Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Hi.In diesem Video stellen wir ein vollständiges einzelnes Quantenverfolgungsexperiment vor. Ein spezieller Algorithmus wurde vollständig in Zusammenarbeit mit Bild-ISIS-Experten entwickelt. In diesem Video werden wir den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor als Modell verwenden, um die Methode dieser Technik zu beschreiben.

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein Transmembranprotein. Dieser Rezeptor wird mit einem monoklonalen Antikörper markiert, der so reduziert wird, dass nur das A-B-Fragment übrig bleibt. Das A-B-Fragment wird biotinyliert, und danach erkennt das Wandsystem in Verbindung mit dem Streptavidin des Quantenpunkts den EGF-Rezeptor genau.

Unser Ziel ist es, einen umfassenden Überblick über die Dynamik der Zelloberflächenrezeptoren zu erhalten. Tatsächlich können molekulare Trajektorien von der Brotdiffusion abweichen, indem sie in Nanodomänen eingeschlossen sind. Zum Beispiel, und das kann die Signatur einer zugrundeliegenden Interaktion mit z.B. Signalpartnern oder molekularen Gerüsten sein.

Unser Ziel ist es, solche Ereignisse erschöpfend zu beschreiben, indem wir sie über die Zelle abbilden, was eine hohe zeitliche SPECT-Auflösung in Verbindung mit einer hohen Markierungsdichte erfordert. Daher nennen wir diesen Ansatz Multi-Targettracing. Der erste Schritt des Experiments ist die Vorbereitung der Probe.

Wir arbeiten an lebenden Zellen ohne Antibiotika. Hier verwenden wir kosten sieben Zellen, die endogen EGF-Rezeptoren exprimieren. Nach dem Ablösen der Zelle müssen wir genau bestätigen, um die gleiche Anzahl von Zellen in der Vertiefung des Labors zu haben.

Eine genaue Anzahl von Zellen ist sehr wichtig, um die Vorhersagbarkeit für die Anzahl der Quantenpunkte pro Zelle zu erhöhen. Nachdem Sie die Zelle in H dispensiert haben, müssen Sie das Labat 24 Stunden lang bei 37 Grad mit 7% CO2 inkubieren. Der nächste Schritt ist die Herstellung von Quantenpunkten, die an Antikörper gekoppelt sind. Quantenpunkte sind kleine fluoreszierende Nanopartikel.

Diese Partikel haben hier ein sehr großes Interesse, da sie im Vergleich zu klassischen Fluoreszenzsonden und -signalen sehr hell und stabil sind. Das Nasenverhältnis ist für diese Art von Experiment sehr wichtig. In diesem Fall verwenden wir ein vollständiges Medium, um die Streifeniden um die Quantenpunkte zu sättigen und eine Aggregation zu verhindern.

Danach hatten wir die Quantenpunkte im bioTE elated Protein oder Antikörper von Interesse mit einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um statistisch mehr monovalente Quantenpunkte zu erhalten. In diesem Experiment verwenden wir ein a b-Fragment gegen EGF-Rezeptoren, die im Labor aus monoklonalen Antikörpern hergestellt werden und gegen die Biotin gerichtet ist. Während der Inkubation von etwa 15 Minuten können Sie die Kontrolle mit einem Shaker bei 1.200 Umdrehungen pro Minute und zwei fünf Grad unter Aggregation und Homogenität halten.

Wenn die Mischung fertig ist, kannst du sie auf deine Zellen geben. Entfernen Sie das Medium sehr vorsichtig aus der Vertiefung, um eine Zellablösung auf dem Labortechniker zu verhindern, und fügen Sie die benötigte Menge an Mischung für Ihr Experiment hinzu. In diesem Fall fügen wir 100 Mikroliter Mischung pro Vertiefung hinzu.

Nach der Zugabe der Mischung können Sie Ihre Zelle 15 Minuten lang inkubieren. In diesem Fall bei 37 Grad mit 7% CO2. Nach dieser Inkubation können Sie eine hohe Anzahl häufiger Zwillingspunkte in Suspension auf dem Medium finden.

Diese Quantenpunkte sollten vor der Bildgebung entfernt werden. Wegen des Lärms, den wir mitbringen. Deshalb müssen wir uns jeden waschen, in diesem Fall mehrmals, fünfmal, um uns selbst zu waschen.

