssen für jede neue dedizierte Untersuchung, im Wesentlichen für den letzten, zusätzliche Schritte (wie Entschlüsselung Arten der Bewegung, Interaktionen oder St...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Menge </td></tr><tr><td> Cos-7-Zelllinie </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5000 Zellen / Well </td></tr><tr><td> HBSS ohne Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-Well Lab-Tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Biotinylierten Fab (Fab für Synthese, siehe Referenz 21) </td></tr><tr><td> Fab aus mAb 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 ug </td></tr><tr><td> NHS-Biotin<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 pg </td></tr><tr><td colspan="4"> Komplett Medium </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Bilderzeugungsmedium </td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 ul </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-TE2000U </td></tr><tr><td> Leuchtstofflampe </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA 100x Objektiv </td><td> Nikon </td><td> Plan Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1,49 NA 100x Objektiv </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Kamera </td><td> Roper Scientific </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Thermostatisiert Box </td><td> Life Imaging Dienstleistungen </td><td> The Box </td></tr></tbody></table> Anhang: Auszug aus einem Skript von MTT ergänzende Analyse Funktion MTT_example (Dateiname) %%% Basic-Beispiele, die zeigen, wie man MTT Ausgabeergebnisse erholen %%% Zu plotten jede trace und um das Histogramm zu bauen %%% Der Fluoreszenzintensitäten wenn nargin &lt;1% kein file_name zur Verfügung gestellt? Dateien = dir (&#39;* stk.&#39;); wenn IsEmpty (Dateien), disp (&#39;keine Daten im aktuellen Verzeichnis&#39;), Rückkehr, Ende . file_name = Dateien (1) Name;% default: stk erste Datei disp ([&#39;mit&#39; datei &#39;standardmäßig&#39;]) Ende file_param = [Dateiname &#39;_tab_param.dat&#39;];% Ausgabe-Datei %% Laden von Daten cd (&quot;output23 &#39;)% oder (&#39; output22 &#39;), je nach Ausführung verwendet % Haftungsausschluss: Version 2.2 erzeugt nur 7 Parameter, % Ein zusätzlicher Parameter, Lärm, wurde in Version 2.3 hinzugefügt % Um alle Parameter auf einmal zu lesen, in einer einzigen Tabelle % = Tab_param fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (2:8: end, :); tab_j = ... % Um alle Parameter (außer frame_number) in separaten Tabellen lesen % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);% Index ist 3, weil Trace-Nummer und Rahmennummer, nicht informativ, verworfen werden! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); %% Schleife über Spuren N_traces = size (tab_i, 1); % Tabellen sind N_traces Linien durch Spalten N_frames für ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0;% nicht blinken Schritte nur Grundstück (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (Pixel)&#39;), ylabel (&#39;J (Pixel)&#39;) title ([&#39;trace #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;Bitte treffen Sie eine beliebige Taste für die nächste Spur &quot;), Pause Ende %% Fluo Histogramm N_datapoints = SUMME (tab_blk (:)&gt; 0);% nicht blinken Schritte nur hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% mit 2sqrt (N) Bins xlabel (&#39;Intensität (au)&#39;), ylabel (&quot;Ereignis&quot;) title (&#39;Histogramm der Partikel Fluoreszenzintensität&#39;)

mapping molekulare diffusion in der plasmamembran durch multiple-target tracing (mtt)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Unser Ziel ist eine umfassende Beschreibung der molekularen Vorgänge bei zellulären Membranen in verschiedenen biologischen Funktionen zu erhalten. Unser Ziel ist die Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzel-Molekül-Ebene, durch die Entwicklung von Analysewerkzeugen gewidmet Single-Particle Tracking (SPT) in hoher Dichte: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Einzel-Molekül-Videomikroskopie und bietet Millisekunde und Auflösung im Nanometerbereich 1-11, erlaubt eine detaillierte Darstellung der Membran Organisation von 12-14 genau Mapping-Deskriptoren wie Zell-Rezeptoren-Lokalisierung, Mobilität, Gefangenschaft oder Wechselwirkungen. Wir revisited SPT, sowohl experimentell als auch algorithmisch. Experimentelle Aspekte waren die Optimierung Setup-und Zell-Kennzeichnung, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Erreichen der höchstmöglichen Dichte Kennzeichnung, um eine dynamische Momentaufnahme der Molekulardynamik einen gebens tritt es innerhalb der Membran. Algorithmische Fragen betroffenen einzelnen Schritte für den Wiederaufbau von Flugbahnen verwendet: Spitzen-Erkennung, Einschätzung und der Wiederanschluss von speziellen Werkzeugen aus Bildanalyse 15,16 gerichtet. Implementieren von Deflation nach Entdeckung ermöglicht Rettung Gipfel zunächst von benachbarten, stärkeren Peaks versteckt. Zu beachten ist, wirkt sich direkt auf die Verbesserung der Erkennung Wiederverbindung, durch Reduzierung der Lücken innerhalb Flugbahnen. Vorstellungen wurden ausgewertet mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen für unterschiedliche Kennzeichnung Dichte und Noise-Werte, die in der Regel stellen die beiden wesentlichen Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung. Die Nanometergenauigkeit 17 für einzelne Moleküle erhalten, unter Verwendung von entweder aufeinanderfolgenden Ein / Aus Photoschalten oder der nichtlinearen Optik, liefern kann, flächendeckende Betrachtungen. Dies ist die Grundlage von Nanoskopiemethoden 17 wie Sturm 18, PALM 19,20, 21 oder RESOLFT STED 22,23, which erfordert häufig den Imaging-fixierten Proben. Die zentrale Aufgabe ist die Erkennung und Einschätzung der beugungsbegrenzten Spitzen ausgehend von Single-Moleküle. Daher angemessene Annahmen wie z. B. Umgang mit einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Bewegung, wird MTT unkompliziert für nanoskopische Analysen geeignet. Ferner kann MTT grundsätzlich in jedem Maßstab verwendet werden: nicht nur für Moleküle, sondern auch für Zellen oder Tiere, zum Beispiel. Daher ist ein leistungsfähiges MTT-Tracking-Algorithmus, der Anwendungen findet auf molekularer und zellulärer Skalen.

Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Unser Ziel ist es, eine umfassende Beschreibung molekularer Prozesse zu erhalten, die an Zellmembranen in verschiedenen biologischen Funktionen ablaufen. Wir streben eine Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzelmolekülebene an, indem wir Analysewerkzeuge entwickeln, die speziell für das Single-Particle Tracking (SPT) bei hoher Dichte konzipiert sind: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Die Einzelmolekül-Videomikroskopie, die eine Auflösung im Millisekunden- und Nanometerbereich bietet1-11, ermöglicht eine detaillierte Darstellung der Membranorganisation12-14 durch die präzise Kartierung von Deskriptoren wie der Lokalisation, Mobilität, dem Confinement oder Interaktionen von Zellrezeptoren. Wir haben das SPT sowohl experimentell als auch algorithmisch überarbeitet. Die experimentellen Aspekte umfassten die Optimierung des Setups und der Zellmarkierung, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Erreichung der höchstmöglichen Markierungsdichte, um eine dynamische Momentaufnahme der molekularen Dynamik zu liefern, wie sie innerhalb der Membran auftritt. Die algorithmischen Fragestellungen betrafen jeden Schritt zur Rekonstruktion der Trajektorien: Peak-Detektion, Schätzung und Rekonnektion, die mithilfe spezifischer Werkzeuge der Bildanalyse15,16 adressiert wurden. Die Implementierung einer Deflation nach der Detektion ermöglicht die Rettung von Peaks, die zunächst durch benachbarte, stärkere Peaks verdeckt waren. Bemerkenswert ist, dass die Verbesserung der Detektion direkte Auswirkungen auf die Rekonnektion hat, indem Lücken innerhalb der Trajektorien reduziert werden. Die Leistungsfähigkeit wurde mittels Monte-Carlo-Simulationen für verschiedene Markierungsdichten und Rauschwerte evaluiert, welche typischerweise die zwei größten Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher spatiotemporaler Auflösung darstellen. Die für Einzelmoleküle erreichte nanometrische Genauigkeit17, entweder durch sukzessives On/Off-Photoswitching oder nichtlineare Optik, kann erschöpfende Beobachtungen liefern. Dies ist die Grundlage von Nanoskopie-Methoden17 wie STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 oder STED22,23, die häufig die Bildgebung fixierter Proben erfordern. Die zentrale Aufgabe ist die Detektion und Schätzung von beugungsbegrenzten Peaks, die von Einzelmolekülen ausgehen. Daher ist MTT bei geeigneten Annahmen, wie beispielsweise der Verwendung einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Molekularbewegung, unmittelbar für nanoskopische Analysen geeignet. Darüber hinaus kann MTT grundsätzlich in jeder Größenordnung eingesetzt werden: nicht nur für Moleküle, sondern beispielsweise auch für Zellen oder Tiere. Folglich ist MTT ein leistungsstarker Tracking-Algorithmus, der Anwendungen auf molekularer und zellulärer Ebene findet.

Hallo. In diesem Video stellen wir ein vollständiges Experiment zur Einzelquanten-Verfolgung vor. Ein spezieller Algorithmus wurde in enger Zusammenarbeit mit Experten für Bildverarbeitung am ISIS vollständig konzipiert. In diesem Video verwenden wir den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor als Modell, um die Methode dieser Technik zu beschreiben.Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein Transmembranprotein. Dieser Rezeptor wird mithilfe eines monoklonalen Antikörpers markiert, der so reduziert wird, dass nur noch das A a B Fragment verbleibt. Das A a B Fragment wird biotinyliert und anschließend an das Streptavidin des Quantenpunkts gebunden, sodass das Wandsystem den EGF-Rezeptor gezielt erkennen kann.Unser Ziel ist es, einen umfassenden Überblick über die Dynamik von Zelloberflächenrezeptoren zu liefern. Tatsächlich können sich molekulare Trajektorien von der brownschen Diffusion dadurch unterscheiden, dass sie innerhalb von Nanodomänen eingeschränkt sind. Dies kann beispielsweise ein Hinweis auf eine zugrundeliegende Wechselwirkung mit Signalkomponenten oder molekularen Gerüsten sein.Wir zielen darauf ab, derartige Ereignisse umfassend zu beschreiben, indem wir sie über d

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Eine Methode zur Messung der Proteindiffusion in Membranen primärer Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wird beschrieben. In dieser Arbeit wird die Verwendung von Antikörpern für die Fluoreszenzmarkierung veranschaulicht.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein Protokoll zum Aufbau eines Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Mikroskops (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorzustellen.

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Lernen Sie Multiple-Target Tracing zur Kartierung molekularer Diffusion in der Plasmamembran. Dieser Algorithmus verfolgt einzelne Quantenpunkte in lebenden Zellen und liefert präzise Einblicke in Nanodynamik.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

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