Verwenden Sie ein Bildgebungsmedium ohne Autofluoreszenz. Hier verwenden wir den HBSS-Puffer mit aps. Jetzt sind Ihre Zellen bereit.

Es ist Zeit, zum Setup für die Akquise zu gehen. Der Aufbau besteht aus vier Hauptteilen, einem inversen Mikroskop, einer Kamera mit Augenempfindlichkeit, einer leistungsstarken Quecksilberlampe und einem Inkubator, um die Zelle auf 37 Grad zu halten. Das Licht der Quecksilberlampe dringt durch eine Faser und durch ein Filterrad, bevor es die Probe beleuchtet.

Der Grippe-eSense der Probe wird von einer E-M-C-C-D-Kamera auf der linken Seite gefiltert und gesammelt. Wir verwenden derzeit 1,3 und 1,49 numerische Apertur für Ölhändler von Objektiven. Der zentrale Schritt dieses Experiments ist die Erfassung an sich.

Sobald die Zellen im Fokus sind, schauen wir uns eine repräsentative Zelle mit einer starken Markierung an. In Quantenpunkten nehmen wir zunächst ein einzelnes Bild im durchgelassenen weißen Licht auf, das weiter verwendet werden kann, um den Zellaspekt und die spezielle Grenze der LA-Podia zu überprüfen. Anschließend erfassen wir Videos in der Regel mit einer Rate von 36 Millisekunden, der schnellsten Rate, die im Vollbild zulässig ist.

Wir verwenden einen elektronenmultiplizierenden CCD, um eine Einzelmolekülempfindlichkeit mit einem ausreichenden Signal-Nord-Verhältnis von mindestens über 20 Dezibel zu erreichen. Normalerweise erreichen wir etwa 25 Dezibel, normalerweise erfassen wir 300 Bilder. Um ein bestimmtes Dataset auszuwerten, müssen Sie nur den Durchlauf für das Verzeichnis angeben, das die Videodateien enthält.

Wenn Sie dann den Befehl eingeben, wird der Text in MetLab oder dem Befehl MTT 23 I wiederhergestellt, der zunächst eine grafische Oberflächenauflistung anzeigt. Alle verwendeten Parameter starten die vollautomatische Analyse. Die Kern-MTT-Analyse wird über jeden Frame durchgeführt, wobei drei Hauptaufgaben aufgerufen werden: die erste Erkennung für jedes Pixel für das Vorhandensein oder Fehlen einer Zielquantenschuld.

Dann wird für jede Detektion eine Schätzung der relevanten Parameter des Ziels vorgenommen, wie z. B. die Pixelposition, die Signalintensität usw. Letzte erneute Verbindung der neuen Ziele. Mit den Kurven, die bereits über die vorherigen Frames für jedes Pixel erstellt wurden.

Unter Berücksichtigung einer lokalen Subregion vergleichen wir zwei Hypothesen, die entweder nur aus Rauschen oder aus einem Signal bestehen. Mit der Point-Spread-Funktion verfügt ModuLite über einen Hin-Peak. Wir verwenden einen Schwellenwert, der sicherstellt, dass Fehlalarme niedrig genug sind, mit weniger als einer Perus-Erkennung pro Frame für jedes erkannte Ziel.

Als nächstes führen wir einen kleinsten quadratischen Geisternährstoff durch, um die Position, Breite und Höhe des detektierten Goshen zu schätzen. Dies liefert insbesondere die Position der Spic-Zellen des Farbstoffs, typischerweise eine Genauigkeit von etwa 10 bis 20 Nanometern, denn typische Signal-Rausch-Verhältnisse bei Peaks mit hoher Dichte können oft zu geschlossen sein, und starke Peaks können die schwächsten Peaks daran hindern, damit umzugehen. Wir entleeren die erkannten Peaks aus dem anfänglich ausgeführten Bild.

Auch hier kann die Detektion auf dem Residuum in der Regel 10 % der Peaks verzerren. Das Erreichen einer nahezu erschöpfenden Detektion ist sehr fruchtbar für eine genaue Wiederverbindung. Dann wird der Satz neuer Ziele mit dem Satz früherer Kurven für diese Pupille abgeglichen.

Um jede Spur nach Möglichkeit einem Ziel zuzuordnen und mögliches Blinken zu behandeln, verwenden wir alle verfügbaren statistischen Informationen, die wir aus dem Erkennungsschritt erhalten. Daher werden Ziele nicht nur der nächstgelegenen Ablaufverfolgung zugewiesen. Im Falle von Konflikten, bei denen sich Spuren kreuzen können, d.h. sich die jeweils relevanten Forschungsbereiche überlappen, betrachten wir den statistischen Wert von Intensität, Geschwindigkeit, Breite und Blinken sowohl für die Spuren als auch für die Ziele.

Dies liefert den statistisch optimalen Reconnection-Score. Die Strategie ermöglicht es, wenn möglich zu vermeiden, die Wiederverbindung in Richtung der nächsten Nachbarn, d.h. der langsamsten Bewegung, zu verzerren. Als nächstes verwenden wir eine Funktion, um einen möglichen vorübergehenden Einschluss innerhalb der Trajektorien zu bewerten.

Diese Funktion steht in umgekehrtem Verhältnis zur lokalen Diffusion, wie sie von Sexton Simpson und Mitarbeitern festgestellt wurde. Das Anwenden eines Schwellenwerts ermöglicht es, begrenzte oder nicht begrenzte Episoden zu definieren. Durch die Iteration dieser Gesamtspuren können wir schließlich die Membrandynamik in Bezug auf vorübergehenden Einschluss und Verlangsamungsnachweis abbilden, und dies kann dargestellt werden.

Alternativ führt MTT bei Verwendung der binären oder diskreten Werte dieses Confinement-Index standardmäßig automatisch diese Aufgaben aus und speichert für jedes Video die Zeilenparameter für jeden Peak in einer eski-Datei und für weitere erweiterte Untersuchungen. Typische Ergebnisse wie die Karte der Spuren über jede Zelle und Diagramme von Histogrammen für interessierende Parameter, Spitzenintensitäten, Signal-Rausch-Verhältnis, lokale Mangelwerte, und so kann dieser Aspekt auch leicht an jede spezielle Untersuchung angepasst werden. In diesem Video werden nun typische Ergebnisse zusammengefasst, die mit MTT erzielt werden.

Ein wesentlicher Teil der Arbeit besteht in der Ausarbeitung des Algorithmus, der möglicherweise an dedizierte Untersuchungen wie die leidenden Bewegungsmodi oder Interaktionen angepasst werden muss. Das Ausführen von MTT ist jedoch sehr einfach. Nutzer sollten nur wenige Parameter wie die Platz- und Zeitbegrenzung optimieren.

Bei der Entwicklung von MTT haben wir uns zum Ziel gesetzt, die für jede Aufgabe verwendeten Analysemöglichkeiten völlig neu zu überdenken. Wir optimieren den Prozess entlang von zwei herausfordernden Achsen. Erstens, der Umgang mit hohen Dichten, um die besten speziellen Informationen über die Oberflächenoberfläche zu erhalten, und zweitens der Umgang mit schwachem SNR, der typischerweise das Arbeiten bei geringer Eliminierung und hoher Geschwindigkeit ermöglicht, kann als Signatur einer zugrunde liegenden Wechselwirkung interpretiert werden.

Membranrezeptoren können beispielsweise mit dem Submembran-Zytoskelett oder den Pro-Lipiddomänen interagieren. Solche Ereignisse können durch Variationen der Gefangenschaft in Raum und Zeit untersucht werden. Dynamische Maßnahmen können mit komplementären Ansätzen wie FRA, F, C oder Fracht verglichen werden.

Der Open-Source-Code steht für die akademische Forschung zur Verfügung. Es kann von unserer Webseite unter CML dot univ if an S fr auf unserer Teams-Seite heruntergeladen werden, die einen Link zum Download bietet. Auch interessierte Industrieunternehmen können sich gerne bei uns melden.

Wir bedanken uns besonders bei den Mitgliedern unseres Teams und der Gemeinschaftseinrichtungen für die Unterstützung und die fruchtbaren Gespräche. Dieses Projekt wird mit Mitteln des CNRS in c MAA University Pac Region National de La unterstützt, und Foundation Medical wird vom Controller der Liga unterstützt. Danke fürs Zuschauen.